水产品兽药残留检测技术概述

样品处理方法涉及的因素很多，操作复杂，方法灵活，直接影响各项分析指标、成本和效率，一般占70%的分析工作量。水产品兽药残留检测样品前处理技术常用的的提取取溶剂剂有乙乙腈，，甲醇醇，丙丙酮，，这些些溶剂剂与水水，稀稀酸，，稀碱碱的混混合溶溶剂如如乙腈腈-甲甲醇，，氯仿仿-甲甲醇，，乙腈腈-水水，或或酸化化，碱碱化等等。乙乙酸乙乙酯，，氯仿仿，二二氯甲甲烷，，乙醚醚和叔叔丁基基甲醚醚。叔叔丁基基甲醚醚可代代替卤卤代溶溶剂。。1、提提取溶溶剂的的选择择水产品品兽药药残留留检测测样品品前处处理技技术乙腈，，甲醇醇，丙丙酮与与样品品容易易结合合，溶溶剂化化作用用和渗渗透能能力强强，粘粘度小小，提提取速速度快快，能能使结结合态态的药药物释释放，，提取取的同同时脱脱蛋白白脱脂脂，PH值值可调调，待待测物物分布布均匀匀。但但提取取的杂杂质较较多，，进一一步萃萃取乳乳化严严重，，效果果相似似，甲甲醇提提取液液的杂杂质最最高。。“万万能溶溶剂””DMSO沸点点高极极少用用。在酯溶溶性的的残留留物中中，采采用非非水溶溶性极极性溶溶剂，，乙酸酸乙酯酯，氯氯仿，，二氯氯甲烷烷，乙乙醚。。加无水水硫酸酸钠，，盐析析提高高回收收率。。干样样（含含水小小10%））加水水增强强提取取。1、提提取溶溶剂的的选择择均浆提提取法法；震荡法法；索氏氏提取取法（（考虑虑热稳稳定性性，适适合水水分少少如饲饲料样样品，，水产产品组组织要要和海海砂或或无水水硫酸酸钠一一起研研磨成成干粉粉）；；超声波波提取取（SAE，，空化化作用用，增增加溶溶解，，时间间不能能长，，发热热）；；超临临界流流体萃萃取（（SFE）），强强化溶溶剂萃萃取（（ASE））和微微波辅辅助萃萃取（（MAE））2、提提取方方法水产品品兽药药残留留检测测样品品前处处理技技术超临界流流体密度度与液体体相似，，但是溶溶质在其其中的扩扩散系数数比液体体中大得得多。极性低的的碳氢化化合物，，醚，酯酯，环氧氧化合物物，可以以在低压压力下提提取（7-10MPa）进行行萃取，，羟基，，羧基难难萃取，，一个羧羧基和两两个羟基基的化合合物和三三个酚羟羟基的苯苯环衍生生物可以以被萃取取；40MPa以下下，糖和和氨基酸酸都不能能被萃取取；分级级极性差差异和挥挥发性差差异。2、提取取方法水产品兽兽药残留留检测样样品前处处理技术术超临界流流体萃取取仪—流流体源，，加压装装置，控控温装置置，萃取取容器，，节流装装置，收收集装置置。CO2作为流体体操作温温度低，，利于热热不稳定定的化合合物，组组分中不不含氧，，防止氧氧化。2、提取取方法水产品兽兽药残留留检测样样品前处处理技术术液-液萃萃取LLELLE利利用待测测组分与与样品杂杂质在互互不相溶溶的两相相中溶解解性差异异进行净净化。设设计的基基础为：：极性组组分与非非极性组组分；极极性物质质再分成成酸性，，中性，，碱性物物质。正正己烷（（石油醚醚）-乙乙腈；正正己烷-甲醇；；正己烷烷-丙酮酮；异辛辛烷-80%丙丙酮；氯氯仿-水水；乙酸酸乙酯-水。影响因素素：溶剂剂，PH值（磺磺胺，喹喹诺酮，，苯并米米唑类，，苯乙胺胺类等））3、净化化方法水产品兽兽药残留留检测样样品前处处理技术术液-液萃萃取操作作方法分液漏斗斗震荡，，漩涡萃萃取，逆逆流萃取取，特殊殊容器萃萃取。从水相中中提取药药物时溶溶剂中常常带如少少量的水水分，可可干扰固固相萃取取，延长长浓缩时时间和增增加杂质质，加无无水硫酸酸钠脱水水。高极极性的药药物在净净化中发发生吸附附，硅烷烷化玻璃璃器皿（（1%三三甲基氯氯硅烷的的甲苯溶溶液淌一一次，100℃℃下干燥燥30min））；加异异丙醇或或二乙胺胺也能降降低吸附附。3、净化化方法水产品兽兽药残留留检测样样品前处处理技术术固相萃取取（SPE）采用固相相萃取小小柱作为为分离媒媒介，小小柱中添添加了不不同填料料的固定定相，以以键合硅硅胶为基基质的C18、、NH2、COOH、、PSA、SAX等，，是硅胶胶的表面面活性大大为降低低，最大大程度的的降低了了极性化化合物的的不可吸吸附和拖拖尾，使使样品回回收率和和重现性性得到保保障；以以高分子子聚合物物为基质质的如PEP、、HXN、PAX、PCX等等，具有有高纯度度、高比比表面的的特点；；以吸附附型填料料为固定定相的如如硅酸镁镁、氧化化铝等，，主要通通过表面面的极性性吸附达达到分离离的目的的。因此此，固相萃取取法适用用于各种种极性的的化合物物3、净化化方法水产品兽兽药残留留检测样样品前处处理技术术固相萃取取（SPE）3、净化化方法水产品兽兽药残留留检测样样品前处处理技术术固相萃取取（SPE）操操作步骤骤：活化化，上样样，洗涤涤，洗脱脱。其他方法法固相微萃萃取：固固液吸附附平衡制备色谱谱法：制制备HPLC分分析激素素残留凝胶渗透透色谱法法：分子子筛作用用膜分离技技术：硝硝酸纤维维，醋酸酸纤维等等半透膜膜基质固相相分散技技术：样样品和填填料的比比例是1：4免疫亲和和色谱：：连接有有抗体的的惰性基基质做固固定相，，选择性性吸附。。分子印迹迹技术：：印迹聚聚合物，，塑料抗抗体3、净化化方法水产品兽兽药残留留检测样样品前处处理技术术旋转蒸发发：溶剂可回回收气流吹蒸蒸：少量溶剂剂K-D浓浓缩器：：浓缩，，回流，，洗涤，，定容真空离心心：热敏敏性组分分，粘稠稠液体再溶解使使用流动动相的初初始比例例作溶剂剂4、浓缩富集集及再溶溶解水产品兽兽药残留留检测样样品前处处理技术术步骤1.确立立质谱条条件2.建立立LC方方法3.内标标选择4.前处处理方法法选择建立液相相色谱串串联质谱谱定量分分析方法法文献检索索：了解解化合物物的性质质包括化化合物的的结构、、化合物物的极性性及化合合物的pKa值值。首先先了解化化合物的的结构，，可大概概的推断断其碎片片离子的的断裂方方式，选择较为为稳定的的碎片离离子作为为定量的的子离子子，也可以根根据经验验判断选选用哪种种离子源源更为合合适；根根据化合合物的极极性大小小，可以以选择一一种或几几种恰当当的溶剂剂作为溶溶媒，既既能保证证完全将将样品溶溶解，又又能提高高化合物物的质谱谱响应；；化合物物的pKa值，，有助于于选择流流动相的的添加剂剂及其pH值，，从而提提高质谱谱响应。。建立液质质定量分分析方法法建立液质质定量分分析方法法1.连接接管路2.选选择Q1MS扫扫描模式式和FullScan扫描描类型3.设设置离子子源参数数4.将流流动相导导入质谱谱仪，观观察到待待测化合合物的准准分子离离子峰峰峰强度在在10的的6次方方左右。。1、确立立质谱条条件（化化合物优优化）建立液质质定量分分析方法法5.选选择MSOnly优优化模式式和SyringePumpInfusion入口口类型选选项6.优化化TubeLensOffset、SprayVoltage、SheathGasPressure、、AuxGasPressure获得待测测化合物物稳定的的准分子子离子峰峰。7.选择MS+MS/MS优化模模式设置置ParentMass、、ChargeState和NumProduct对子离离子进行行优化。。8.MRM优优化模式式优化TubeLensOffset和CollisionPressure9.记录录并保存存子离子子全扫描描质谱图图。保存存TuneMethod文文件。1、确立立质谱条条件（化化合物优优化）建立液质质定量分分析方法法1、确立立质谱条条件（化化合物优优化）建立液质质定量分分析方法法1、确立立质谱条条件（化化合物优优化）建立液质质定量分分析方法法2、确立立LC条条件在液相-紫外检检测中，，使用的的添加剂剂的种类类繁多，，可以是是挥发性性的酸或或者碱（（如甲酸酸、乙酸酸和氨水水等），，也可以以是不易易挥发的的缓冲盐盐（如磷磷酸二氢氢钠-磷磷酸缓冲冲液、磷磷酸二氢氢钾-磷磷酸缓冲冲盐）。。但是在在液质分分析中，，基于质质谱检测测的原理理，我们们只能使使用可挥挥发的酸酸碱或缓缓冲盐，，那么种种类就会会受到极极大的限限制。在在日常分分析中使使用到的的添加剂剂主要有有甲酸、乙乙酸、三三氟乙酸酸、氨水水和甲酸酸铵、乙乙酸铵等等缓冲盐盐。三乙胺在紫外检检测中，，常作为为扫尾剂剂，但是是在液质质检测中中是绝对对禁止的的。因为为三乙胺胺进入质质谱后不不易清除除，残留留及其严严重，能能够抑制制离子的的响应。。在液相色色谱紫外外检测中中，要求求化合物物之间R≥1.5，进行行定量，，那R最最好≥2.0，，要求准准确的配配制流动动相，精精确的调调好流动动相的pH及添添加剂的的浓度。。但在液液质分析析中，我我们经常常使用多多反应监监测（MRM/SRM）对化化合物进进行定量量，由于于MRM要求选选择两次次离子，，因此它它具有很很高的专专属性，，基于这这点我们们对多个化化合物同同时进行行检测时时，不需需要彼此此间达到到完全分分离就可可以对他他们进行行定量分分析。建立液质质定量分分析方法法2、确立LC条件由于生物物样品中中含有大大量的基基质，这这些基质质的存在在会严重重的干扰扰和影响响化合物物的测定定，因而而我们需需要利用用色谱将将化合物物与基质质分开，，从而降降低基质质效应的的影响，，即降低低离子抑抑制。待测化合合物要在在色谱柱柱上有保保留，并并且适当当延长保保留时间间。三聚聚氰胺最最好用离离子柱。。建立液质质定量分分析方法法3、内标标选择内标工作作方式：：在每个样样品、标标准和空空白中加加入测定到每每个样品品中内标标的响应应根据实际际测定内内标响应应值与预预期内标标响应值值的比值值来校正正其他化化合物的的信号用分析信信号和内内标的比比作标准准曲线或或乘校正正因子或或除内标标回收率率计算未知知样品的的分析信信号和内内标的比比值并从从标准曲曲线中读读出信号号建立液质质定量分分析方法法3、内标标选择1.样品品中不存存在或者者可以忽忽略2.没有有受到质质谱干扰扰3.没有有对分析析对象产产生质谱谱干扰4.不容容易受到到环境污污染5.和分分析对象象质量数数接近（氘代物物）6.离解解方式和和分析对对象接近近建立液质质定量分分析方法法能力验证证经验及及基质效效应为什么要要采用LC-MS考核化合合物的含含量越来来越低基体越来来越复杂杂药残的能能力验证证建议的的第一方方法例如：干鱼粉中中的恩诺诺沙星和和环丙沙沙星鱼肉中的的氟苯尼尼考能力验证证经验及及基质效效应考核中的的质量控控制方法法控制样品品空白平行双样样测定或或三样加标回收收标准参考考物质的的同步分分析重复测定定和仪器器比对能力验证证经验及及基质效效应加标回收收：可分为前前处理加加标回收收和上机机加标标（单单点标准准加入））能力验证证经验及及基质效效应加标回收收：可分为前前处理加加标回收收和上机机加标标（单单点标准准加入））加标回收收接近100％％不能代代表考核核结果完完全准确确无误。。不能检查查标准物物质本身身所带来来的误差差；不能检查查加和性性干扰，，如污污染和质质谱干扰扰；能力验证证经验及及基质效效应标准参考考物质的的同步分分析：选择基体体和浓度度相似的的标准参参考物质质同步进进行分析析作用：标准是否否合格样品前处处理是否否合适测定中是是否存在在干扰目前药残残的标准准参考物物质很难难购买，，对于固固体的国国家一级级标准物物质，即即使不能能购得，，也要尽尽量收集集到证书书。能力验证证经验及及基质效效应其他质控控方法不同仪器器的比对对实验不同仪器器在一定定程度可可考察基基体和质质谱的干干扰状况况重复复分分析析和和人人员员比比对对实实验验尽量量消消除除过过失失误误差差和和随随机机误误差差以上上的的质质量量控控制制方方法法在在考考核核中中应应尽尽量量多多采采用用能力力验验证证经经验验及及基基质质效效应应考核核前前准准备备确认认色色谱谱柱柱柱柱效效各流流动动相相充充足足清洗洗锥锥口口重新新调调谐谐校校正正仪仪器器总之之就就是是使使仪仪器器处处于于良良好好状状态态能力力验验证证经经验验及及基基质质效效应应预试试验验稀释释到到一一定定(或或要要求求)的的倍倍数数后后测测定定稀释释成成多多种种稀稀释释倍倍数数有利利于于多多项项目目的的测测定定使浓浓度度在在标标准准曲曲线线的的中中间间点点有利利于于发发现现干干扰扰有利利于于防防止止污污染染能力力验验证证经经验验及及基基质质效效应应定容容要要考考虑虑溶溶剂剂的的匹匹配配。。测定定每每个个样样品品测测定定23次次，，同同时时分分析析标标准准参参加加物物质质并并分分析析加加标标样样品品。。数据据处处理理查看看校校准准曲曲线线是是否否符符合合要要求求确定定是是不不同同质质量量数数测测定定结结果果是是否否相相同同尽量量不不同同超超过过标标准准曲曲线线的的范范围围，，如如超超过过应应稀稀释释后后测测定定。。能力力验验证证经经验验及及基基质质效效应应基质质效效应应成成因因待测测组组分分与与基质质中中内内源源性性物物质质共共洗洗脱脱而引引起起的的色色谱谱柱柱超超载载所所致致，，这这些些成成分分常常因因在在色色谱谱分分析析中中与与目目标标化化合合物物分分离离不不完完全全或或未未被被检检测测到到而而进进入入质质谱谱后后产产生生基基质质效效应应。。待测测组组分分与与生生物物样样品品中中的的基基质质成成分分在雾雾滴滴表表面面离离子子化化过过程程中中的的竞竞争争。。由于于基基质质中中某某些些干干扰扰组组分分的的存存在在会会使使待待测测组组分分离离子子生生成成的的速速度度同同标标准准样样品品相相比比有有显显著著不不同同，，使使得得信信号号响响应应值值产产生生较较大大变变异异。。离子子的的有有效效淌淌度度受受到到周周围围离离子子的的影影响响，，由由其其周周围围离离子子所所形形成成的的包包围围圈圈，，称称为为离子子基基体体。如如果果样样品品组组分分从从进进样样点点到到探探测测点点迁迁移移过过程程中中，，在在某某一一时时间间间间隔隔遇遇上上一一个个不不同同组组成成的的基基体体区区带带，，这这个个离离子子基基体体区区带带就就将将对对样样品品组组分分产产生生影影响响，，使使它它们们的的淌淌度度发发生生瞬瞬时时变变化化，，从从而而选选择择性性地地影影响响溶溶质质的的迁迁移移和和分分离离，，这这就就是是瞬瞬时时离离子子基基体体效效应应。。分为为离离子子抑抑制制和和离离子子增增强强能力力验验证证经经验验及及基基质质效效应应基质质效效应应的的评评价价：：1.用用流流动动相相配配制制高高中中低低三三个个浓浓度度的的待待测测物物，，并并加入内标，测得响应应值。2.空白基基质提取后后加入相同同浓度的待待测物和内内标，测响响应值。基质效应=空白基基质响应值值/流动相相响应值××100％％这样不同浓浓度的待测测物的基质质