实验四凯氏定氮法测定蛋白质含量

关于实验四凯氏定氮法测定蛋白质含量第一页，共十六页，2022年，8月28日凯氏定氮法

是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准酸滴定，就可计算出样品中的氮量。由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法第二页，共十六页，2022年，8月28日【目的】

了解凯氏定氮法测定蛋白质含量的方法、意义及应用第三页，共十六页，2022年，8月28日【原理】

蛋白质是含氮的有机化合物。蛋白质与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算系数，即得蛋白质的含量。

第四页，共十六页，2022年，8月28日1.有机物中的铵根在强热和催化剂及浓H2SO4作用下，消化生成（NH4）2SO4，反应式为：2NH2+H2S04+2H+＝(NH4)2S04（其中CuSO4做催化剂）第五页，共十六页，2022年，8月28日2.在凯氏定氮仪器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3，收集于H3BO3溶液中，反应式为:

(NH4)2SO4+2NaOH＝2NH3↑+2H2O+Na2SO4

2NH3+4H3BO3＝(NH4)2B4O7+5H2O第六页，共十六页，2022年，8月28日3.用已知浓度的HCl标准溶液滴定，根据HCl消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算系数，即得蛋白质的含量，反应式为：

(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O＝2NH4Cl+4H3BO3第七页，共十六页，2022年，8月28日【操作步骤】基本步骤如下：取样→消化→蒸馏→滴定→计算

称取适量样品（约相当氮30mg～40mg）,移入干燥的消化管中，加入0.2g硫酸铜，6g硫酸钾及20ml浓硫酸，置于消化炉上小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全消失后，加大火力，并保持管内液体内微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续0.5h～1h。取下放冷待蒸馏用。（建议：消化炉温控时间及温度：1阶段选择温度范围280℃左右，时间为20分钟左右；2阶段选择温度范围450℃左右，待颜色变蓝绿色后继续加热0.5h～1h。1.样品消化第八页，共十六页，2022年，8月28日NaOH、H2O注入管口，用橡胶管套如后分别置于NaOH、H2O盛器桶内，加液时按面板上相应开关，液体经电磁泵自动流入消化管内，注入毫升数视标尺所注位置而定。2.蒸馏第九页，共十六页，2022年，8月28日蒸馏过程：（1）观察蒸发炉内水位，不能超过不锈钢电极（如果超过，要先排完水）。（2）关掉排水阀，打开加热电源，打开冷却水（自来水开关），打开绿色蒸汽开关（只需打开任意一组），然后，观察电流表；等电流表升到4A左右，关掉蒸汽开关。待其回到0A后再打开蒸汽开关。电流升到4A后再关掉，这样反复开关（0-10）左右直到蒸汽从塑料管内喷出，让其喷半分钟左右，关掉蒸汽开关，仪器进入正常的待机状态。第十页，共十六页，2022年，8月28日（3）250ml三角接收瓶中加入2%H3BO350ml和2~3滴混合指示剂，将接收瓶套在蒸馏器的接收管上，并且让管口浸没在H3BO3溶液中。第十一页，共十六页，2022年，8月28日（4）把需要蒸馏的消化管固定在蒸馏器托物架上，然后按面板上NaOH、H2O开关，分别向消化管注入蒸馏水（10ml左右）及NaOH溶液（硫酸用量的5倍,约100ml），然后开启蒸汽开关，向试管内注入蒸汽、进行蒸馏。待接收瓶内液面高于150ml时将接收瓶下移，使接收管离开液面、用少量H2O冲洗出气口，继续蒸馏半分钟，然后取下接收瓶，待滴定用。甲基红乙醇溶液和溴甲酚绿乙醇配溶液指示剂，颜色由酒红色变成绿色。第十二页，共十六页，2022年，8月28日用0.05mol/LHCl滴定接收瓶内的溶液，滴定至(暗)灰色时为止，记下消耗HCL的毫升数。3.滴定第十三页，共十六页，2022年，8月28日按下列式子计算蛋白含量：X—样品中蛋白质的含量，%V1—样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml；V2—试剂空白消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml；N—硫酸或盐酸标准溶液当量浓度；0.014—1N硫酸或盐酸标准溶液1ml相当于氮克数；m—样品的质量（体积），g（ml）；F—蛋白质系数，按16%计算乘以6.25即为蛋白质。

【结果及计算】蛋白质X%＝式中：第十四页，共十六页，2022