植物组织培养和生物反应器课件

红豆杉细胞培养生产紫杉醇BY孔华庭红豆杉细胞培养生产紫杉醇BY孔华庭1通常认为世界上红豆杉属植物有11种，中国有4种和1变种，分别是中国红豆杉，西藏红豆杉或喜飞拉雅红豆杉、云南红豆杉，东北红豆杉和南方红豆杉。紫杉醉是一种四环二路的化合物，经过x、n与n期临床试验己证实是一种良好的抗癌药物，但该化合物在红豆杉植物中含量极低，约为0.01％，并且提取困难；此外，该化合物不溶于水及在临床应用中亦有较大毒性，因而限制了其广泛应用。为解决以上问题，人们对紫杉酵的化学性质，特别是其结构与功能的关系进行了广泛深人的研究，并取得了重大进展。了解紫杉醉的化学结构与抗癌活性的关系，可为解决资源短缺、增加此种化合物来源和寻找高效低毒的新紫杉露类似物提供理论依据，并可研制出一些同位京标记的策杉醉类似物用于检测紫杉醉的生物学活性。通常认为世界上红豆杉属植物有11种，中国有4种和1变种，分别2

按美国国立癌症研究所制订的抗肿瘤休外和体内筛选方案，对紫杉醉的抗肿瘤活性进行了试验，在离体培养的细胞中加入2.5mmol/L紫杉醇可抑制Hela细胞生长；对KB细胞和L1210集落形成的抑制强度超过长春碱与秋水仙碱。。。。。紫杉醇抗癌效果十分显著！按美国国立癌症研究所制订的抗肿瘤休外和体内筛选方案，对3紫杉醇的抗癌机理

紫杉醇是一种抗微管药物，为细胞有丝分裂抑制剂或纺锤体毒物。这种作用对于迅速分裂的肿瘤细胞，可以导致肿瘤细胞在有丝分裂时，不能形成纺锤体和纺锤丝，抑制细胞分裂和增殖，使肿瘤细胞停止在G2期和M期，直到死亡。体外研究证明，紫杉醉以浓度依赖性方式可逆地结合到N端微管蛋白的p亚单位上，增加聚合的速率和产量。紫杉醉能抑制有丝分裂时所必需的微管网的正常再生，防止纺锤体形成，导致染色体的断裂并抑制细胞复制和移行。作用比较复杂，有多种因素紫杉醇的抗癌机理紫杉醇是一种抗微管药物，为细胞有丝分裂4天然提取紫杉醇

紫杉醇最早是从太平洋红豆杉的树皮中提取的，后来人们对其他红豆杉属植物的各部位包括针叶、嫩枝、树皮及心材中的紫杉醉含量进行了分析，发现树皮巾含量最局，枝叶次之，心材最低。因此从针叶中提取紫杉醉引起人们足够的重视。即使针阶中紫杉醇含量稍低但其产量与树皮相当，因针叶的总量是树皮的2—4倍，而且针叶的再生力强，采集后对树的生命无太大的影响，不会造成生态环境的破坏。由于多种红豆杉桓株的小枝及针叶中紫杉醇含量与树皮相近，因此可采用人工培栽大量的红豆杉桓株，利用从这些栽培植抹上馅剪下的小枝条及针叶提取紫杉醇。从人工栽培植袜的小枝条与针叶中提取紫杉醇可能是获取紫杉醉最便宜的途径，其缺点是人工栽培需时较长，并且受到土地及地理条件等限制。天然提取紫杉醇紫杉醇最早是从太平洋红豆杉的树皮中提取的5红豆杉愈伤组织诱导植物体是一个有复杂结构的多细胞系统，植物体中的不同组织及组成组织的不同细胞，均是以高度的协调方式在发挥作用。一个有结构的器官或组织，如根、茎或叶等，将它与母体分离及培养在含有适当激素的培养基里时，就可能转变为一种能迅速增殖的细胞团，即愈伤组织。红豆杉愈伤组织诱导植物体是一个有复杂结构的多细胞系统，6影响愈伤组织诱导的因素

因素一：外植体的选择。目前几乎已从所有红豆杉中诱导出愈伤组织。大量实验结果表明，幼茎是最合适的外植体。大部分愈伤组织呈浅黄色，易碎。从红豆杉的针叶也可诱导出愈伤组织，但生长速度在早期较坦，这可能与针叶中相对较小比例的分生组织和薄型组织有关，其他几种红豆杉中诱导愈伤组织的实验也都表明，幼茎是诱导愈伤组织最合适的外植体。影响愈伤组织诱导的因素因素一：外植体的选择。目前几乎已7

因素二：植物生长调节物质。激素成分的加入对愈伤组织的诱导极为重要。在通常情况下，生长素和细胞分裂素对保持愈伤组织的高速生长是必需的，特别是当细胞分裂素与生长素联合应用时，能更强烈地刺激愈伤组织的形成，最常使用的生长京是IAA、NAA和2，4—D，最常用的细胞分裂素是激动素(KT)和六苄氨基嘌呤(6BA)。因素二：植物生长调节物质。激素成分的加入对愈伤组织的8因素三：诱导条件。在红豆杉的组织培养中，适宜于诱导愈伤组织的温度为20℃一26‘c。愈伤组织在黑暗和光照下都可被诱导，但光照下诱导率低，形成量少。因素三：诱导条件。在红豆杉的组织培养中，适宜于诱导愈伤9红豆杉愈伤组织诱导培养基的优化有研究者曾把愈伤组织状态的变化明确地列成数轴表示，数轴上标记的是典型的不同类型的愈伤组织任何愈伤组织类型基本上都可以在数轴上找到相应的位置。组织培养实际上就是按需要调控这些类型的愈伤组织间的相互转化。Se是指细胞处在胚性状态时的值，高于它时愈伤组织就会旺长，低于它时就会分化。从大量培养来讲，se值高时细胞分裂快、生长好，低时则产生次生代谢物的能力强。因为任何培养物按其主要特征都可以在图3—2所示的数轴上找到位置，所以无论对所培养的组织细胞是否熟悉，无论所选的培养基是否合适，理论上按照模型和对外界因子(植物激素、氮源、无机离子及维生素、碳源、渗透压、物理因素)的认识都可对培养物进行调控，使之朝所需方向或位置移动。红豆杉愈伤组织诱导培养基的优化有研究者曾把愈伤组织状10

试验中，通过状态调控把琉松愈伤组织转变为致密愈伤组织颗粒，转变后的愈伤组织内部有一定程度的分化，如管状分子的出现，每个颗粒可看作是一个有机整体，这些类似于有机体的颗粒中的分化结构可能为营养和代谢物质的输送提供通道，而且这种有效的物质传递通道不同于人工固定化的植物细胞颗粒，它只在具有一定结构的植物组织中存在。因此，致密愈伤组织颗粒能积累较多的次生代谢产物紫杉醇。试验中，通过状态调控把琉松愈伤组织转变为致密愈伤组织颗11添加抗褐变剂在红豆杉愈伤组织诱导及继代培养过程中，常常会发生细胞褐变的现象，轻者影响细胞生长和繁殖，重则导致细胞死亡。如何减轻或控制褐变的发生，是红豆杉组织培养中重要的研究内容。红豆杉培养细胞发生褐变的原因复杂，与材料的基因型和生理状态、培养基成分和激累配比等因素有关。因此，要防止褐变发生，减轻褐变危害，除了要选择合适的外植体、培养基和适宜的激家组合外，添加抗褐变剂是较为方便有效的常规手段。添加抗褐变剂在红豆杉愈伤组织诱导及继代培养过程中，常12活性炭（AC）水解乳蛋白（LH）植酸（PA）不一一列举！活性炭（AC）不一一列举！13高产细胞系的建立适宜工业化生产的细胞系条件：一是分散性好，适于工业化操作；二是均一性好，细胞形状大小大致相同．甚至在生理生化状态上同步；三是生长迅速；四是细胞中次生产物含量高；五是细胞生长和次生产物合成能力稳定。高产细胞系的建立适宜工业化生产的细胞系条件：一是分散性好，适14技术路线技术路线15高产细胞系筛选高产细胞系筛选16种质的保存超低温冷冻保存：优良细胞系能够得以长期稳定保存的重要保证。种质的保存超低温冷冻保存：优良细胞系能够得以长期稳定保存的重17培养基建立培养基优化培养基建立18细胞代谢产生紫杉醇细胞代谢产生紫杉醇19OVER!OVER!20生物反应器生物反应器技术是植物组织或器官培养生产次生代谢产物走向工业化和产业化的关键技术。生物反应器首先在发酵工业中得到应用。发酵工业中使用的生物反应器，实际上是发酵罐。另一种是以固定化酶或固定化细胞为催化剂的酶反应器。生物反应器生物反应器技术是植物组织或器官培养生产次生代谢产物21生物反应器培养毛状根次生代谢产物

以刘春朝等人采用生物反应器培养青蒿毛状根生产青蒿素为例介绍下生物反应器的植物组织与器官培养技术以其应用。生物反应器培养毛状根次生代谢产物以刘春朝等人采用生物反应器22毛状根培养物生长速度快、分支多、生理生化特征稳定，具有较稳定的次生代谢产物合成能力。毛状跟外形像毛发，交织缠绕。毛状根培养物生长速度快、分支多、生理生化特征稳定，具有较稳定23青蒿素是一种含过氧基团的倍半萜内酯，对脑型疟疾、抗氯喹性疟疾具有很好的疗效，具有高效、低毒的特点。目前，世界上青蒿素要去主要从天然青蒿中提取，青蒿产量低，成本高，难以满足市场需要。人工合成难度大，成本高，也难以推广。青蒿素是一种含过氧基团的倍半萜内酯，对脑型疟疾、抗氯喹性疟疾24雾化生物反应器培养雾化设备与培养装置一体化设计雾化设备与培养装置分开设计雾化生物反应器培养雾化设备与培养装置一体化设计25在培养液上设置单层板，距离液面较近，以使雾化后的营养雾能快速地与培养物接触。此类反应器的起雾高度低，难以进行多次培养，反应器的空间利用率低，目前仅适合于实验室进行植物组织的生理生化特性研究。在培养液上设置单层板，距离液面较近，以使雾化后的营养雾能快速26

利用气体将营养雾从雾化装置带入培养装置，该类型结构较复杂，而且存在营养雾损失问题。取青蒿毛状根的根尖20~30mm于MS固体培养基进行继代培养，筛选出生长旺盛、分支多且细长的毛状根进行液体震荡培养，培养条件为25度、12h/12h的光暗周期照射，转速120~130r/min。10天后，将其接种于反应器中的筛网上进行雾化培养。经20天分批培养，可以获得生物量10.3g/L，青蒿素产量达179.1mg/L，在毛状根中含量为1.74%，高于摇瓶培养分批30天所得的含量。利用气体将营养雾从雾化装置带入培养装置，该类型结构27流化床生物反应器培养青蒿青蒿毛状根的前培养与雾化生物反应器相同。接种毛状根于筛网之间，由于筛网的隔离作用，毛状根有的附着在筛网上，有的在层间随气流混合而运动。由于混合和供氧充分，毛状根的延伸生长及分支产生较快，生长方向沿着气液流动方向，而且生长过程中各层的生长速度较一致。培养20天，毛状根长满整个反应器。生物量达21.3g/L，青蒿素浓度为349.8mg/L，占毛状根的1.6%。流化床生物反应器培养青蒿青蒿毛状根的前培养与雾化生物反应器相28生物反应器大规模繁殖脱毒植物培养脱毒植物的传统方法操作繁琐，劳动力消耗大，培养条件不易控制等不足，而生物反应器培养技术的建立将为脱毒繁殖的放大和最终走向产业化奠定基础。赫震龙等人利用生物反应器培养脱毒马铃薯生物反应器大规模繁殖脱毒植物培养脱毒植物的传统方法操作繁琐，29材料与培养基将马铃薯脱毒苗切成小段后在固体的苗繁殖培养基（添加30g/L蔗糖的MS培养基、Ph5.8)上继代培养3~4周。微型马铃薯诱导培养基为添加了10mg/L的BA和80mg/L的蔗糖的MS培养基。用于继代培养和对照培养的固体培养基另外附加6g/L的琼脂。培养基调节Ph5.8后高压蒸汽灭菌。材料与培养基30雾化生物反应器培养切成单节间茎段作为外植体，均匀接种于雾化培养器中。培养基为液体的苗繁殖培养基，25度、5min/2h、2000lx以12h/天光照、通气量200ml/min条件下培养10天。然后更换培养液为微型薯诱导培养基（含10mg/L的BA和80g/L蔗糖的MS培养基、pH5.8），在18~20度、黑暗条件下培养30天，其他条件不变。不久就可以观察到苗上的顶芽或腋芽形成微型薯。雾化生物反应器培养31

与固体培养基相比，雾化生物反应器培养更有利于营养物质的运输、扩散和吸收，既可避免使用液体培养基基因浸没造成的玻璃化现象和对气体吸收不利影响，又可以克服固体培养基不利于营养物质扩散的缺陷，效率明显提高，因此培养效果优于液体培养与固体培养。雾化生物反应器的优点与固体培养基相比，雾化生物反应器培养更有利于营养物质的32THANKYOU!!THANKYOU!!33红豆杉细胞培养生产紫杉醇BY孔华庭红豆杉细胞培养生产紫杉醇BY孔华庭34通常认为世界上红豆杉属植物有11种，中国有4种和1变种，分别是中国红豆杉，西藏红豆杉或喜飞拉雅红豆杉、云南红豆杉，东北红豆杉和南方红豆杉。紫杉醉是一种四环二路的化合物，经过x、n与n期临床试验己证实是一种良好的抗癌药物，但该化合物在红豆杉植物中含量极低，约为0.01％，并且提取困难；此外，该化合物不溶于水及在临床应用中亦有较大毒性，因而限制了其广泛应用。为解决以上问题，人们对紫杉酵的化学性质，特别是其结构与功能的关系进行了广泛深人的研究，并取得了重大进展。了解紫杉醉的化学结构与抗癌活性的关系，可为解决资源短缺、增加此种化合物来源和寻找高效低毒的新紫杉露类似物提供理论依据，并可研制出一些同位京标记的策杉醉类似物用于检测紫杉醉的生物学活性。通常认为世界上红豆杉属植物有11种，中国有4种和1变种，分别35

按美国国立癌症研究所制订的抗肿瘤休外和体内筛选方案，对紫杉醉的抗肿瘤活性进行了试验，在离体培养的细胞中加入2.5mmol/L紫杉醇可抑制Hela细胞生长；对KB细胞和L1210集落形成的抑制强度超过长春碱与秋水仙碱。。。。。紫杉醇抗癌效果十分显著！按美国国立癌症研究所制订的抗肿瘤休外和体内筛选方案，对36紫杉醇的抗癌机理

紫杉醇是一种抗微管药物，为细胞有丝分裂抑制剂或纺锤体毒物。这种作用对于迅速分裂的肿瘤细胞，可以导致肿瘤细胞在有丝分裂时，不能形成纺锤体和纺锤丝，抑制细胞分裂和增殖，使肿瘤细胞停止在G2期和M期，直到死亡。体外研究证明，紫杉醉以浓度依赖性方式可逆地结合到N端微管蛋白的p亚单位上，增加聚合的速率和产量。紫杉醉能抑制有丝分裂时所必需的微管网的正常再生，防止纺锤体形成，导致染色体的断裂并抑制细胞复制和移行。作用比较复杂，有多种因素紫杉醇的抗癌机理紫杉醇是一种抗微管药物，为细胞有丝分裂37天然提取紫杉醇

紫杉醇最早是从太平洋红豆杉的树皮中提取的，后来人们对其他红豆杉属植物的各部位包括针叶、嫩枝、树皮及心材中的紫杉醉含量进行了分析，发现树皮巾含量最局，枝叶次之，心材最低。因此从针叶中提取紫杉醉引起人们足够的重视。即使针阶中紫杉醇含量稍低但其产量与树皮相当，因针叶的总量是树皮的2—4倍，而且针叶的再生力强，采集后对树的生命无太大的影响，不会造成生态环境的破坏。由于多种红豆杉桓株的小枝及针叶中紫杉醇含量与树皮相近，因此可采用人工培栽大量的红豆杉桓株，利用从这些栽培植抹上馅剪下的小枝条及针叶提取紫杉醇。从人工栽培植袜的小枝条与针叶中提取紫杉醇可能是获取紫杉醉最便宜的途径，其缺点是人工栽培需时较长，并且受到土地及地理条件等限制。天然提取紫杉醇紫杉醇最早是从太平洋红豆杉的树皮中提取的38红豆杉愈伤组织诱导植物体是一个有复杂结构的多细胞系统，植物体中的不同组织及组成组织的不同细胞，均是以高度的协调方式在发挥作用。一个有结构的器官或组织，如根、茎或叶等，将它与母体分离及培养在含有适当激素的培养基里时，就可能转变为一种能迅速增殖的细胞团，即愈伤组织。红豆杉愈伤组织诱导植物体是一个有复杂结构的多细胞系统，39影响愈伤组织诱导的因素

因素一：外植体的选择。目前几乎已从所有红豆杉中诱导出愈伤组织。大量实验结果表明，幼茎是最合适的外植体。大部分愈伤组织呈浅黄色，易碎。从红豆杉的针叶也可诱导出愈伤组织，但生长速度在早期较坦，这可能与针叶中相对较小比例的分生组织和薄型组织有关，其他几种红豆杉中诱导愈伤组织的实验也都表明，幼茎是诱导愈伤组织最合适的外植体。影响愈伤组织诱导的因素因素一：外植体的选择。目前几乎已40

因素二：植物生长调节物质。激素成分的加入对愈伤组织的诱导极为重要。在通常情况下，生长素和细胞分裂素对保持愈伤组织的高速生长是必需的，特别是当细胞分裂素与生长素联合应用时，能更强烈地刺激愈伤组织的形成，最常使用的生长京是IAA、NAA和2，4—D，最常用的细胞分裂素是激动素(KT)和六苄氨基嘌呤(6BA)。因素二：植物生长调节物质。激素成分的加入对愈伤组织的41因素三：诱导条件。在红豆杉的组织培养中，适宜于诱导愈伤组织的温度为20℃一26‘c。愈伤组织在黑暗和光照下都可被诱导，但光照下诱导率低，形成量少。因素三：诱导条件。在红豆杉的组织培养中，适宜于诱导愈伤42红豆杉愈伤组织诱导培养基的优化有研究者曾把愈伤组织状态的变化明确地列成数轴表示，数轴上标记的是典型的不同类型的愈伤组织任何愈伤组织类型基本上都可以在数轴上找到相应的位置。组织培养实际上就是按需要调控这些类型的愈伤组织间的相互转化。Se是指细胞处在胚性状态时的值，高于它时愈伤组织就会旺长，低于它时就会分化。从大量培养来讲，se值高时细胞分裂快、生长好，低时则产生次生代谢物的能力强。因为任何培养物按其主要特征都可以在图3—2所示的数轴上找到位置，所以无论对所培养的组织细胞是否熟悉，无论所选的培养基是否合适，理论上按照模型和对外界因子(植物激素、氮源、无机离子及维生素、碳源、渗透压、物理因素)的认识都可对培养物进行调控，使之朝所需方向或位置移动。红豆杉愈伤组织诱导培养基的优化有研究者曾把愈伤组织状43

试验中，通过状态调控把琉松愈伤组织转变为致密愈伤组织颗粒，转变后的愈伤组织内部有一定程度的分化，如管状分子的出现，每个颗粒可看作是一个有机整体，这些类似于有机体的颗粒中的分化结构可能为营养和代谢物质的输送提供通道，而且这种有效的物质传递通道不同于人工固定化的植物细胞颗粒，它只在具有一定结构的植物组织中存在。因此，致密愈伤组织颗粒能积累较多的次生代谢产物紫杉醇。试验中，通过状态调控把琉松愈伤组织转变为致密愈伤组织颗44添加抗褐变剂在红豆杉愈伤组织诱导及继代培养过程中，常常会发生细胞褐变的现象，轻者影响细胞生长和繁殖，重则导致细胞死亡。如何减轻或控制褐变的发生，是红豆杉组织培养中重要的研究内容。红豆杉培养细胞发生褐变的原因复杂，与材料的基因型和生理状态、培养基成分和激累配比等因素有关。因此，要防止褐变发生，减轻褐变危害，除了要选择合适的外植体、培养基和适宜的激家组合外，添加抗褐变剂是较为方便有效的常规手段。添加抗褐变剂在红豆杉愈伤组织诱导及继代培养过程中，常45活性炭（AC）水解乳蛋白（LH）植酸（PA）不一一列举！活性炭（AC）不一一列举！46高产细胞系的建立适宜工业化生产的细胞系条件：一是分散性好，适于工业化操作；二是均一性好，细胞形状大小大致相同．甚至在生理生化状态上同步；三是生长迅速；四是细胞中次生产物含量高；五是细胞生长和次生产物合成能力稳定。高产细胞系的建立适宜工业化生产的细胞系条件：一是分散性好，适47技术路线技术路线48高产细胞系筛选高产细胞系筛选49种质的保存超低温冷冻保存：优良细胞系能够得以长期稳定保存的重要保证。种质的保存超低温冷冻保存：优良细胞系能够得以长期稳定保存的重50培养基建立培养基优化培养基建立51细胞代谢产生紫杉醇细胞代谢产生紫杉醇52OVER!OVER!53生物反应器生物反应器技术是植物组织或器官培养生产次生代谢产物走向工业化和产业化的关键技术。生物反应器首先在发酵工业中得到应用。发酵工业中使用的生物反应器，实际上是发酵罐。另一种是以固定化酶或固定化细胞为催化剂的酶反应器。生物反应器生物反应器技术是植物组织或器官培养生产次生代谢产物54生物反应器培养毛状根次生代谢产物

以刘春朝等人采用生物反应器培养青蒿毛状根生产青蒿素为例介绍下生物反应器的植物组织与器官培养技术以其应用。生物反应器培养毛状根次生代谢产物以刘春朝等人采用生物反应器55毛状根培养物生长速度快、分支多、生理生化特征稳定，具有较稳定的次生代谢产物合成能力。毛状跟外形像毛发，交织缠绕。毛状根培养物生长速度快、分支多、生理生化特征稳定，具有较稳定56青蒿素是一种含过氧基团的倍半萜内酯，对脑型疟疾、抗氯喹性疟疾具有很好的疗效，具有高效、低毒的特点。目前，世界上青蒿素要去主要从天然青蒿中提取，青蒿产量低，成本高，难以满足市场需要。人工合成难度大，成本高，也难以推广。青蒿素是一种含过氧基团的倍半萜内酯，对脑型疟疾、抗氯喹性疟疾57雾化生物反应器培养雾化设备与培养装置一体化设计雾化设备与培养装置分开设计雾化生物反应器培养雾化设备与培养装置一体化设计58在培养液上设置单层板，距离液面较近，以使雾化后的营养雾能快速地与培养物接触。此类反应器的起雾高度低，难以进行多次培养，反应器的空间利用率低，目前仅适合于实验室进行植物组织的生理生化特性研究。在培养液上设置单层板，距离液面较近，以使雾化后的营养雾能快速59

利用气体将营养雾从雾化装置带入培养装置，该类型结构较复杂，而且存在营养雾损失问题。取青蒿毛状根的根尖20~30mm于MS固体培养基进行继代培养，筛选出生长旺盛、分支多且细长的毛状根进行液体震荡培养，培养条件为25度、12h/12h的光暗周期照射，转速120~130r/min。10天后，将其接种于反应器中的筛网上进行雾化培养。经20天分批培养，可以获得生物量10.3g/L，青蒿素产量达179.1mg/L，在毛状根中含量为1.74%，