药物分析-体内样品分析的前处理课件

第二节

体内样品分析的前处理

体内样品预处理的目的1常用体内样品预处理方法2

前处理(分离,浓集,改性)为药物的测定提供条件

前处理是体内药物分析过程中重要且繁复的工作第二节

体内样品分析的前处理体内样品预处理的目的1常用体内1仪器污染,劣化(去蛋白)提高测定灵敏度/选择性化学改性(衍生化)

血浆蛋白结合物;缀合物使待测药物/代谢物释放测定药物/代谢物总浓度

1.使待测组分游离

2.满足测定方法的要求

3.改善分析环境

一、体内样品前处理的目的样品介质组成复杂:分离待测组分浓度低:浓集

前处理仪器污染,劣化(去蛋白)血浆蛋白结合物;缀合物1.使待测组2二、体内样品前处理的方法

去除蛋白质法分离与浓集法缀合物水解法

(一)(二)(三)化学衍生化法

(四)二、体内样品前处理的方法去除蛋白质法分离与浓集法缀合3(一)去除蛋白质法加入与水混溶的有机溶剂,蛋白析出→药物释放乙腈,甲醇,丙酮,四氢呋喃等血浆/血清与有机溶剂的体积比1∶(2-3)饱和硫酸铵,硫酸钠,硫酸镁,氯化钠等血清与饱和硫酸铵溶液的比1∶210%三氯醋酸或6%高氯酸溶液血清与强酸的比1∶0.6上清液呈强酸性(pH≤4)酸性分解的药物不宜用热变性蛋白质沉淀通常90℃方法简单只能除去热变性蛋白待测物热稳定性好

1.溶剂沉淀法2.中性盐析法3.强酸沉淀法4.热凝固法(一)去除蛋白质法加入与水混溶的有机溶剂,蛋白析出→药物4(二)分离与浓集法液相萃取法固相萃取法超滤法1.2.3.(二)分离与浓集法液相萃取法固相萃取法超滤法1.2.3.5(二)分离与浓集法液相萃取法固相萃取法超滤法1.2.3.(二)分离与浓集法液相萃取法固相萃取法超滤法1.2.3.61.液相萃取法溶剂的选择原则溶剂的用量水相的pH(1)(2)(3)提取操作(4)1.液相萃取法溶剂的选择原则溶剂的用量水相的pH(1)7(1)溶剂的选取原则①对药物分子未电离形式可溶,对电离形式不溶；②沸点低,易挥发;③与水不相混溶;④无毒,不易燃烧;⑤具有化学稳定和惰性;⑥不影响紫外检测

溶剂紫外截止波长(nm)沸点(℃)↓极性增加↓正己烷21069环己烷21081甲苯285111异丙醚*22068乙醚*22035醋酸戊酯285149三氯甲烷24561甲基异丁基酮230116醋酸乙酯26077正丁醇215118*:含过氧化物；:肝脏毒性,有致癌作用①辅助试剂的使用乙醚(1.2%水):氯化钠②混合溶剂的使用正己烷-异丙醇(95:5)(1)溶剂的选取原则①对药物分子未电离形式可溶,对电离形8(2)溶剂的用量有机相与水相(样品)体积比为1:1~5:1碱性药物pH高于pKa1~2单位酸性药物pH低于pKa1~2单位碱性下提取,可减少内源性物质(酸性)的干扰碱性下不稳定,在中性用三氯甲烷和异丙醇提取(3)水相的pH提取1次若提取回收率较低(低于50%),提取2~3次脂溶性干扰物,可进行小体积水溶液反提取

(4)提取操作

(2)溶剂的用量有机相与水相(样品)体积比为1:1~5:192.固相萃取法固相萃取法的原理

固相萃取法操作步骤

注意事项

(1)(2)(3)固相萃取法的特点

(4)自动化固相萃取

(5)2.固相萃取法固相萃取法的原理固相萃取法操作步骤注意事10(1)固相萃取法的原理 含药物体内样品通过小柱时,受到“吸附”,“分配”,“离子交换”或其它亲和力作用,药物及内源性物质同时被保留在固定相(填料) 洗脱方式有两种:①冲洗溶剂洗去干扰物,再用对药物亲和力更强的溶剂洗脱药物;②药物直接被洗脱,干扰物保留(1)固相萃取法的原理 含药物体内样品通过小柱时,受到11(2)固相萃取法操作步骤

第1步:甲醇润湿小柱,活化填料;净化填料

第2步:水/缓冲液冲洗小柱,去除甲醇;甲醇含量过低(低于5%)致C18链弯曲折叠,回收率降低

第3步:加样,使样品通过小柱,并弃去滤过液

第4步:水/缓冲液冲洗小柱,去除内源性及其它干扰物质第5步:洗脱溶剂洗脱待测物,收集洗脱液,平衡(2)固相萃取法操作步骤第1步:甲醇润湿小柱,活化填12(3)注意事项①样品(血浆)通过萃取柱的流速在1-2ml/min;②冲洗液和洗脱剂的强度与用量适当,否则导致药物损失/选择性下降,通常选用可与水混溶的洗脱剂;③萃取碱性药物时,洗脱剂中常加酸,有机胺,氨水,醋酸铵或离子对试剂(3)注意事项①样品(血浆)通过萃取柱的流速在13(4)自动化固相萃取法对于单个样品处理,SPE操作省时对于大量样品的处理半自动SPE:萃取过程机械化全自动化仪器:通过柱切换技术实现固相萃取与HPLC联用(4)自动化固相萃取法对于单个样品处理,SPE操作省时14柱切换:固相萃取-LC/MS/MS(5)自动化固相萃取法柱切换:固相萃取-LC/MS/MS(5)自动化固相萃取法153.超滤法ultrafiltration是一种膜分离技术按照截留分子量,选择半透膜,可分离30~1000kD的可溶性生物大分子无化学试剂,无相变化提取操作(4)简便,游离药物分析的首选方法;尤其适合TDM3.超滤法ultrafiltration是一种膜分离技术提16(三)水解法简便,快速水解过程中发生药物分解专一性较差葡萄糖醛酸苷酶或/和硫酸酯酶专属性强时间较长可引入粘蛋白溶剂萃取过程中缀合物(尤其硫酸酯)直接分解测定尿药总量,水解缀合物趋向于直接测定缀合物1.酸水解法2.酶水解法3.溶剂解法(三)水解法简便,快速葡萄糖醛酸苷酶或/和硫酸酯酶17(四)化学衍生化法1.在GC中的应用(1)硅烷化:三甲基硅烷(TMCS)(2)酰化:三氟乙酸酐(TFAA)(3)烷基化:碘庚烷(C7H15I)(4)不对称衍生化:(S)-N-三氟乙酰脯氨酰氯(ST-FPC)2.在HPLC中的应用(1)衍生化的分类

柱前/柱后;在线/离线(2)衍生化方法

(1)紫外衍生化(2)荧光衍生化(3)非对映体衍生化GC:①提高药物的挥发性;②增加药物的稳定性;③生成非对映异构体HPLC:①提高检测灵敏度;②改善色谱分离容量分析法(四)化学衍生化法1.在GC中的应用2.在HPLC18第二节

体内样品分析的前处理

体内样品预处理的目的1常用体内样品预处理方法2

前处理(分离,浓集,改性)为药物的测定提供条件

前处理是体内药物分析过程中重要且繁复的工作第二节

体内样品分析的前处理体内样品预处理的目的1常用体内19仪器污染,劣化(去蛋白)提高测定灵敏度/选择性化学改性(衍生化)

血浆蛋白结合物;缀合物使待测药物/代谢物释放测定药物/代谢物总浓度

1.使待测组分游离

2.满足测定方法的要求

3.改善分析环境

一、体内样品前处理的目的样品介质组成复杂:分离待测组分浓度低:浓集

前处理仪器污染,劣化(去蛋白)血浆蛋白结合物;缀合物1.使待测组20二、体内样品前处理的方法

去除蛋白质法分离与浓集法缀合物水解法

(一)(二)(三)化学衍生化法

(四)二、体内样品前处理的方法去除蛋白质法分离与浓集法缀合21(一)去除蛋白质法加入与水混溶的有机溶剂,蛋白析出→药物释放乙腈,甲醇,丙酮,四氢呋喃等血浆/血清与有机溶剂的体积比1∶(2-3)饱和硫酸铵,硫酸钠,硫酸镁,氯化钠等血清与饱和硫酸铵溶液的比1∶210%三氯醋酸或6%高氯酸溶液血清与强酸的比1∶0.6上清液呈强酸性(pH≤4)酸性分解的药物不宜用热变性蛋白质沉淀通常90℃方法简单只能除去热变性蛋白待测物热稳定性好

1.溶剂沉淀法2.中性盐析法3.强酸沉淀法4.热凝固法(一)去除蛋白质法加入与水混溶的有机溶剂,蛋白析出→药物22(二)分离与浓集法液相萃取法固相萃取法超滤法1.2.3.(二)分离与浓集法液相萃取法固相萃取法超滤法1.2.3.23(二)分离与浓集法液相萃取法固相萃取法超滤法1.2.3.(二)分离与浓集法液相萃取法固相萃取法超滤法1.2.3.241.液相萃取法溶剂的选择原则溶剂的用量水相的pH(1)(2)(3)提取操作(4)1.液相萃取法溶剂的选择原则溶剂的用量水相的pH(1)25(1)溶剂的选取原则①对药物分子未电离形式可溶,对电离形式不溶；②沸点低,易挥发;③与水不相混溶;④无毒,不易燃烧;⑤具有化学稳定和惰性;⑥不影响紫外检测

溶剂紫外截止波长(nm)沸点(℃)↓极性增加↓正己烷21069环己烷21081甲苯285111异丙醚*22068乙醚*22035醋酸戊酯285149三氯甲烷24561甲基异丁基酮230116醋酸乙酯26077正丁醇215118*:含过氧化物；:肝脏毒性,有致癌作用①辅助试剂的使用乙醚(1.2%水):氯化钠②混合溶剂的使用正己烷-异丙醇(95:5)(1)溶剂的选取原则①对药物分子未电离形式可溶,对电离形26(2)溶剂的用量有机相与水相(样品)体积比为1:1~5:1碱性药物pH高于pKa1~2单位酸性药物pH低于pKa1~2单位碱性下提取,可减少内源性物质(酸性)的干扰碱性下不稳定,在中性用三氯甲烷和异丙醇提取(3)水相的pH提取1次若提取回收率较低(低于50%),提取2~3次脂溶性干扰物,可进行小体积水溶液反提取

(4)提取操作

(2)溶剂的用量有机相与水相(样品)体积比为1:1~5:1272.固相萃取法固相萃取法的原理

固相萃取法操作步骤

注意事项

(1)(2)(3)固相萃取法的特点

(4)自动化固相萃取

(5)2.固相萃取法固相萃取法的原理固相萃取法操作步骤注意事28(1)固相萃取法的原理 含药物体内样品通过小柱时,受到“吸附”,“分配”,“离子交换”或其它亲和力作用,药物及内源性物质同时被保留在固定相(填料) 洗脱方式有两种:①冲洗溶剂洗去干扰物,再用对药物亲和力更强的溶剂洗脱药物;②药物直接被洗脱,干扰物保留(1)固相萃取法的原理 含药物体内样品通过小柱时,受到29(2)固相萃取法操作步骤

第1步:甲醇润湿小柱,活化填料;净化填料

第2步:水/缓冲液冲洗小柱,去除甲醇;甲醇含量过低(低于5%)致C18链弯曲折叠,回收率降低

第3步:加样,使样品通过小柱,并弃去滤过液

第4步:水/缓冲液冲洗小柱,去除内源性及其它干扰物质第5步:洗脱溶剂洗脱待测物,收集洗脱液,平衡(2)固相萃取法操作步骤第1步:甲醇润湿小柱,活化填30(3)注意事项①样品(血浆)通过萃取柱的流速在1-2ml/min;②冲洗液和洗脱剂的强度与用量适当,否则导致药物损失/选择性下降,通常选用可与水混溶的洗脱剂;③萃取碱性药物时,洗脱剂中常加酸,有机胺,氨水,醋酸铵或离子对试剂(3)注意事项①样品(血浆)通过萃取柱的流速在31(4)自动化固相萃取法对于单个样品处理,SPE操作省时对于大量样品的处理半自动SPE:萃取过程机械化全自动化仪器:通过柱切换技术实现固相萃取与HPLC联用(4)自动化固相萃取法对于单个样品处理,SPE操作省时32柱切换:固相萃取-LC/MS/MS(5)自动化固相萃取法柱切换:固相萃取-LC/MS/MS(5)自动化固相萃取法333.超滤法ultrafiltration是一种膜分离技术按照截留分子量,选择半透膜,可分离30~1000kD的可溶性生物大分子无