溶菌酶试验综合型实验(DOC)

第1章引言生化技术重要理论蛋白质提取分离技术以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、硷、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。蛋白质的制备一般分为以下四个阶段：选择材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓细、干燥和保存。微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况：（1）得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等； （2）利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理。另外，对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。1．蛋白质的分离纯化蛋白质（包括酶）的提取大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。水溶液提取法稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。（1）pH值蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。（2）盐浓度稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以0.15摩尔。升浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。有机溶剂提取法一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内不会引起酶的变性失活。另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化方法很多，主要有：.1.根据蛋白质溶解度不同的分离方法蛋白质的盐析中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4）有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。影响盐析的因素有：（1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25度）比0度时溶解度低，更容易盐析。（2）pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。（3）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在 2.5-3.0%。蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25度时饱和溶液为4.1M，即767克/升；0度时饱和溶解度为3.9M，即676克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入秀析袋内（常用的是玻璃纸），用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。等电点沉淀法蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。低温有机溶剂沉淀法用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。根据蛋白质分子大小的差别的分离方法透析与超滤透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。超滤法是利用高压力或离心力，强使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的膜截留不同分子量的蛋白质。凝胶过滤法也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶(Sephadexgel)和琼脂糖凝胶(agarosegel)。根据蛋白质带电性质进行分离蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同，可将其分开。电泳法各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。离子交换层析法离子交换剂有阳离子交换剂(如：羧甲基纤维素；CM-纤维素)和阴离子交换剂(二乙氨基乙基纤维素；DEAE?FONTFACE="宋体"LANG="ZH-CN">纤维素)，当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。根据配体特异性的分离方法－亲和色谱法亲和层析法(aflinitychromatography)是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand)的分子能特异而非共价地结合。其基本原理：蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质，因此蛋白质的分离(Separation)，提纯(Purification)和鉴定(Characterization)是生物化学中的重要的一部分，至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来，因此往往采取几种方法联合使用。1.3细胞的破碎高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热， 应采取相应降温措施。对超声波敏感和核酸应慎用。反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠( SDS)、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好。无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸( DFP)可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物(PMSF)也能清除蛋白水解酥活力，但不是全部，还可通过选择 pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。1.4浓缩、干燥及保存样品的浓缩生物大分子在制备过程中由于过柱纯化而样品变得很稀，为了保存和鉴定的目的，往往需要进行浓缩。常用的浓缩方法的：

减压加温蒸发浓缩通过降低液面压力使液体沸点降低，减压的真空度愈高，液体沸点降得愈低，蒸发愈快，此法适用于一些不耐热的生物大分子的浓缩。空气流动蒸发浓缩空气的流动可使液体加速蒸发，铺成薄层的溶液，表面不断通过空气流；或将生物大分子溶液装入透析袋内置于冷室，用电扇对准吹风，使透过膜外的溶剂不沁蒸发，而达到浓缩目的，此法浓缩速度慢，不适于大量溶液的浓缩。冰冻法生物大分子在低温结成冰，盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中，操作时先将待浓缩的溶液冷却使之变成固体，然后缓慢地融解，利用溶剂与溶质融点介点的差别而达到除去大部分溶剂的目的。如蛋白质和酶的盐溶液用此法浓缩时，不含蛋白质和酶的纯冰结晶浮于液面，蛋白质和酶则集中于下层溶液中，移去上层冰块，可得蛋白质和酶的浓缩液。袋内溶吸收法通过吸收剂直接收除去溶液中溶液分子使之浓缩。所用的吸收剂必需与溶液不起化学反应，对生物大分子不吸附，易与溶液分开。常用的吸收剂有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝胶等，使用聚乙二醇吸收剂时，先将生物大分子溶液装入半透膜的袋里，外加聚乙二醇复盖置于 4度下袋内溶剂渗出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水饱和后要更换新的直至达到所需要的体积。超滤法超滤法是使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法，不液体在一定压力下（氮气压或真空泵压）通过膜时，溶剂和小分子透过，大分子受阻保留，这是近年来发展起来的新方法，最适于生物大分子尤其是蛋白质和酶的浓缩或脱盐，并具有成本低，操作方便，条件温和，能较好地保持生物大分子的活性，回收率高等优点。应用超滤法关键在于膜的选择，不同类型和规格的膜，水的流速，分子量截止值（即大体上能被膜保留分子最小分子量值）等参数均不同，必须根据工作需要来选用。另外，超滤装置形式，溶质成份及性质、溶液浓度等都对超滤效果的一定影响。Diaflo超滤膜的分子量截留值：膜名称分子量截留值孔的大的平均直径XM－300300，000140XM－200100，00055XM－5050，00030PM－3030，00022UM－2020，00018PM－1010，00015UM－21，00012UM0550010用上面的超滤膜制成空心的纤维管，将很多根这样的管拢成一束，管的两端与低离子强度的缓冲液相连，使缓冲液不断地在管中流动。然后将纤维管浸入待透析的蛋白质溶液中。当缓冲液流过纤维管时，则小分子很易透过膜而扩散，大分子则不能。这就是纤维过滤秀析法，由于透析面积增大，因而使透析时间缩短10倍。干燥生物大分子制备得到产品，为防止变质，易于保存，常需要干燥处理，最常用的方法是冷冻干燥和真空干燥。真空干燥适用于不耐高温，易于氧化物质的干燥和保存，整个装置包括干燥器、冷凝器及真空干燥原理外，同时增加了温度因素。在相同压力下，水蒸汽压随温度下降而下降，故在低温低压下，冰很易升华为气体。操作时一般先将待干燥的液体冷冻到冰点以下使之变成固体，然后在低温低压下将溶剂变成气体而除去。此法干后的产品具有疏松、溶解度好、保持天然结构等优点，适用于各类生物大分子的干燥保存。贮存生物大分子的稳定性与保存方法的很大关系。干燥的制品一般比较稳定，在低温情况下其活性可在数日甚至数年无明显变化，贮藏要求简单，只要将干燥的样品置于干燥器内（内装有干燥剂）密封，保持0－4度冰箱即可，液态贮藏时应注意以下几点：样品不能太稀，必须浓缩到一定浓度才能封装贮藏，样品太稀易使生物大分子变性。一般需加入防腐剂和稳定剂，常用的防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。蛋白质和酶常用的稳定剂有硫酸铵糊、蔗糖、甘油等，如酶也可加入底物和辅酶以提高其稳定性。此外，钙、锌、硼酸等溶液对某些酶也有一定保护作用。核酸大分子一般保存在氯化钠或柠檬酸钠的标准缓冲液中。贮藏温度要求低，大多数在0度左右冰箱保存，有的则要求更低，应视不同物质而定。柱层析技术概述柱层析技术也称柱色谱技术。一根柱子里先填充不溶性基质形成固定相，将蛋白质混合样品加到柱子上后用特别的溶剂洗脱，溶剂组成流动相。在样品从柱子上洗脱下来的过程中，根据蛋白质混合物中各组分在固定向和流动相中的分配系数不同经过多次反复分配，将不同蛋白组分逐一分离。根据填充基质和样品分配交换原理不同，离子交换层析，凝胶过滤层析和亲和层析是三种分离蛋白质的经典层析技术。在利用柱层析技术分离提取蛋白质的过程中，主要有以下几个方面的流程。柱层析操作方法的选择目前，柱色谱分离的操作方式，主要包括常压分离、减压分离和加压分离3种模式。常压分离是最简单的分离模式方便、简单，但是洗脱时间长。减压分离尽管能节省填料的使用量，但是由于大量的空气通过填料会使溶剂挥发，并且有时在柱子外面会有水汽凝结，以及有些易分解的化合物也难以得到，而且还必须同时使用水泵或真空泵抽气。加压分离可以加快淋洗剂的流动速度，缩短样品的洗脱时间，是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗液更快洗脱。压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵等。柱子规格的选择市场上有各种规格的柱层析分离柱。柱子长了，相应的塔板数就高，分离就好。目前市场上的柱子，其径高比一般在1:5～10范围，在实际使用时，填料量一般是样品量的30～40倍，具体的选择要根据样品的性质和含量进行具体分析。如果所需组分和杂质的分离度较大，就可以减少填料量，使用内径相对较小的柱子（如2cm×20cm的柱子）;如果Rf相差不到0.1，就要加大柱子，增加填料量，比如用3cm内径的柱子。装柱柱层析色谱柱的填装主要有湿法和干法两种，湿法省事，一般用淋洗剂溶解样品，也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等，但溶剂越少越好，不然溶剂就成了淋洗剂了。柱子底端的活塞一定不要涂润滑剂，否则会被淋洗剂带到淋洗液中，可以采用聚四氟乙烯材料的阀门。干法和湿法装柱没什么实质性差别，只要能把柱子装实就行。装完的柱子应该有适度的紧密（太密了淋洗剂流速太慢），并且一定要均匀，不然样品就会从一侧斜着流动。同时柱中不能有大气泡 ，大多数情况下有些小气泡没太大的影响，因为只要加压气泡就可消失。但是柱子更忌讳的是开裂，开裂会影响分离效果，甚至报废。溶剂的选择选择一个合适的溶剂系统是柱层析分离的关键。在选用柱层析洗脱剂时首先要考虑三个方面的因素:溶解性（Solubil2ity）、亲合性（Affinity）和分离度（Resolution）。溶剂应选择价廉、安全、环保的，可以考虑石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醚、甲醇和正己烷等等。但正己烷价格较高，乙醚很易挥发，二氯甲烷和甲醇与硅胶的吸附是一个放热过程，易使柱子产生气泡。其他的溶剂用的相对较少，要依不同需要选择。另外值得一提的是，由于我们进行的是痕量分析，淋洗剂的纯度必须关注，一般使用农药残留级或HPLC级的，如果是分析纯的必须进行精制。同时溶剂在过柱后最好回收使用，一方面环保，另一方面也能节省部分经费。上样用少量的溶剂溶解样品加样，加完后将底端的活塞打开，待溶剂层下降至石英砂面时，再加少量的低极性溶剂，然后再打开活塞，如此两三次，一般石英砂就基本是白色的了。加入淋洗剂，一开始不要加压，等溶解样品的溶剂和样品层有一段距离 （2～4cm），再加压，这样避免了溶剂（如二氯甲烷等）夹带样品快速下行。很多样品在上柱前粘性较大 ，上样后在柱上又会析出，这一般都是比较大量的样品才会出现，是因为填料对样品的吸附饱和所致。有些样品溶解性差，能溶解的溶剂（比如DMF，DMSO等）又不能上柱，这样就必须用干法上柱了。淋洗液的收集和浓缩用硅胶作固定相过柱子的原理是一个吸附与解吸的平衡。如果样品与硅胶的吸附比较强的话，就不容易流出，这时可以采用氧化铝作固定相。柱层析后的淋洗液，由于使用了较多的溶剂，必须进行浓缩，如果待测物具有一定的挥发性，最好使用常压挥发溶剂，否则易导致检测结果偏低。离子交换层析离子交换层析（IonExchangeChromatography简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。1848年，Thompson等人在研究土壤碱性物质交换过程中发现离子交换现象。 本世纪40年代，出现了具有稳定交换特性的聚苯乙烯离子交换树脂。50年代，离子交换层析进入生物化学领域，应用于氨基酸的分析。目前离子交换层析仍是生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。常用的离子交换剂有：离子交换纤维素、离子交换葡聚糖和离子交换树脂。离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阴离子交换树脂；而带有负电荷的称之阳离子树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。预处理及装柱：对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的颗粒，以保证有较好的均匀度，对于已溶胀好的产品则不必经这一步骤。溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理，使之成为带H+或OH-的交换剂型。阴离子交换剂常用“碱-酸-碱”处理，使最终转为-OH-型或盐型交换剂；对于阳离子交换剂则用“酸-碱-酸”处理，使最终转为-H-型交换剂。洗涤好的纤维素使用前必须平衡至所需的pH和离子强度。已平衡的交换剂在装柱前还要减压除气泡。为了避免颗粒大小不等的交换剂在自然沉降时分层，要适当加压装柱，同时使柱床压紧，减少死体积，有利于分辨率的提高。柱子装好后再用起始缓冲液淋洗，直至达到充分平衡方可使用。加样与洗脱加样：层析所用的样品应与起始缓冲液有相同的pH和离子强度，所选定的pH值应落在交换剂与被结合物有相反电荷的范围，同时要注意离子强度应低，可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目的。样品中的不溶物应在透析后或凝胶过滤前，以离心法除去。为了达到满意的分离效果，上样量要适当，不要超过柱的负荷能力。柱的负荷能力可用交换容量来推算，通常上样量为交换剂交换总量的1％-5％。洗脱：已结合样品的离子交换前，可通过改变溶液的pH或改变离子强度的方法将结合物洗脱，也可同时改变pH与离子强度。为了使复杂的组份分离完全，往往需要逐步改变pH或离子强度，其中最简单的方法是阶段洗脱法，即分次将不同pH与离子强度的溶液加入，使不同成分逐步洗脱。由于这种洗脱pH与离子强度的变化大，使许多洗脱体积相近的成分同时洗脱，纯度较差，不适宜精细的分离。最好的洗脱方法是连续梯度洗脱，两个容器放于同一水平上，第一个容器盛有一定pH的缓冲液，第二个容器含有高盐浓度或不同pH的缓冲液，两容器连通，第一个容器与柱相连，当溶液由第一容器流入柱时，第二容器中的溶液就会自动来补充，经搅拌与第一容器的溶液相混合，这样流入柱中的缓冲液的洗脱能力即成梯度变化。第一容器中任何时间的浓度都可用下式进行计算：C＝C2－（C2－C1）（1－V）A2/A1式中A1、A2分别代表两容器的截面积：C1、C2分别表示容器中溶液的浓度；V为流出体积对总体积之比。当A1＝A2时为线性梯度，当A1>A2时为凹形梯度，A1>A2时为凸形梯度。洗脱时应满足以下要求：①洗脱液体积应足够大，一般要几十倍于床体积，从而使分离的各峰不致于太拥挤。②梯度的上限要足够高，使紧密吸附的物质能被洗脱下来。③梯度不要上升太快，要恰好使移动的区带在快到柱末端时达到解吸状态。目的物的过早解吸，会引起区带扩散；而目的物的过晚解吸会使峰形过宽。洗脱馏份的分析按一定体积（5-10ml/管）收集的洗脱液可逐管进行测定，得到层析图谱。依实验目的的不同，可采用适宜的检测方法（生物活性测定、免疫学测定等）确定图谱中目的物的位置，并回收目的物。离子交换剂的再生与保存离子交换剂可在柱上再生。如离子交换纤维素可用2mol/：NaCl淋洗柱，若有强吸附物则可用0.1mol/LNaOH洗柱；若有脂溶性物质则可用非离子型去污剂洗柱后再生，也可用乙醇洗涤，其顺序为：0.5mol/LNaOH-水-乙醇-水-20％NaOH-水。保存离子交换剂时要加防腐剂。对阴离子交换剂宜用0.002％氯已定（洗必泰），阳离子交换剂可用乙基硫柳汞（0.005％）。有些产品建立用0.02％叠氮钠。离子交换层析的应用离子交换层析技术已广泛用于各学科领域。在生物化学及临床生化检验中主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其它带电荷的生物分子。凝胶过滤

凝胶过滤层析(gelfiltrationchromatography)又称排阻层析或分子筛方法，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。也叫做分子排阻层析(molecular-exclusionchromatography)。一种利用带孔凝胶珠作基质，按照分子大小分离蛋白质或其它分子混合物的层析技术。一般是大分子先流出来，小分子后流出来。凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，小分子物质能进入其内部，流下来速度慢，而大分子物质却被排除在外部，下来的速度快，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。凝胶的选择根据实验目的不同选择不同型号的凝胶。如果实验目的是将样品中的大分子物质和小分子物质分开，由于它们在分配系数上有显著差异，这种分离又称组别分离，一般可选用SephadexG-25和G-50，对于小肽和低分子量的物质(1000-5000)的脱盐可使用SephadexG-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4.如果实验目的是将样品中一些分子量比较近似的物质进行分离， 这种分离又叫分级分离。一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶，层析过程中这些物质都能不同程度地深入到凝胶内部，由于Kd不同，最后得到分离。柱的直径与长度根据经验，组别分离时，大多采用2-30cm长的层析柱，分级分离时，一般需要100cm左右长的层析柱，其直径在1-5cm范围内，小于1cm产生管壁效应，大于5cm则稀释现象严重。长度L与直径D的比值L/D一般宜在7-10之间，但对移动慢的物质宜在30-40之间。凝胶柱的制备凝胶型号选定后，将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速，即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。加热法既可节省时间又可消毒。凝胶的装填：将层析柱与地面垂直固定在架子上，下端流出口用夹子夹紧，柱顶可安装一个带有搅拌装置的较大容器，柱内充满洗脱液，将凝胶调成较稀薄的浆头液盛于柱顶的容器中，然后在微微地搅拌下使凝胶下沉于柱内，这样凝胶粒水平上升，直到所需高度为止，拆除柱顶装置，用相应的滤纸片轻轻盖在凝胶床表面。稍放置一段时间，再开始流动平衡，流速应低于层析时所需的流速。在平衡过程中逐渐增加到层析的流速，千万不能超过最终流速。平衡凝胶床过夜，使用前要检查层析床是否均匀，有无“纹路”或气泡，或加一些有色物质来观察色带的移动，如带狭窄、均匀平整说明层析柱的性能良好，色带出现歪曲、散乱、变宽时必须重新装柱。加样和洗脱凝胶床经过平衡后，在床顶部留下数亳升洗脱液使凝胶床饱和，再用滴管加入样品。一般样品体积不大于凝胶总床体积的 5％-10％。样品浓度与分配系数无关，故样品浓度可以提高，但分子量较大的物质，溶液的粘度将随浓度增加而增大，使分子运动受限，故样品与洗脱液的相对粘度不得超过1.5-2.样品加入后打开流出口，使样品渗入凝胶床内，当样品液面恰与凝胶床表面相平时，再加入数毫升洗脱液中洗管壁，使其全部进入凝胶床后，将层析床与洗脱液贮瓶及收集器相连，预先设计好流速，然后分部收集洗脱液，并对每一馏份做定性、定量测定。凝胶柱的重复使用、凝胶回收与保存一次装柱后可以反复使用，不必特殊处理，并不影响分离效果。为了防止凝胶染菌，可在一次层析后加入 0.02％的叠氮钠，在下次层析前应将抑菌剂除去，以免干扰洗脱液的测定。如果不再使用可将其回收，一般方法是将凝胶用水冲洗干净滤干，依次用 70％、90％、95％乙醇脱水平衡至乙醇浓度达90％以上，滤干，再用乙醚洗去乙醇、滤干、干燥保存。湿态保存方法是凝胶浆中加入抑菌剂或水冲洗到中性，密封后高压灭菌保存。凝胶层析的应用脱盐：高分子(如蛋白质、核酸、多糖等)溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。本法脱盐操作简便、快速、蛋白质和酶类等在脱盐过程中不易变性。适用的凝胶为SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6.柱长与直径之比为5-15，样品体积可达柱床体积的25％-30％，为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上， 一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡，然后加入样品，再用同样缓冲液洗脱，收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。用于分离提纯：凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。凝胶对热原有较强的吸附力，可用来去除无离子水中的致热原制备注射用水。测定高分子物质的分子量：用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内，在同一条件下层析，记录每一分钟成分的洗脱体积，并以洗脱体积对分子量的对数作图，在一定分子量范围内可得一直线，即分子量的标准曲线。测定未知物质的分子量时，可将此样品加在测定了标准曲线的凝胶柱内洗肿后，根据物质的洗脱体积，在标准曲线上查出它的的分子量。高分子溶液的浓缩：通常将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中，这时水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部的孔隙中，而高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外，再经离心或过滤，将溶胀的凝胶分离出去，就得到了浓缩的高分子溶液电泳技术电泳：带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳 (electrophoresis,EP)。在生物学中，主要是指带电荷的蛋白质或核酸分子在电场中移动的现象。电泳的分类：目前所采用的电泳方法，大致可分为3类：显微电泳，自由界面电泳和区带电泳。区带电泳应用最为广泛，可分为以下几种类型：按支持物的物理性状不同，区带电泳可分为：滤纸为支持物的纸电泳粉末电泳：如纤维素粉，淀粉，玻璃粉电泳凝胶电泳：如琼脂，琼脂糖，硅胶，淀粉胶，聚丙烯酰胺凝胶电泳缘线电泳：如尼龙丝，人造丝电泳按支持物的装置形式不同，区带电泳可分为：平板式电泳：支持物水平放置，是最常用的电泳方式垂直板电泳：聚丙烯酰胺凝胶可做成垂直板式电泳柱状（管状）电泳:：聚丙烯酰胺凝胶可灌入适当的电泳管中做成管状电泳按pH的连续性不同，区带电泳可分为：连续pH电泳：如纸电泳，醋酸纤维素薄膜电泳非连续pH电泳：如聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳电泳所需的仪器电泳所需的仪器有：电泳槽和电泳仪。电泳槽电泳槽是电泳系统的核心部分，根据电泳的原理，电泳支持物都是放在两个缓冲液之间，电场通过电泳支持物连接两个缓冲液，不同电泳采用不同的电泳槽 .常用的电泳槽有圆盘电泳槽、垂直板电泳槽、水平电泳槽。电泳仪要使荷电的生物大分子在电场中泳动，必须加电场，且电泳的分辨率和电泳速度与电泳时的电参数密切相关。不同的电泳技术需要不同的电压，电流和功率范围，所以选择电源主要根据电泳技术的需要。.电泳技术的应用聚丙烯酰胺凝胶电泳可用做蛋白质纯度的鉴定。聚丙烯酰胺凝胶电泳同时具有电荷效应和分子筛效应，可以将分子大小相同而带不同数量电荷的物质分离开，并且还可以将带相同数量电荷而分子大小不同的物质分离开。其分辨率远远高于一般层析方法和电泳方法，可以检出 10-9～10-12g的样品，且重复性好,没有电渗作用。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可测定蛋白质分子量。其原理是带大量电荷的SDS结合到蛋白质分子上克服了蛋白质分子原有电荷的影响而得到恒定的荷 /质比。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测蛋白质分子量已经比较成功，此法测定时间短，分辨率高，所需样品量极少 （1～100μg，）但只适用于球形或基本上呈球形的蛋白质，某些蛋白质不易与SDS结合如木瓜蛋白酶，核糖核酸酶等，此时测定结果就不准确。聚丙烯酰胺凝胶电泳可用于蛋白质定量。电泳后的凝胶经凝胶扫描仪扫描，从而给出定量的结果。凝胶扫描仪主要用于对样品单向电泳后的区带和双向电泳后的斑点进行扫描。琼脂或琼脂糖凝胶免疫电泳可用于①检查蛋白质制剂的纯度；②分析蛋白质混合物的组分；③研究抗血清制剂中是否具有抗某种已知抗原的抗体；④检验两种抗原是否相同。电泳后结果检测对于不同的目的，应采用不同的检测方法。用染料和生物大分子结合形成有色的复合物是电泳后检测最常用的方法。聚丙烯酰胺凝胶电泳作用：用于蛋白质与寡糖核苷酸的分离。作用原理聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应，它具有两种形式，一种是非变性聚丙烯酰胺凝胶，蛋白质在电泳中保持完整的状态，蛋白在其中依三种因素分开：蛋白大小，形状和电荷。10而SDS仅根据蛋白分子量亚基的不同而分离蛋白。这个技术首先是1967年由shapiro建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，电荷因素可以忽视。SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使绊胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。SDS一般采用的是不连续缓冲系统，于连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。此鉴定方法中，蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和分子形状无关。第2章实验准备2.1引言本实验需用到的试剂，所以根据其需要及要求进行相关实验试剂配制准备。2.2仪器及材料仪器：柱层析系统（层析柱，恒流泵，紫外监测仪，部分收集器），Sigma高速冷冻离心机，722s分光光度计，透析袋，水浴锅，电泳仪，电泳槽，紫外凝胶成像系统。材料：新鲜鸡蛋。试剂：（1）弱酸性阳离子交换树脂；（2）磷酸氢二钠；（3）磷酸二氢钠；（4）氯化钠；（5）硫酸铵；（6）氢氧化钠；（7）甘油；（8）盐酸；（9）葡聚糖凝胶G-50；（10）溶壁微球菌干粉；（11）考马斯亮蓝G-250；（12）95%乙醇；（13）85%磷酸；（14）牛血清清蛋白（BSA）；（15）脲；（16）丙烯酰胺（Acr）；（17）甲叉双丙烯酰胺（Bis）；（18）四甲基乙二胺（TEMED）；（19）甘氨酸（Gly）；（20）过硫酸铵（AP）；（21）考马斯亮蓝R-250；（22）三羟甲基氨基甲烷（Tris）；（23）2-β-巯基乙醇；（24）十二烷基磺酸钠（SDS）；（25）溴酚蓝；（26）冰醋酸；（27）标准蛋白：SDS-低相对分子质量标准蛋白.2.3方法（1） 0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0；【配置成5*500ml，临用前稀释】（2） 2mol/LNaOH；200ml（3） 2mol/LHCl；200ml（4） 含50%甘油的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0；200ml（5） 含0.05mol/LNaCl的磷酸盐缓冲液，pH7.0；（现用现配）【临用前配置】200ml（6） 含0.5mol/LNaCl的磷酸盐缓冲液，pH7.0；（现用现配）【临用前配置】200ml（7） 含0.1mol/LNaCl的磷酸盐缓冲液，pH7.0；（现用现配）【临用前配置】（8） 测活缓冲液：含30mmol/LNaCl的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0；（9） 底物溶液Ⅰ：40mg溶壁微球菌干粉溶于100mL测活缓冲液中；【公用，临用前配置】（10） 考马斯亮蓝G-250试剂：考马斯亮蓝G-250100mg溶于50mL95%乙醇中，加入100mL85%磷11酸，用蒸馏水稀释至1000mL，滤纸过滤；【公用】标准蛋白质溶液：用0.1mol/LNaCl的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0配制1mg/ml牛血清清蛋白溶液；(100ml)底物溶液Ⅱ：300mg溶壁微球菌干粉溶于100ml测活缓冲液中；【公用，临用前配置】10mol/L脲，测活缓冲液配制；【50ml】30%胶贮液：每100mL中含丙烯酰胺29.2g，甲叉双丙烯酰胺0.8g；【100ml公用】1.5mol/LTris-HClpH8.8；【100ml公用】0.5mol/LTris-HClpH6.8；【100ml公用】10%(W/V)过硫酸铵；【现用现配】SDS电泳缓冲液：25mmol/LTris，0.192mol/LGly，0.1%(W/V)SDS；【500ml】10%(W/V)SDS；【10ml】染色液：0.2g考马斯亮蓝R-250，42mL工业酒精，10mL冰醋酸，加蒸馏水至100mL；【50ml】脱色液：5mL冰醋酸，45mL工业酒精，50mL蒸馏水；【100ml】保存液：7%冰醋酸；(现用现配)2×上样缓冲液：【公用，10ml】TOC\o"1-5"\h\z0.5mol/LTris-HClpH6.8 2mL甘油 2mLSDS 0.4g0.1%溴酚蓝 0.5mL2-β-巯基乙醇 0.5mL蒸馏水 2.5mL第3章酶的提取3.1引言离子交换层析是依据混合样品中各种离子或离子化合物与离子交换树脂的可交换离子之间的交换程度不同而进行分离纯化的。离子交换层析主要是离子交换剂与溶液中离子或离子化合物以离子交换方式进行，过程是可逆的。由于离子交换剂对溶液中各种离子具有不同的结合力，也就是说，离子交换剂对各离子的排斥和阻滞作用不同，从而引起各离子在柱内的流速差异，逐渐发生分离，最终分别流出层析柱。该法可同时分析多种离子化合物，具有灵敏度高，重复性、选择性好，分离速度快等优点。本实验分离溶菌酶采用 732型弱酸性阳离子交换树脂。盐析，中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶。当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶解中，高浓度的盐离子(如硫酸铵的 SO42-和NH4+)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之失水，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析是若溶液 pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样。溶菌酶在32%硫酸铵盐浓度下的沉淀最多，最适宜作为盐析液浓度。经盐析得到的沉淀为溶菌酶的粗制品。3.2内容及步骤样品的制备：新鲜鸡蛋两个个，破蛋壳取出蛋清，加入蛋清体积1.5倍的0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)，搅拌均匀，并调pH7.0(NaOH调pH)，然后用八层纱布过滤，留取上清液，量取体积并记录，留0.4mL上清液(定为Ⅰ步骤样品)并加入 0.4mL甘油-20℃冻存备用。阳离子交换层析12阳离子交换柱的再生：50g阳离子交换树脂用2mol/LNaOH浸泡30min，水洗至中性，再用2mol/L盐酸浸泡30min，水洗至中性。平衡：在烧杯中将再生好的阳离子交换树脂用 0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0平衡。吸附：在已平衡好的阳离子交换树脂中加入蛋清样品，搅拌吸附 1h（玻璃棒搅拌）。洗涤：倒去其余上清液，树脂用 100mL0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0洗涤3遍。装柱：将树脂搅拌均匀装入离子交换柱，再用 300mL含0.05mol/LNaCl的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0洗涤杂蛋白。（装柱前，先检查层析柱是否干净，保证所有接头密闭、管道通畅；装柱时，流速不超过3mL/min，全过程绝对不能出现流干现象）。洗脱：用300mL含0.5mol/LNaCl的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0以3mL/min的流速进行洗脱，合并光吸收高峰管，量取体积并记录，留0.4mL上清液并加入0.4mL甘油，-20℃冻存备用（定为Ⅱ步骤样品）洗脱层析结果图：（三）硫酸铵沉淀每100mL上清液中缓慢加入35g硫酸铵固体，溶解后静置30min，10000rpm离心10min，沉淀用0.5mL左右含0.1mol/LNaCl的磷酸盐缓冲液，pH7.0溶解，留0.05mL上清液并加入0.05mL甘油，-20℃冻存备用（定为Ⅲ步骤样品）。第4章酶的纯化4.1引言凝胶层析又称分子筛过滤，是一种物理的分离纯化手段，它是依据样品中各组分间分子大小的差异设计的。凝胶层析的填料溶胀后是具有立体网状结构的球形惰性凝胶颗粒，颗粒的表面和内部形成很多孔穴，且孔穴直径较一致。若样品中各组分的分子大小不同，样品进入凝胶层析柱后，各个组分向凝胶颗粒的孔穴内扩散，能否进入孔穴内部取决于孔穴的大小和组分分子的大小。比孔穴孔径大的分子不能进入孔穴内部，完全被排阻在孔穴之外，只能沿着凝胶颗粒间的空隙或大的网状孔通过，随流动相向下流动，它们在柱内迁移的路径短，停留时间短，保留值小，所以迁移率最快，13

首先从柱中流出；一般可选用SephadexG-25和SephadexG-50型号的凝胶，对于实验目的是将样品中一些分子量比较近似的物质进行分离(分级分离)，一般选用排阻限度略大与样品中最高分子量物质的凝胶。凝胶层析中一般样品体积不大于凝胶总床体积的 5%-10%。样品浓度和分配系数无关，故样品浓度可以提高，但样品与洗脱液的相对浓度不得超过1.5-2。4.2方法1.分子筛层析溶胀：取葡聚糖凝胶G-503g，加60mL蒸馏水沸水浴中煮沸2h，充分溶胀后的凝胶以倾斜法除去表面悬浮的小颗粒，如此反复洗涤 2～3次，最后加入等体积含0.1mol/LNaCl的pH7.0磷酸缓冲液备用。装柱：将凝胶悬浮液搅拌均匀后一次连续性倾入柱中，控制流速≦ 15mL/h，自然沉降(注意：绝对不能出现“流干”现象，不能有气泡和分层，胶面一定要平整)。平衡：用含0.1mol/LNaCl的pH7.0磷酸缓冲液平衡两个柱体积，控制流速≦15mL/h。上样：将溶解后的硫酸铵沉淀样品 10000rpm离心3min后上样，当样品进入胶面后，再用平衡缓冲液约0.5mL洗管壁和胶面3次(注意：绝对不能出现“流干”现象和破坏胶面的平整性。)。.洗脱：用含0.1mol/LNaCl的pH7.0磷酸缓冲液洗脱，控制流速≦15mL/h，自动部分收集器收集，2mL/管，紫外监测仪检测洗脱峰或比色法测定洗脱峰。合并光吸收及酶活高峰管。2.透析浓缩用含50%甘油的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0透析浓缩4h，-20℃分装保存备用(定为Ⅳ步骤样品)。洗脱层析结果图：1414第5章酶活力、蛋白浓度测定5.1引言酶活力是指酶催化一定的化学反应的能力。规定 1个酶活单位(IU)是指在特定的条件下，在1分钟内能够转化1微摩尔底物的酶量或是转化底物中1微摩尔有关基团的酶量。酶活力的测定方法有终止法测定酶活力和连续法测定酶活力。本实验即运用连续记录其吸光度变化的连续法测定酶活力。棕红色的染料考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后，形成蓝色复合物，最大吸光度值由465变为595nm，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白和染料的结合符合比尔定律，通过测定 595nm处的吸光度值的增加量可对蛋白质浓度进行定量测定。溶菌酶是一种N-乙酰胞壁质肽聚糖水解酶，可以催化水解细菌细胞壁N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性多糖分解成可溶性糖肽，使细菌溶解。本实验以溶壁微球菌为底物，通过测量细菌悬液浊度的变化来测定溶菌酶的活性。5.2仪器及试剂仪器：722s分光光度计试剂：测活缓冲液；底物溶液Ⅰ；考马斯亮蓝G-250试剂；准蛋白质溶液.5.3方法：蛋白浓度的测定(1)标准曲线的制定取14支试管，按下表分两组进行平行操作。管号0123456标准蛋白质溶液/ml00.010.020.030.040.050.06测活缓冲液0.100.090.080.070.060.050.04考马斯亮蓝G-2505ml摇匀，1h内以0号试管为空白对照，在595nm处比色A595nm00.0780.1380.1980.2620.3070.362绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。标准蛋白含量mg00.010.020.030.040.050.06(2)测定未知样品蛋白质浓度测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白浓度(mg/ml)。A595nmOD值标准蛋白含量未知样品蛋白质浓度(mg/ml)(mg)样一A595nm0.5070.08089995280.89995213样二A595nm0.2730.043561543.5615样三A595nm0.4620.07371948373.7194830115

样四A595nm0.2090.0333492933.34928993酶活力测定测活缓冲液/ml2.53.0底物溶液/ml测活缓冲液/ml2.53.0底物溶液/ml2.52.50.5酶液/ml0.5时间0s30s60s90s120s150s180s样一0.0910.1580.2020.2640.3020.3260.358A595nm样二A595nm0.0190.0540.0910.1330.1710.2050.233样三A595nm0.1200.1790.2330.2640.2760.2840.291样四A595nm0.3750.4020.4660.4930.5050.5160.543每隔30s测定2号650nm处的光吸收值在室温，管为对照，以1号5.4实验结果活力单位（U）：酶在室温，pH6.2条件下，A595nm每分钟降低0.001为一个活力单位U。比活力=活力单位/mg蛋白ykxb0.001回收率ykxb0.001回收率每次总活性第一次总活性x100%纯化倍数第每一次次比比活活性性根据测得结果，计算出各步数据填入下表：组分体积蛋白总蛋白/mg活力总活力比活力提纯倍数回收/ml/mg·ml-1/U·ml-1/U/U·mg-1率Ⅰ13080.901051788114401.087762671016

Ⅱ12543.5654457391251.6758494031.54063882680%Ⅲ2.573.72184.3541350.00733570.00674368981%Ⅳ0.533.35116.7355192.51.64952871.51644116.8006731%第6章酶促动力学（Km测定、酶的抑制）6.1引言酶促动力学研究酶促反应的速度及影响速度的各种因素，而米氏常数Km值等于酶促反应速度为最大速度的一半时所对应的底物浓度，其数值大小与酶的浓度无关，是酶促反应的特性常数。不同酶的Km值不同，同一种酶在与不同的底物反应时，其Km值也不同。Km反映了酶和底物亲和能力的强弱程度。大多数纯酶的Km值在0.01-100mmol/L之间。酶的活力可以被某些物质激活或抑制，凡能降低酶的活性甚至使酶失活的物质，称为酶的抑制剂，酶的活力抑制有可逆抑制和不可逆抑制两种。而可逆的抑制又包括有竞争性抑制和非竞争性抑制等类型，在有抑制剂存在的条件下，酶的一些动力学性质发生改变，如Km、Vm等。通过实验的方法，可以确定出抑制类型。6.2仪器及试剂仪器：722s分光光度计试剂：测活缓冲液；底物溶液Ⅱ；抑制剂。6.3方法底物浓度的影响（Km值的测定）取6个试管编号，按下表加样：管号123