古代养生汉方常用中药提取物的抗氧化实验研究

古代养生汉方常用中药提取物的抗氧化实验研究中国多肽产业集团武汉肽类物质研究所武汉多肽抗衰老研发有限公司唐良艳姜波【摘要】目的与方法采用DPPH•法和还原能力测定法测定了古代养生汉方常用23种中药提取物的抗氧化能力，并同VitC做了比较。结果不同的中药提取物抗氧化能力不同，23种中药提取物对DPPH•自由基的清除能力和还原能力均呈量效关系，其中葡萄籽提取物的抗氧化能力最强，与VitC的抗氧化能力一致。【关键词】养生汉方；还原能力；中药提取物；抗氧化能力；DPPH·本文选取了23种古代养生汉方常用中药提取物，并用DPPH·法和还原能力测定法两种方法对这23种中药提取物的抗氧化能力进行测定。一、材料1.1原料：23种天然植物提取物(由武汉天天好生物制品公司提供、VitC（市场购买。）1.2仪器：722N型可见分光光度计(上海精密仪器有限公司、KQ－50超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司、电子天平(奥豪斯、80-1型沉淀离心机、恒温水浴锅（黄骅市新兴仪器厂）、容量瓶、具塞试管等。1.3试剂：DPPH·(二苯代苦味酰自由基、2，2－Diphenyl-1-picry-hydrazyl购于SIGMA，10%三氯乙酸(TCA、1%铁氰化钾、0.1%三氯化铁、0.2mol/LpH6.6磷酸缓冲液、其他试剂均为分析纯。二、实验方法2.1通过DPPH·法比较23种中药提取物的抗氧化活性2.1.1方法：参考Shimada的方法，测定清除DPPH自由基的能力。实验上所采用的DPPH甲醇溶液为紫罗兰色在517nm下有强的吸光值，若与试样结合，将会降低吸光值，由此藉以判断试样清除DPPH自由基的能力，其吸光值愈低，表示试样清除DPPH自由基的能力愈强。[2]2.1.2样品DPPH·清除率的测定：取5mL一定浓度的试样溶液，分别加入新鲜配制的0.4mMDPPH甲醇（无水乙醇）溶液1mL，呈深紫蓝色，混合均匀，反应10分钟。以分光光度计在517nm波长下测定其吸光度。2.1.3计算样品对DPPH•自由基的清除能力（scavengingactivity,SA）可表示公式为：SA（％）＝[A0－（A1-A2）]/A0×100%A0→DPPH•与溶剂混合液的吸光度A1→DPPH•与样品反应后的吸光度1A2→样品与溶剂混合液的吸光度2.223种中药提取物还原能力的测定2.2.1方法：还原能力的测定是参考Oyaizu的方法，其原理即试样将赤血盐﹙K3Fe(CN6﹚还原成黄血盐﹙K4Fe(CN6﹚，黄血盐再与Fe3+作用，生成普鲁士蓝，在700nm波长测定吸光值，以检测普鲁士蓝的生成量，作为试样的还原力，吸光值愈高，表示试样还原力愈强。[3]K3Fe(CN6+Sample−→K4Fe(CN6+Sample-oxide3++3K4Fe(CN6+4Fe−→Fe4[Fe(CN6]3+12K2.2.2样品还原能力的测定取一定浓度的样品(1～10mg/ml0.1ml，加人2.5m1pH6.6的磷酸盐缓冲液(0.2mol/L和2.5ml1%的铁氰化钾溶液，混匀，在50℃保温20min后加人2.5ml10%的三氯乙酸，混合后以3000r/min离心10min。取上清液2.5ml，加2.5ml蒸馏水和0.5ml0.1%的FeCI3，室温放置10min后，在700nm波长处比色，比色值越大，还原能力越强。三、结果3.123种中药提取物对DPPH·自由基清除能力分别配制浓度为20ppm、100ppm、200ppm的中药提取物，测定其对DPPH·自由基清除能力SA%，结果如表1：2注：――清除能力为零表1从上而下为各种中药提取物清除DPPH•能力由强到弱的排列，在样品浓度为20ppm的时候，葡萄籽提取物对DPPH·的清除率已达100％。3.2VitC与5种中药提取物对DPPH·的清除作用比较通常，当SA%值在15%～75%之间时，该值与提取物浓度成正比，但当SA％值超过这一范围时，尤其在高自由基清除能力的情况下，SA％值不随提取物浓度增加而增加。因此，为了准确评估那些SA%值较大的提取物的抗氧化活性，将表1中浓度为200ppm时，自由基清除能力较强的5种样品进行细致的试验，即以几种较小的相近浓度的样品溶液进行试验。[4]分别配制5ppm、10ppm、20ppm三种浓度的样液进行试验。结果如图1：图1VitC与5种中药提取物对DPPH·的清除作用比较如图1所示，VitC的DPPH清除能力与葡萄籽提取物DPPH清除能力一致，其余4种中药提取物的DPPH·自由基清除能力依次为：银杏黄酮＞红景天提取物＞枳椇子提取物＞丹参提取物。3.2.123种中药提取物还原能力的测定分别在700nm比色的结果如表2，VitC在1mg/ml时，A700nm读数为1.597。3从表2可知，23种中药提取物与VitC比较，其还原能力均不如VitC。在这23种中药提取物中葡萄籽提取物的还原能力最强。四、结论本实验测定了古代养生汉方常用中药提取物中23种中药提取物的DPPH·自由基清除能力和还原能力，证明葡萄籽提取物、银杏黄酮、红景天提取物、枳椇子提取物、丹参提取物、银杏叶提取物、红花提取物、甘草提取物的DPPH·清除能力和还原能力较强：在浓度为100ppm时对DPPH·自由基的清除能力达到了80％以上，特别是葡萄籽提取物，在浓度为20ppm时，清除率已达100%，与VitC相近。而且所有中药提取物均随其浓度的增大，对于DPPH·自由基的清除能力也在增强，呈现一定量效关系；在浓度为5mg/ml和10mg/ml时，葡萄籽提取物，枳椇子提取物，红景天提取物，丹参提取物，红花提取物的还原能力最强，而且本实验以浓度为1mg/ml的VitC作对照，葡萄籽提取物在浓度为10mg/ml时，还原能力甚至大于当VitC为1mg/ml时的还原能力。五、讨论423种中药提取物的有效成分查资料表明，23种中药提取物中具有抗氧化性的主要成分如表3：如表3，中药种类不同，其清除自由基和还原能力不同，可能与提取方法、有效成分及含量有关。酚类物质含量高的中药提取物的清除DPPH·能力和还原能力如表3所示，葡萄籽提取物的抗氧化活性在所有的样品中最强，远远高于其它中药提取物，这与它所含成分有关，葡萄籽提取物中的原花青素含量可高达95％，其主要由不同数量的儿茶素、表儿茶素及表儿茶素没食子酸酯聚合而成，其低聚体有强抗氧化活性，以高效、低毒、高生物利用率而著称，是迄今为止所发现的最有效的自由基清除剂之一，因此它是抗氧化物质的良好来源，有进[5]一步研究和开发的价值。5.3黄酮类物质含量高的中药提取物的清除DPPH·能力和还原能力枳椇子提取物、银杏黄酮、红景天提取物、银杏叶提取物及山楂提取物等的抗氧化活性其次，[4]其主要成分为黄酮类及皂苷类。陈季武等应用DPPH·分光光度法测定研究了11种天然的黄酮类化合物清除DPPH·的能力，结果表明，11种都能有效地清除DPPH·，与本试验结果吻合。在本试验中，银杏黄酮在浓度为20ppm时，对DPPH·的清除率已达56％，究其机理可能为银杏黄酮黄酮苷的含量较高。枳椇子提取物、银杏叶提取物等都含有大量的黄酮苷，故其对DPPH·都有强的清[6]除能力。红花提取物中含有8种黄酮醇化合物，经鉴定是：山奈酚、槲皮素、6－羟基山奈酚、山奈酚－3－葡萄糖苷、槲皮素－7－葡萄糖苷、槲皮素－3－葡萄糖苷、山奈酚－3－芸行糖苷、芦丁，故其在一定浓度下具有较强的DPPH·清除能力。而且黄酮类是一类具有酚羟基的化合物，可[8]以提供氢原子给自由基，从而很好的与自由基结合，其还原能力仅次于葡萄籽提取物5.4多糖类物质含量高的中药提取物的清除DPPH·能力5此次试验得出黄芪提取物、枸杞提取物、人参提取物等对DPPH·清除率很低，还原能力也很差。[9]其主要成分均为多糖，据文献报道，多糖具有抗氧化活性,但是其作用机制可能并非直接清除此种自由基或是具有还原能力。综合上面几点，酚类抗氧化性较强,黄酮类其次,多糖较弱,可能是因为其结构不同或者是其含量不同。本文选取了常用的23种中药提取物，证实了富含酚类物质的葡萄籽提取物的抗氧化活性[10]最强。抗氧化剂尚需在有效成分的抗氧化机理、多组分协同作用方面继续研究。参考文献：[1]张苗海.未病与汉方研究[J]，国外医学中医中药分册,2005，26(4:207-211.[2]胡喜兰，韩照祥，陶莹，李静，陈燕.DPPH法测定17种植物的抗氧化活性[J]，食品科技，2006（10）：264-268.[3]向志军，赵广荣，元英进，郭治昕.复方丹参的体外抗氧化活性研究[J],2006，37（2）：127-131.[4]陈季武，胡斌，赵实，邓玉，秦海燕.天然黄酮类化合物清除DPPH·的构效关系[J]，发光学报，2005，26（5）：664-668.[5]李春阳、许时婴、王璋.食品与生物技术学报[J],2006，25（2）：102-106.[6]蔡奕文，赵谋明，彭志英．天然抗氧化剂发展近况Ⅱ[J]