基因工程复习提纲-完善

复习提纲1．什么是基因？基因：DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。2．基因工程的诞生基因工程诞生于1973年。1973－1974年，美国科学家科恩等以大肠杆菌为材料， 成功地进行了三次基因工程试验。试验结果证明，用基因工程可以打破不同物种间在亿万年中形成的天然屏障，任何不同种类生物的基因都有可能通过基因工程技术而组合到一起。人类进入了激动人心的基因工程时代。3．基因工程的定义及三大基本元件。定义：基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组 DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。三大基本元件：限制性核酸内切酶（restrictionenzymes）/DNA连接酶（ligase）/基因工程载体（vector）4．基因工程的研究内容⑴从生物有机体复杂的基因组中，分离出带有目的基因的 DNA片段；（2）在体外，将带有目的基因的DNA片段连接到能够自我复制并具有选择标记的载体分子上，形成重组DNA分子；⑶将重组DNA分子引入（转）至愎体细胞（亦称宿主细胞或寄主细胞）;（4） 从大量的细胞繁殖菌落中，筛选出具有重组 DNA分子的细胞克隆;（5） 将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出所需要的物质。5．基因工程的技术准备及技术支撑。技术准备技术支撑：核酸凝胶电泳技术核酸分子连接技术/细菌转化技术/DNA序列分析技术/寡核苷酸合成技术/基因定点突变技术/聚合酶链式反应（PCR技术5．基因工程的基本用途分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源大规模生产生物活性物质设计、构建生物的新性状甚至新物种基因工程在农业生产中的应用提高植物的光合作用效率2.提高豆科植物的固氮效率3.转基因植物4.转基因动物基因工程在工业中的应用1.纤维素的开发利用2.酿酒工业基因工程在医药上的应用用转基因植物或动物生产药物2.用微生物生产药物3.设计高效高特异性的生物制剂4.研制疫苗5.基因诊断6.法医鉴定7.基因治疗基因工程在环境保护中的应用检测水污染2.生物降解7．核酸酶的分类根据核酸底物分RNA®(Rnase)/DNA酶(Dnase)/底物非专一性核酸酶；根据作用方式分内切核酸酶(endonuclease)/外切核酸酶(exonuclease)；根据对底物碱基专一性分碱基专一性核酸酶(切割部位的碱基序列高度专一性)非碱基专一性核酸酶(切割部位的碱基序列随机性)8．细菌中的防卫系统：限制与修饰现象。细菌在其感受态的生理条件下，很容易吸收外源 DNA进入体内。这种感受态可以是人为的，也可以是在自然条件下发生的。如果细菌不加限制地接受所有的外源 DNA，细菌本身就会很快发生遗传变异甚至死亡。限制性核酸内切酶：可以帮助细菌限制外来 DNA的入侵甲基化酶：对该特异位点的碱基进行甲基化修饰，被修饰的 DNA就不再被相应的限制酶切割了。细菌自身的DN■—受到甲基化修饰，得以保存。外源入侵的DN■—未来得及甲基化，被降解。9•作为分子克隆宿主菌的大肠杆菌(如 DHa)的必须条件rec基因缺陷型的突变体，保证必须不与外来 DNA分子发生遗传重组；限制系统缺陷或限制与修饰系统均缺陷的菌株，保证外来 DNA分子不会受其限制酶的降解。10•限制性核酸内切酶最重要的是哪一类？II型(2)命名II型限制性内切酶的基本特征识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构某些限制酶在非标准反应条件下，可能导致酶的识别序列特异性发生改变(4)回文结构序列正读和反读是一样的，即有一个中心对称轴，从这个轴朝两个方向读序列是完全一样的。(5)限制性内切酶形成的末端结构粘末端：两条链上的断裂位置是交错和对称围绕着一个对称轴排列，这种形式的断裂结果形成具有粘末端的DNA片段；平末端：两条链上的断裂位置是处在一个对称轴的中心，这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片段。(6)Staractivity一些限制性内切酶在某些反应条件变化时酶的专一性发生改变，如甘油浓度过高、反应液离子强度过低、pH改变、有机溶剂的影响等条件，酶切割位点专一性发生改变。同裂酶：一类来源不同，但识别靶序列相同，切割位点可以相同也可以不同的酶。同尾酶：一类来源不同，识别靶序列不同，但是都产生相同的粘性末端的酶。同位酶：一类识别靶序列相同，但切割位置不同的酶。限制酶的识别序列与DNA的来源无关，不带有种的特征，对各种DNA都普遍适用;在基因克隆中使用的是失去甲基化酶的大肠杆菌(识别序列中特定核苷酸的甲基化会强烈抑制限制酶的活性)DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶I(DNApolI)的用途：缺口平移(Nicktranslation )5'f3'的核酸外切酶和聚合酶活性协同作用，使缺口向前推进大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(Klenow)性质：Klenow酶仍拥有5'—3'的DNA聚合酶活性和3'—5'的核酸外切酶活性，但失去了5'—3'的核酸外切酶活性。用途：补平由核酸内切酶产生的 5'粘性末端/cDNA第二链的合成T4-DNA聚合酶性质：5'—3'的DNA聚合酶活性和3'—5'的核酸外切酶活性/在无dNTP时，可以从任何3'-OH端外切/在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止/在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位用途：切平由核酸内切酶产生的3'粘性末端依赖于RNA的DNA聚合酶(反转录酶)基本特性：以RNA为模板聚合cDNA链/双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链主要用途：将真核基因的mRNA专录成cDNA构建cDNA文库/对具有5'突出端的DNA片段的3'端进行补平和标记、制备探针DNA连接酶：形成磷酸二酯键(DNA连接酶并不能连接两条单链 DNA分子或环化单链DNA分子，被连接的DNA链必须是双螺旋的一部分)防止连接反应中载体或目的基因的自我环化双酶切2.碱性磷酸酶去除5'-P3.调整反应物比例(P102)平末端DNA片段的连接方法直接用T4DNA连接酶连接(需ATP和高浓度酶，效率不高)TdT同聚物加尾法用衔接物连接平末端DNA分子(T4DNALigase)3.DNA接头连接法核酸酶(nuclease)单链核酸内切酶——S1核酸酶的基本反应：内切单链DNA或RNA内切带缺口或裂口的双链DNA或RNA用途：去除DNA片段的单链突端，使之成为平端/去除cDNA合成时形成的发夹结构/施行S1核酸酶保护实验，分析转录产物/成熟mRNA与基因组DNA杂交后，结合此酶水解，可定位内含子/修整渐进性删除突变的末端单链内切、双链外切的核酸酶： Bal31核酸酶特性：从双链DNA的两端3'和5'同时开始水解两条链，对两条链的水解速度不一定相等，结果是双链从两头缩短，彻底水解为5‘单核苷酸。核酸修饰酶(NucleicAcidmodificationenzymes)(1)末端脱氧核苷酰转移酶(TdT)基本特性：不需要模板的DNA聚合酶，在3'端随机掺入dNTPs用途：给载体或目的DNA加上互补的同聚物尾/DNA片段3'末端的同位素标记碱性磷酸单酯酶(CIP、BAP)反应：去除5'-P，成为5'-OH目的：1.去除载体DNA5端磷酸，防止载体自身环化，提高重组率去除DNA和RNA的5'-P，然后用T4多聚核苷酸激酶作用下进行末端标记。（3）T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）特性：催化ATP的g-磷酸基团转移至DNA或RNA勺5'-OH末端上用途：用于探针的末端同位素标记13．核酸凝胶电泳结果处理软件： quantityone（了解）14．基因克隆载体：概念：能够运载外源DNA片段（目的基因）进入受体细胞，具有自我复制能力，使外源DNA片段在受体细胞中得到扩增和表达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类 DNA分子种类：质粒（plasmid）/噬菌体或病毒DNA/考斯质粒（cosmid）与噬菌粒/人造染色体载体功能：1.运送外源基因高效转入受体细胞2.为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件应具备的条件：可转移性：具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性具有与受体细胞相适应的复制位点（ ori，originofreplication）或整合位点具有较高的外源DNA的装载能力多克隆位点（multiplecloningsite,MCS）：具有多种限制性内切酶的单一切点具有合适的筛选标记（selectionmarker）安全，不含对受体细胞有害的基因，不会任意转入受体细胞以外的其他生物细胞中（1） 质粒：质粒是生物细胞内固有的、能独立于染色体而自主复制，并被稳定遗传的一类核酸分子。天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即 cccDNA（2） 什么是质粒的不相容性及其机制；不相容性：任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质粒组成不相容性群。机制：两种含有不同复制子结构的质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内。两种含有相似复制子结构的质粒，在复制时受同一种拷贝数控制系统的控制而产生竞争，致使两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势，并逐步将另一质粒“稀释”淘汰。（3） 根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型（严紧型和松弛型），其中氯霉素的作用（蛋白质合成抑制剂，使染色体 DNA合成受阻，松弛型继续扩增，极大提高拷贝数）；根据是否可以在细胞间转移，质粒可以分为（结合型和非结合型）；（4） 质粒的性质自主复制性（质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制）、不相容性、可转移性（5） 一个合格质粒的组成要素具有复制起始位点（Ori）或整合位点具有两种易被检测的选择性标记（抗生素抗性基因）具有多种限制酶的单一识别位点（多克隆位点MCS）具有尽可能小的相对分子质量属于松弛型复制属于非传递型质粒具有较高的外源DNA装载能力P/E（Promoter/Enhancer）：启动子/增强子T（Terminator）:终止信号poly（A）加尾信号：稳定mRNA（6） 如何阅读质粒图谱第一涉=首先看0“的位置，了解质粒的类型〔原核/■真核/穿檢虎粒）第二涉=再看端选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。Cl）A>ipr水解F—内醞胺环，解除氨莘的毒性。（2）tetr可以阻止四环素进入细胞®⑶cainr生咸氯看希经巴醜基衍注胸.使N貴去专性。（4）neortkanr）氨基檐音磷醱料移豳便G4W（■怅耶霉素衍生糊）尖活C6）hygt使潮毒素p失活*第三步=看參克隆傥点〔帐引。它具有爭亍限制酶的单一切点。便于外源基因的插入°如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某审隔志基因的失活，而便干筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。第四步：再看外源D皿插人片段大小f巔粒一般只育谿纳小干10Kb的外源D皿片段。一般来说，外源DMA片段越长.越难插入，越不穩定，转化效率越低*弟五步：是否含有養达乘统元件，即启动于一核糖体维合位点一竞隆位点一转录魏止信号*遠是朋来战别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即战拘表达载体。选用那种载体，还是宴职实验目的为准無。眉动千一核糖体结會位点一克隆位点一转录绍止信号启动手一惺遴DMA转录的DNAI顾序，遞个区域常往基因或操纵千编码顺斥的上游*<DNA*于上可以与RN血辺特异性结合并使之开贻转录的部位，但启动子本身不被转录。増飆于/沉默于_为真核基凶组〔包摘真核病毎基因组）中的一神具有堵程邻近基凶转录过程的调控顺序f其作用与増强手所在的位置或方向无关*即在所调控基因上游強下游均可发挥作用。■/沉默子一负增强千*员训控序列。核握体缩會位点/趙始童码/SD呼列（Rbs/AGU/SDs）:冋矗有核檐体的两亍塘舍位点.对干原核而盲是也UG〔起始密码）利ED序列.转录终止J帧序〔终止子）/翻译线止密玛子：结构基因的最后一个外显子中有fAATAAA的保守序歹％此位点doom—wtreaui有一隈GT或TW丰磴，这2部分共同构成pol_y〔心）加尾信号心结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列，此位点down—stream有一段G'T或T富丰区，这2部分共同构Ji^pclyU）加尾信号*回苔有人之前提出的一个问题：油什么质粒图谱上有的箭头^时針有的箭头逆时宅杠那其实是代表两^DNA醛即嚴粒是环状双链DMA,它的启动子等在其中一条链上，而它的抗性基因在另一条德上.（7） 重要的大肠杆菌质粒载体PBR322松弛型复制/氯霉素可扩增/拷贝数每细胞50-100/用于基因克隆PUC18/19拷贝数2000-3000/cell装有多克隆位点（MCS正选择颜色标记lacZ'（E.coli的lacZ基因的5'-序列，表达半乳糖苷酶的 a片段。LacZ'的上游包括乳糖操纵子上的启动子 Plac和操纵基因O）用于基因克隆和测序（8）蓝白斑筛选：a互补效应PUC18/19质粒上的LacZ基因包括：一段卩-半乳糖苷酶的启动子、编码a肽链的区段、一个MCSMCS位于编码a肽链的区段中，是外源DNA的选择性插入位点，但其本身不影响载体编码a肽链的功能活性。当菌体中含有带 lacz‘的质粒后，质粒lacz'基因编码的a肽链和菌株基因组表达的 N端缺陷的卩-半乳糖苷酶突变体互补，具有与完整卩-半乳糖苷酶相同的作用， 使X-gal生成蓝色物质，这种现象即a-互补。用这种质粒进行克隆时，如果外源基因破坏了 LacZ的编码序列，所产生的蛋白产物就会丧失 a-互补能力，在含有X-gal和IPTG的平板下形成无色菌斑，可用于重组子的筛选。（9）碱裂解法制备质粒中溶液I、II、III的作用溶液I:调节pH,悬浮菌体，抑制DNase的活性溶液II:裂解细胞膜（主要是NaOH，临用前配制，SDS是为沉淀染色体DNA乍准备溶液III:中和NaOH促进SDS沉淀蛋白质和基因组DNA（10）质粒改造策略删除不必要的DNA区域，缩小分子量，提高外源DNA片段的装载量。灭活某些质粒的编码基因。加入易于识别的选择标记基因。选择标记基因内引入内切酶的识别及酶切位点的序列---多克隆接头（Polylinker）。加入特殊的基因表达调控元件。15•大肠杆菌的入噬菌体DNA的两种状态：溶原状态和溶菌状态， DNA重组技术一般需要入噬菌体进入（溶菌状态）。（1）入噬菌体DNA载体的类型及装载容量：野生型 l-DNA包装的上限为51kb插入型载体：自身长37kb，装载容量0kb-14kb取代型载体：自身长26kb，装载容量10kb-25kb入噬菌体DNA载体的优点入-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌入-DNA载体的装载能力为25kb，远远大于质粒的装载量重组入-DNA分子的筛选和提取均较为方便入-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达外源基因什么是考斯质粒（cosmid）,其装载容量？考斯质粒：一类人工构建的含有l-DNAcos序列和质粒复制子的特殊类型的载体。装载容量：30kb-45kb噬菌粒（phagemidorphasmid）及其装载容量噬菌粒：一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体。装载容量BAC：50kb-300kbYAC：350-400人造染色体载体主要包括哪两种。 BAC&YAC基因克隆受体细胞应具备的条件限制性缺陷型重组整合缺陷型具有较高的转化效率具有与载体选择标记互补的表型感染寄生缺陷型常用的基因克隆受体细胞大肠杆菌酵母菌：酿酒酵母和毕赤酵母哺乳动物细胞：CHO核酸序列分析：DNAMAN了解）5050目的基因的克隆方法基因分离的物理方法/鸟枪法/cDNA法/PCR法/化学合成法22•什么是鸟枪法克隆目的基因(1)鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离(不能除去真核生物基因中的内含子结构)。鸟枪法克隆目的基因的基本步骤。染色体DNA的切断-->与载体连接-->转化受体细胞-->筛选含有目的基因的重组子鸟枪法克隆目的基因过程中染色体 DNA切断的方法。超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端。全酶切：片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，大小不可控。部分酶切：片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整。23•什么是cDNA法克隆目的基因cDNA法是以mRNA为模版，用反转录酶合成互补DNA的方法。cDNA法克隆目的基因中cDNA第二链的合成方法有哪几种： 自身引导法、置换合成法、引导合成法(获得的双链cDNA能保留完整的5'端序列)。cDNA法克隆目的基因的局限性：并非所有的mRNA分子都具有polyA结构；细菌或原核生物的mRNA半衰期很短；mRNAE细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难；仅限于克隆蛋白质编码基因。24•基因库与基因文库概念基因库：特定生物体基因组上所有基因的集合(天然存在) 。基因文库：从特定生物个体中分离的全部基因， 这些基因以克隆的形式存在(人工构建)。基因组文库：含有全部基因cDNA文库：含有全部编码蛋白质的结构基因基因文库构建的基本策略基因组文库：鸟枪法构建，材料来自染色体 DNAcDNA文库：cDNA法构建，材料来自mRNAcDNA文库的信息量远小于基因组文库。基因文库的完备性(4)基因文库的完备性基因文库的完备性是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概率’它与基因文库所含最低克隆数N之间的关系可用下式表示：N=其中：P-任一基因被克隆(或存在于基因文库中)的概率f-克隆片段的平均大小/生物基因组的夫小例如，人的单倍体DNA总怅为Z9x109bpf基因文库中克隆片段的平均大小为佰kb,则构建一个完备性为09的基因文库至少需要45万个克隆;而当完备性提高到0.9999时，基因文库至少S®180万个克隆。

cDNA文库组建步骤TotalRNA的提取«mRNA的分离cDNA双链的合成*载体的制备cDNA双链和载体的连接*转化或转染•快速鉴定pBlueScriptcDNA库扩增化学合成法克隆目的基因化学法全基因合成的策略：小片段粘接法、补丁延长法、大片段酶促法DNA化学合成的用途：合成天然基因；修饰改造基因；设计新型基因；制备探针、引物、接头等。实验技术(了解)：Gateway技术(Invitrogen)、In-FusionPCR技术(TaKaRa、Bioedit软件PCF技术的原理在微量离心管中，加入适量的缓冲液，微量的模板DNA,四种脱氧核苷酸，耐热性DNA聚合酶,一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段的循环合成DNA每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍。一般样品经过 30次循环,可使基因的拷贝数达到数百万。(1、类似于DNA勺天然复制过程，其特异性依赖于寡核苷酸引物PCF过程：由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成变性：94C左右，使双链DNA模板解离成为单链；复性：55C左右，引物与模板DNA单链互补配对结合；延伸：72C左右，“模板-引物结合物”在DNA聚合酶作用下，以dNTP为原料，以靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成新的 DNA链。重复“变性--退火--延伸”的循环，可获得大量的新DNA链，而且这种新链又可成为下次循环的模板，从而指数级地获得大量DNA产物，数小时内可使目的基因的数量扩增数百万倍。PCF技术依据的生物学理论：碱基互补配对原理、半保留复制原理PCR技术依赖于DNA勺变性和复性DNA的变性：加热或强酸、碱性作用可以使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离，形成单链DNADNA的复性(退火)：解除变性的条件后，变性的单链DNA可以重新结合起来，形成双链，其原有的特性和活性可以恢复。PCR反应体系的组分及反应程序（PPT有实例）PCR反应条件（1）引物引物长度：约16-30bp，太短影响引物与模板的配对四种碱基随机分布，在3'端不存在连续3个G或C,这样易导致错误引发（falsepriming）引物中G+C含量：通常为 40-60%,可按下式粗略估计引物的解链温度一一 Tm^4（G+C）+2（A+T）引物3'端：关键碱基,必须与模板完全配对,最好对应密码子的第一或第二位核苷酸,以减少由于密码子摆动产生的不配对引物内部：尤其在3'端，不存在发夹结构（Hairpin）、二聚体（Dimer）；两引物之间：尤其在3'端，不能互补以防出现引物二聚体（crossdimer）,减少产量；两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性引物5'端：对扩增特异性影响不大,可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等。通常应在5'端限制酶位点外再加3-4个保护碱基引物不产生falsepriming：不与模板结合位点以外的序列互补,避免错误引发PCR扩增（2）DNA聚合酶：一般PCR中聚合酶的出错率为1X10-5/每碱基对；普通聚合酶（A末端）和高保真聚合酶（平末端）（3） Mg+的作用DNA聚合酶的激活剂，可影响酶的活性和真实性，还影响引物退火和解链温度， 影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。在 PCF反应混合物中，应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团（如磷酸基团、EDTA等可能影响M『离子浓度的物质），以保证最适Mg+浓度（4）PCR中延伸补齐的作用：72°C,5min—10minPCR勺类型（了解）：不对称PCR反向PCR（reversePCR）多重PCR（复合PCR、LP-PCR（Labelledprimers）、锚定PCR（anchoredPCR,A-PCR、原位PCR反转录PCR（RT-PCR）荧光定量PCR（real-timePCR）、PCR技术的应用：基因克隆、遗传病的诊断、恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因）诊断、基因鉴定PCR法获取目的基因的两种基本策略： T载体、酶切位点（其他： Gateway技术、In-fusion技术）,见补充。基因克隆操作的基本过程（1） DNA的体外重组（一）——切工具：限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）作用对象：目的基因片段、载体目的：获得具有互补粘性末端（或平末端）的线性目的基因片段和线性化载体酶切反应体系及条件（PPTW实例）；（2） DNA的体外重组（二）一一接工具：DNA连接酶（DNAligase）作用对象：具有互补粘性末端（或平末端）的线性目的基因片段和线性化载体目的：获得含有目的基因的环状载体DNAligase介导的体外连接的反应体系及条件（ PPT有实例）；DNA体外重组后，有时需要鉴定目的基因的连接方向；同尾酶切割形成的粘性末端相互连接后， 目的产物中对应位置的序列不再是原来的酶切位点（3）重组DNA分子的转化C『诱导的转化原理：Ca诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌， 1970年建立。其原理是Ca与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用， 使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态。处于感受态的细菌，容易接受外源 DNA关键点转化所用DNA容液的体积不应超过感受态细胞体积的 5%热击过程中不要摇晃离心管；检测转化子的Amp抗性时，转化子铺平板时密度应低一些（104菌落/板）；转化子于37C培养不要超过20小时。因为铺板过密或培养时间过久会导致平板上出现对 Amp敏感的卫星菌落。转化过程中37C温育菌体使细菌复苏时的转速不可过高， 为得到较高的转化效率，应使转速小于225rpm。当用于涂板的转化液过多时，应离心浓缩（ 4100rpm,5min）,并用适量SOC液体培养基重悬菌体沉淀后涂板。刚进行完转化的菌体比较脆弱，涂板时应轻轻涂布。感受态细胞其他转化方法（细菌原生质体的转化，针对 Gram-n、入噬菌体DNA的转染、电穿孔转化）；转化率的概念及相关计算概念：每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。由于在一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子， 因此转化率的定义也可以表征为：每微克载体DNA专化后，能够接纳DNA的受体细胞数目，即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞无法生长）计算实例（2）转化率的用途利用转化率和重组率等参数可以帮助设计DNA重组实验规模例如，某一DNA重组实验的重组率为20%,转化率为10"隅载体，经切、接处理后的载体转化率比天然的载体低100倍，欲获得1A个重组克隆，需投入多少载体DNA进行重组实验？若重组率为100%,则转化后产生个重组克隆需要；104/（107/pgX10-2）=0,1pg载体DNA考虑到实验系统的重组率为20%,所以实际投入载体应为：0.1/20%=0.5pg载体DNA载体投入量确定后，外源DNA的投入量即可按10:1的要求算出（5pg）,甚至还可以估算需要涂布多少块平板进行筛选。转化子的筛选和鉴定(检)载体遗传标记检测：抗药性筛选法(氨苄青霉素： Amp或Ap；卡那霉素：Kan；壮观霉素：Sp；四环素：Tc)、营养缺陷型筛选法、显色筛选法、克隆DNA序列检测：限制性酶切图谱法、菌落/噬菌斑原位杂交法(了解)、DNA序列分析法(了解)外源基因产物检测：蛋白质生物功能测定法、蛋白质生物结构鉴定法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法重组率的定义(含有外源DNA的重组分子数/载体分子总数，一般实验条件下约为25%-75%及提高重组率的方法：(1)提高外源DNA片段与载体的分子比(5:1-10:1);(2)载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团(防止载体自连) ；(3)加装同聚尾末端。感受态细胞的概念外源基因在大肠杆菌中的表达大肠杆菌核糖体结合位点RBS的四个特征结构要素。位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列5'-UAAGGAGG-3'：即Shine-Dalgarno(SD)序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16SrRNA3'端区域3'-AUUCCUCC-并与之专一性结合，将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译。翻译起始密码子：大肠杆菌绝大部分基因以 AUG作为阅读框架的起始位点，但有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子。SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成基因编码区5'端若干密码子的碱基序列生物体对密码子的使用具有偏爱性。其决定因素是：生物基因组中的碱基含量：在富含AT的生物(如单链DNA噬菌体0X174)基因组中，密码子第三位上的U和A出现的频率较高；而在GC丰富的生物(如链霉菌)基因组中，第三位上含有G或C的简并密码子占90%以上的绝对优势。密码子与反密码子相互作用的自由能：性中等强度规律细胞内tRNA的含量包涵体(InclusionBodies，IB)概念：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体(InclusionBodies，IB)。包涵体的变性-复性，见补充。蛋白产物N端信号肽序列的存在是蛋白质分泌表达的前提条件。融合蛋白的概念将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起，并作为一个开放阅读框进行表达。由这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白。在这种融合蛋白结构中，通常受体细菌的蛋白部分位于N端，异源蛋白位于C端。通过在DNA水平上人工设计引入蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点，可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放异源蛋白。改善基因工程菌不稳定性的策略：改进载体受体系统；施加选择压力；控制目的基因的过量表达；优化基因工程菌的培养工艺。外源基因在酵母菌中的表达(1)目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括：酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母、巴斯德毕赤酵母、非洲酒裂殖酵母、多型汉逊酵母。其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想。酵母菌中的野生型质粒主要包括：酿酒酵母中的 2口环状质粒、乳酸克鲁维酵母中的线状质粒。酵母菌的转化程序：酵母菌原生质体转化法(CsT和PEG；碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化(碱金属离子如 Li+、PEG热休克处理)；酵母菌电击转化法外源基因在酵母菌中表达的限制因素： 外源基因稳态mRNA勺浓度；外源基因mRNA的翻译活性；酵母菌对密码子的偏爱性。(5)巴斯德毕赤酵母表达系统巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能在低廉的甲醇培养基中生长，甲醇可高效诱导甲醇代谢途径中各酶