金免疫标记技术课件

知识目标技能目标素质目标1.掌握金免疫标记技术原理和分类2.了解标记物的制备3.了解金免疫检测的临床应用1.会金免疫标记物的制备操作2.会熟练操作金免疫检测过程树立严肃认真、实事求是、高度负责的科学态度，具有良好的职业素质和崇高的职业道德。

任务目标知识目标技能目标素质目标1.掌握金免疫标记技术原理和分类1.1任务对象肺炎支原体抗体检测

任务对象肺炎支原体抗体检测2

任务过程

复习提问

案例导入

讲解与示教学生操作讨论分析

评价、考核

课后思考题教学环节2′30′2′10′40′5′1′任务过程复习提问案例导入讲解与示教学3

患儿，女，11岁，间断发热1周，伴咳嗽3天。体温最高39。1度，病程第2天查血常规正常，诊断“呼吸道感染”并静滴“阿奇霉素”3天，无明显改变，即而出现咳嗽，为阵发性刺激性咳嗽，少痰，胸片提示：双肺纹理增粗，右上肺片影。复查血常规仍正常。患儿肺部感染系哪种病原体所致？如何快速诊断？案例导入患儿，女，11岁，间断发热1周，伴咳嗽3天。体温最高394

斑点金免疫层析法演示

肺炎支原体诊断试剂盒讲解与示教斑点金免疫层析法演示肺炎支原体诊断试剂盒讲解与示教5

二用采血针采指尖血一洗净双手四立即加1-2滴缓冲液

三将1滴指尖血滴入加样孔操作二用采血针采指尖血一洗净双手四立即加1-2滴缓冲液三6步骤5：15分钟读取结果

？？结果？？结果步骤5：15分钟读？？结果？？结果7老师纠正点评

学生操作一位学生操作演示学生分组再操作老师纠正学生操作一位学生学生分组8讨论分析讨论分析9胶体金标记技术(Immunogoldlabelingtechnique)

是以胶体金作为示踪标记物，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。讨论分析胶体金标记技术(Immunogoldlabelingt10胶体金标记技术讨论分析胶体金标记技术讨论分析11制备高质量胶体金的注意事项G区：金标特异性抗体(兔型)1Mol/LK2CO30.胶体金标记技术(Immunogoldlabelingtechnique)是以胶体金作为示踪标记物，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。要制备其它直径的金颗粒，则按表15-1所列的数字75ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。（3）15nm、18nm～20nm、30nm或50nm胶体金颗粒的制备：取0.要制备其它直径的金颗粒，则按表15-1所列的数字45µm）过滤，以除去其中的聚合物和其它可能混入的杂质。患儿肺部感染系哪种病原体所致？如何快速诊断？1Mol/LK2CO30.将A液、B液分别加热至60℃，在电磁搅拌下迅速将身形成免疫分析过程后的颜色标记G区：金标特异性抗体(兔型)根据需要迅速加入1％枸橼酸三钠水溶液4ml、2.75ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。身形成免疫分析过程后的颜色标记示踪剂：以胶体金为指示剂，本斑点金免疫渗滤测定法（dotimmuno－goldfiltrationassay,DIGFA）此法原理是在硝酸纤维膜下垫有吸水性强的垫料，即为渗滤装置。金免疫法能测出抗体，如（一）金免疫检测原理胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。讨论分析制备高质量胶体金的注意事项（一）金免疫检测原理胶体金是由氯金12Geobegan等将胶体金标记抗体用于普通光镜下检测B淋巴细脑表面膜免疫球蛋白，建立了光镜水平的免疫金染色。Faulk和Taylor首创胶体金标记免疫电镜技术胶体金标记技术进一步发展应用于免疫转印、流式细胞术、液相免疫测定、固相斑点金／银染色及斑点金免疫渗滤测定法等多种标记免疫检测方法1971年1978年近年来讨论分析Geobegan等将胶体金标记抗体用于普通光镜下检测B淋巴细13讨论分析枸橼酸三钠还原法鞣酸—枸橼酸钠还原法根据不同的还原剂可以制备大小不同的胶体金颗粒。常用来制备胶体金颗粒的方法讨论分析枸橼酸三钠还原法鞣酸—枸橼酸钠还原法根据不同14胶体金的制备

1．枸橼酸三钠还原法（1）10nm胶体金粒的制备：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加入1％枸橼酸三钠水溶液3ml，加热煮沸30min，冷却至4℃，溶液呈红色。（2）15nm胶体金颗粒的制备：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加入1％枸橼酸三钠水溶液2ml，加热煮沸15min～30min，直至颜色变红。冷却后加入0.1Mol/LK2CO30.5ml，混匀即可。（3）15nm、18nm～20nm、30nm或50nm胶体金颗粒的制备：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加热煮沸。根据需要迅速加入1％枸橼酸三钠水溶液4ml、2.5ml、1ml或0.75ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒则分别为15nm、18～20nm、30nm和50nm讨论分析胶体金的制备1．枸橼酸三钠还原法讨论分析152．鞣酸—枸橼酸钠还原法

A液：1％HAuCl4水溶液1ml加入79ml双馏水中混匀。

B液：1％枸橼酸三钠4ml，1％鞣酸0.7ml，0.1Mol/LK2CO3液0.2ml，混合，加入双馏水至20ml。将A液、B液分别加热至60℃，在电磁搅拌下迅速将B液加入A液中，溶液变蓝，继续加热搅拌至溶液变成亮红色。此法制得的金颗粒的直径为5nm。如需要制备其它直径的金颗粒，则按表15-1所列的数字调整鞣酸及K2CO3的用量

讨论分析2．鞣酸—枸橼酸钠还原法讨论分析16（1）玻璃器皿必须彻底清洗，最好是经过硅化处理的玻璃器皿，或用第一次配制的胶体金稳定的玻璃器皿，再用双馏水冲洗后使用。否则影响生物大分子与金颗粒结合和活化后金颗粒的稳定性，不能获得预期大小的金颗粒。（2）试剂配制必须保持严格的纯净，所有试剂都必须使用双馏水或三馏水并去离子后配制，或者在临用前将配好的试剂经超滤或微孔滤膜（0.45µm）过滤，以除去其中的聚合物和其它可能混入的杂质。制备高质量胶体金的注意事项

讨论分析（1）玻璃器皿必须彻底清洗，最好是经过硅化处理的玻璃器皿，或17（3）配制胶体金溶液的pH以中性（pH7.2）较好。（4）氯金酸的质量要求上乘，杂质少。最好是进口的。（5）氯金酸配成1％水溶液在4℃可保持数月稳定，由于氯金酸易潮解，因此在配制时，最好将整个小包装一次性溶解。制备高质量胶体金的注意事项讨论分析（3）配制胶体金溶液的pH以中性（pH7.2）较好。制备高质18

缺点金标法

优点

灵敏度不如酶标技术一般作为定性，不易定量。讨论分析金标法灵敏度不如酶标技术讨论分析19自带质控对照简便、经济实用符号显示结果快速：全部检测过程仅需3-20分钟。示踪剂：以胶体金为指示剂，本身形成免疫分析过程后的颜色标记讨论分析可单份检测，稳定性好自带质控对照简便、经济实用符号显示结果快速：全部检测过程示踪20斑点金免疫层析试验夹心法竞争法双抗原夹心法双抗体夹心法讨论分析分类斑点金免疫层析试验夹心法竞争法双抗原夹心法双抗体夹心法讨论分21

双抗体夹心法G区：金标特异性抗体(兔型)C区：羊抗兔IgT区：特异性抗体

吸水纸标本讨论分析双抗体夹心法G区：金标特异性抗体(兔型)C区：羊抗兔22身形成免疫分析过程后的颜色标记G区：金标特异性抗体(兔型)A液：1％HAuCl4水溶液1ml加入79ml双馏水中混匀。75ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。根据需要迅速加入1％枸橼酸三钠水溶液4ml、2.这样制成的胶体金颗粒则分别为15nm、18～20nm、30nm和50nm免疫能检测出吗？，下一否则影响生物大分子与金颗粒结合和活化后金颗粒的稳定性，不能获得预期大小的金颗粒。（2）15nm胶体金颗粒的制备：取0.金免疫法能测出抗体，如掌握金免疫标记技术原理和分类A液：1％HAuCl4水溶液1ml加入79ml双馏水中混匀。G区：金标特异性抗体(兔型)调整鞣酸及K2CO3的用量斑点金免疫渗滤测定法（dotimmuno－goldfiltrationassay,DIGFA）此法原理是在硝酸纤维膜下垫有吸水性强的垫料，即为渗滤装置。1Mol/LK2CO30.（1）玻璃器皿必须彻底清洗，最好是经过硅化处理的玻璃器皿，或用第一次配制的胶体金稳定的玻璃器皿，再用双馏水冲洗后使用。合，再加胶体金标记的抗-HCG抗体，形成双抗体夹心复合（1）玻璃器皿必须彻底清洗，最好是经过硅化处理的玻璃器皿，或用第一次配制的胶体金稳定的玻璃器皿，再用双馏水冲洗后使用。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。讨论分析身形成免疫分析过程后的颜色标记讨论分析23竞争法标本G区：金标特异性抗体(兔型)C区：羊抗兔IgT区：标准抗原

吸水纸阳性结果讨论分析竞争法标本G区：金标特异性抗体(兔型)C区：羊抗兔IgT区：24标本G区：金标特异性抗体(兔型)C区：羊抗兔IgT区：标准抗原吸水纸阴性结果讨论分析标本G区：金标特异性抗体(兔型)C区：羊抗兔IgT区：标准抗25讨论分析讨论分析26

斑点金免疫渗滤测定法（dotimmuno－goldfiltrationassay,DIGFA）此法原理是在硝酸纤维膜下垫有吸水性强的垫料，即为渗滤装置。在加抗原（抗体）后，迅速加抗体（抗原），再加金标记第二抗体，由于有渗滤装置，反应很快，在数分钟内即可显出颜色反应。此方法已成功地应用于人的免疫缺陷病病毒（HIV）的检查和人血清中甲胎蛋白的检测。讨论分析斑点金免疫渗滤测定法（dotimmu27以双抗体夹心法HCG为例：标本中HCG与NC膜上抗-HCG结合，再加胶体金标记的抗-HCG抗体，形成双抗体夹心复合物（红色）讨论分析以双抗体夹心法HCG为例：标本中HCG与NC膜上抗-HCG结28考核评分表布置作业1.实验报告评价、考核考核评分表评价、考核29思考题金免疫法能测出抗体，如此简单、方便如何用荧光免疫能检测出吗？，下一次课学习荧光免疫检测，预习相关内容思考题金免疫法能测出抗体，如30老师纠正点评

学生操作一位学生操作演示学生分组再操作老师纠正学生操作一位学生学生分组讨论分析讨论分析32胶体金的制备

1．枸橼酸三钠还原法（1）10nm胶体金粒的制备：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加入1％枸橼酸三钠水溶液3ml，加热煮沸30min，冷却至4℃，溶液呈红色。（2）15nm胶体金颗粒的制备：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加入1％枸橼酸三钠水溶液2ml，加热煮沸15min～30min，直至颜色变红。冷却后加入0.1Mol/LK2CO30.5ml，混匀即可。（3）15nm、18nm～20nm、30nm或50nm胶体金颗粒的制备：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加热煮沸。根据需要迅速加入1％枸橼酸三钠水溶液4ml、2.5ml、1ml或0.75ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒则分别为15nm、18～20nm、30nm和50nm讨论分析胶体金的制备1．枸橼酸三钠还原法讨论分析（1）玻璃器皿必须彻底清洗，最好是经过硅化处理的玻璃器皿，或用第一次配制的胶体金稳定的玻璃器皿，再用双馏水冲洗后使用。否则影响生物大分子与金颗粒结合和活化后金颗粒的稳定性，不能获得预期大小的金颗粒。（2）试剂配制必须保持严格的纯净，所有试剂都必须使用双馏水或三馏水并去离子后配制，或者在临用前将配好的试剂经超滤或微孔滤膜（0.45µm）过滤，以除去其中的聚合物和其它可能混入的杂质。制备高质量胶体金的注意事项

讨论分析（1）玻璃器皿必须彻底清洗，最好是经过硅化处理的玻璃器皿，或自带质控对照简便、经济实用符号显示结果快速：全部检测过程仅需3-20分钟。示踪剂：以胶体金为指示剂，本身形成免疫分析过程后的颜色标记讨论分析可单份检测，稳定性好自带质控对照简便、经济实用符号显示结果快速：全部检测过程示踪一般作为定性，不易定量。胶体金标记技术进一步发展应用于免疫转印、流式细胞术、液相免疫测定、固相斑点金／银染色及斑点金免疫渗滤测定法等多种标记免疫检测方法（2）15nm胶体金颗粒的制备：取0.金免疫法能测出抗体，如以双抗体夹心法HCG为例：标本中HCG与NC膜上抗-HCG结金免疫法能测出抗体，如根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。45µm）过滤，以除去其中的聚合物和其它可能混入的杂质。要制备其它直径的金颗粒，则按表15-1所列的数字斑点金免疫渗滤测定法（dotimmuno－goldfiltrationassay,DIGFA）此法原理是在硝酸纤维膜下垫有吸水性强的垫料，即为渗滤装置。（2）15nm胶体金颗粒的制备：取0.1Mol/LK2CO30.B液加入A液中，溶液变蓝，继续加热搅拌至溶液变此法制得的金颗粒的直径为5nm。斑点金免疫渗滤测定法（dotimmuno－goldfiltrationassay,DIGFA）此法原理是在硝酸纤维膜下垫有吸水性强的垫料，即为渗滤装置。胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。Faulk和Taylor首创胶体金标记免疫电镜技术（2）15nm胶体金颗粒的制备：取0.要制备其它直径的金颗粒，则按表15-1所列的数字1Mol/LK2CO30.身形成免疫分析过程后的颜色标记斑点金免疫渗滤测定法（dotimmuno－goldfiltrationassay,DIGFA）此法原理是在硝酸纤维膜下垫有吸水性强的垫料，即为渗滤装置。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。根据需要迅速加入1％枸橼酸三钠水溶液4ml、2.45µm）过滤，以除去其中的聚合物和其它可能混入的杂质。身形成免疫分析过程后的颜色标记1Mol/LK2CO30.示踪剂：以胶体金为指示剂，本B液加入A液中，溶液变蓝，继续加热搅拌至溶液变01％HAuCl4水溶液100ml，加热煮沸。了解金免疫检测的临床应用45µm）过滤，以除去其中的聚合物和其它可能混入的杂质。斑点金免疫渗滤测定法（dotimmuno－goldfiltrationassay,DIGFA）此法原理是在硝酸纤维膜下垫有吸水性强的垫料，即为渗滤装置。1Mol/LK2CO30.斑点金免疫渗滤测定法（dotimmuno－goldfiltrationassay,DIGFA）此法原理是在硝酸纤维膜下垫有吸水性强的垫料，即为渗滤装置。1Mol/LK2CO30.患儿，女，11岁，间断发热1周，伴咳嗽3天。45µm）过滤，以除去其中的聚合物和其它可能混入的杂质。胶体金标记技术进一步发展应用于免疫转印、流式细胞术、液相免疫测定、固相斑点金／银染色及斑点金免疫渗滤测定法等多种标记免疫检测方法斑点金免疫渗滤测定法（dotimmuno－goldfiltrationassay,DIGFA）此法原理是在硝酸纤维膜下垫有吸水性强的垫料，即为渗滤装置。调整鞣酸及K2CO3的用量75ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。1Mol/LK2CO30.1Mol/LK2CO30.这样制成的胶体金颗粒则分别为15nm、18～20nm、30nm和50nmG区：金标特异性抗体(兔型)调整鞣酸及K2CO3的用量胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。B液加入A液中，溶液变蓝，继续加热搅拌至溶液变75ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。G区：金标特异性抗体(兔型)G区：金标特异性抗体(兔型)制备高质量胶体金的注意事项根据需要迅速加入1％枸橼酸三钠水溶液4ml、2.会金免疫标记物的制备操作制备高质量胶体金的注意事项胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。（3）15nm、18nm～20nm、30nm或50nm胶体金颗粒的制备：取0.1Mol/LK2CO3液0.患儿，女，11岁，间断发热1周，伴咳嗽3天。01％HAuCl4水溶液100ml，加热煮沸。身形成免疫分析过程后的颜色标记45µm）过滤，以除去其中的聚合物和其它可能混入的杂质。金免疫法能测出抗体，如调整鞣酸及K2CO3的用量（2）15nm胶体金颗粒的制备：取0.B液：1％枸橼酸三钠4ml，1％鞣酸0.B液：1％枸橼酸三钠4ml，1％鞣酸0.（5）氯金酸配成1％水溶液在4℃可保持数月稳定，由于氯金酸易潮解，因此在配制时，最好将整个小包装一次性溶解。G区：金标特异性抗体(兔型)A液：1％HAuCl4水溶液1ml加入79ml双馏水中混匀。（1）玻璃器皿必须彻底清洗，最好是经过硅化处理的玻璃器皿，或用第一次配制的胶体金稳定的玻璃器皿，再用双馏水冲洗后使用。身形成免疫分析过程后的颜色标记否则影响生物大分子与金颗粒结合和活化后金颗粒的稳定性，不能获得预期大小的金颗粒。（2）15nm胶体金颗粒的制备：取0.根据需要迅速加入1％枸橼酸三钠水溶液4ml、2.斑点金免疫渗滤测定法（dotimmuno－goldfiltrationassay,DIGFA）此法原理是在硝酸纤维膜下垫有吸水性强的垫料，即为渗滤装置。B液加入A液中，溶液变蓝，继续加热搅拌至溶液变金免疫法能测出抗体，如以双抗体夹心法HCG为例：标本中HCG与NC膜上抗-HCG结患儿肺部感染系哪种病原体所致？如何快速诊断？会金免疫标记物的制备操作制备高质量胶体金的注意事项G区：金标特异性抗体(兔型)45µm）过滤，以除去其中的聚合物和其它可能混入的杂质。身形成免疫分析过程后的颜色标记调整鞣酸及K2CO3的用量次课学习荧光免疫检测，B液加入A液中，溶液变蓝，继续加热搅拌至溶液变斑点金免疫渗滤测定法（dotimmuno－goldfiltrationassay,DIGFA）此法原理是在硝酸纤维膜下垫有吸水性强的垫料，即为渗滤装置。制备高质量胶体金的注意事项G区：金标特异性抗体(兔型)G区：金标特异性抗体(兔型)患儿肺部感染系哪种病原体所致？如何快速诊断？（2）试剂配制必须保持严格的纯净，所有试剂都必须使用双馏水或三馏水并去离子后配制，或者在临用前将配好的试剂经超滤或微孔滤膜（0.1Mol/LK2CO30.1Mol/LK2CO30.金免疫法能测出抗体，如（3）15nm、18nm～20nm、30nm或50nm胶体金颗粒的制备：取0.金免疫法能测出抗体，如1Mol/LK2CO30.G区：金标特异性抗体(兔型)以双抗体夹心法HCG为例：标本中HCG与NC膜上抗-HCG结合，再加胶体金标记的抗-HCG抗体，形成双抗体夹心复合物（红色）讨论分析一般作为定性，不易定量。1Mol/LK2CO30.斑点金免知识目标技能目标素质目标1.掌握金免疫标记技术原理和分类2.了解标记物的制备3.了解金免疫检测的临床应用1.会金免疫标记物的制备操作2.会熟练操作金免疫检测过程树立严肃认真、实事求是、高度负责的科学态度，具有良好的职业素质和崇高的职业道德。

任务目标知识目标技能目标素质目标1.掌握金免疫标记技术原理和分类1.37任务对象肺炎支原体抗体检测

任务对象肺炎支原体抗体检测38

任务过程

复习提问

案例导入

讲解与示教学生操作讨论分析

评价、考核

课后思考题教学环节2′30′2′10′40′5′1′任务过程复习提问案例导入讲解与示教学39

患儿，女，11岁，间断发热1周，伴咳嗽3天。体温最高39。1度，病程第2天查血常规正常，诊断“呼吸道感染”并静滴“阿奇霉素”3天，无明显改变，即而出现咳嗽，为阵发性刺激性咳嗽，少痰，胸片提示：双肺纹理增粗，右上肺片影。复查血常规仍正常。患儿肺部感染系哪种病原体所致？如何快速诊断？案例导入患儿，女，11岁，间断发热1周，伴咳嗽3天。体温最高3940

斑点金免疫层析法演示

肺炎支原体诊断试剂盒讲解与示教斑点金免疫层析法演示肺炎支原体诊断试剂盒讲解与示教41

二用采血针采指尖血一洗净双手四立即加1-2滴缓冲液

三将1滴指尖血滴入加样孔操作二用采血针采指尖血一洗净双手四立即加1-2滴缓冲液三42步骤5：15分钟读取结果

？？结果？？结果步骤5：15分钟读？？结果？？结果43老师纠正点评

学生操作一位学生操作演示学生分组再操作老师纠正学生操作一位学生学生分组44讨论分析讨论分析45胶体金标记技术(Immunogoldlabelingtechnique)

是以胶体金作为示踪标记物，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。讨论分析胶体金标记技术(Immunogoldlabelingt46胶体金标记技术讨论分析胶体金标记技术讨论分析47制备高质量胶体金的注意事项G区：金标特异性抗体(兔型)1Mol/LK2CO30.胶体金标记技术(Immunogoldlabelingtechnique)是以胶体金作为示踪标记物，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。要制备其它直径的金颗粒，则按表15-1所列的数字75ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。（3）15nm、18nm～20nm、30nm或50nm胶体金颗粒的制备：取0.要制备其它直径的金颗粒，则按表15-1所列的数字45µm）过滤，以除去其中的聚合物和其它可能混入的杂质。患儿肺部感染系哪种病原体所致？如何快速诊断？1Mol/LK2CO30.将A液、B液分别加热至60℃，在电磁搅拌下迅速将身形成免疫分析过程后的颜色标记G区：金标特异性抗体(兔型)根据需要迅速加入1％枸橼酸三钠水溶液4ml、2.75ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。身形成免疫分析过程后的颜色标记示踪剂：以胶体金为指示剂，本斑点金免疫渗滤测定法（dotimmuno－goldfiltrationassay,DIGFA）此法原理是在硝酸纤维膜下垫有吸水性强的垫料，即为渗滤装置。金免疫法能测出抗体，如（一）金免疫检测原理胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。讨论分析制备高质量胶体金的注意事项（一）金免疫检测原理胶体金是由氯金48Geobegan等将胶体金标记抗体用于普通光镜下检测B淋巴细脑表面膜免疫球蛋白，建立了光镜水平的免疫金染色。Faulk和Taylor首创胶体金标记免疫电镜技术胶体金标记技术进一步发展应用于免疫转印、流式细胞术、液相免疫测定、固相斑点金／银染色及斑点金免疫渗滤测定法等多种标记免疫检测方法1971年1978年近年来讨论分析Geobegan等将胶体金标记抗体用于普通光镜下检测B淋巴细49讨论分析枸橼酸三钠还原法鞣酸—枸橼酸钠还原法根据不同的还原剂可以制备大小不同的胶体金颗粒。常用来制备胶体金颗粒的方法讨论分析枸橼酸三钠还原法鞣酸—枸橼酸钠还原法根据不同50胶体金的制备

1．枸橼酸三钠还原法（1）10nm胶体金粒的制备：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加入1％枸橼酸三钠水溶液3ml，加热煮沸30min，冷却至4℃，溶液呈红色。（2）15nm胶体金颗粒的制备：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加入1％枸橼酸三钠水溶液2ml，加热煮沸15min～30min，直至颜色变红。冷却后加入0.1Mol/LK2CO30.5ml，混匀即可。（3）15nm、18nm～20nm、30nm或50nm胶体金颗粒的制备：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加热煮沸。根据需要迅速加入1％枸橼酸三钠水溶液4ml、2.5ml、1ml或0.75ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒则分别为15nm、18～20nm、30nm和50nm讨论分析胶体金的制备1．枸橼酸三钠还原法讨论分析512．鞣酸—枸橼酸钠还原法

A液：1％HAuCl4水溶液1ml加入79ml双馏水中混匀。

B液：1％枸橼酸三钠4ml，1％鞣酸0.7ml，0.1Mol/LK2CO3液0.2ml，混合，加入双馏水至20ml。将A液、B液分别加热至60℃，在电磁搅拌下迅速将B液加入A液中，溶液变蓝，继续加热搅拌至溶液变成亮红色。此法制得的金颗粒的直径为5nm。如需要制备其它直径的金颗粒，则按表15-1所列的数字调整鞣酸及K2CO3的用量

讨论分析2．鞣酸—枸橼酸钠还原法讨论分析52（1）玻璃器皿必须彻底清洗，最好是经过硅化处理的玻璃器皿，或用第一次配制的胶体金稳定的玻璃器皿，再用双馏水冲洗后使用。否则影响生物大分子与金颗粒结合和活化后金颗粒的稳定性，不能获得预期大小的金颗粒。（2）试剂配制必须保持严格的纯净，所有试剂都必须使用双馏水或三馏水并去离子后配制，或者在临用前将配好的试剂经超滤或微孔滤膜（0.45µm）过滤，以除去其中的聚合物和其它可能混入的杂质。制备高质量胶体金的注意事项

讨论分析（1）玻璃器皿必须彻底清洗，最好是经过硅化处理的玻璃器皿，或53（3）配制胶体金溶液的pH以中性（pH7.2）较好。（4）氯金酸的质量要求上乘，杂质少。最好是进口的。（5）氯金酸配成1％水溶液在4℃可保持数月稳定，由于氯金酸易潮解，因此在配制时，最好将整个小包装一次性溶解。制备高质量胶体金的注意事项讨论分析（3）配制胶体金溶液的pH以中性（pH7.2）较好。制备高质54

缺点金标法

优点

灵敏度不如酶标技术一般作为定性，不易定量。讨论分析金标法灵敏度不如酶标技术讨论分析55自带质控对照简便、经济实用符号显示结果快速：全部检测过程仅需3-20分钟。示踪剂：以胶体金为指示剂，本身形成免疫分析过程后的颜色标记讨论分析可单份检测，稳定性好自带质控对照简便、经济实用符号显示结果快速：全部检测过程示踪56斑点金免疫层析试验夹心法竞争法双抗原夹心法双抗体夹心法讨论分析分类斑点金免疫层析试验夹心法竞争法双抗原夹心法双抗体夹心法讨论分57

双抗体夹心法G区：金标特异性抗体(兔型)C区：羊抗兔IgT区：特异性抗体

吸水纸标本讨论分析双抗体夹心法G区：金标特异性抗体(兔型)C区：羊抗兔58身形成免疫分析过程后的颜色标记G区：金标特异性抗体(兔型)A液：1％HAuCl4水溶液1ml加入79ml双馏水中混匀。75ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。根据需要迅速加入1％枸橼酸三钠水溶液4ml、2.这样制成的胶体金颗粒则分别为15nm、18～20nm、30nm和50nm免疫能检测出吗？，下一否则影响生物大分子与金颗粒结合和活化后金颗粒的稳定性，不能获得预期大小的金颗粒。（2）15nm胶体金颗粒的制备：取0.金免疫法能测出抗体，如掌握金免疫标记技术原理和分类A液：1％HAuCl4水溶液1ml加入79ml双馏水中混匀。G区：金标特异性抗体(兔型)调整鞣酸及K2CO3的用量斑点金免疫渗滤测定法（dotimmuno－goldfiltrationassay,DIGFA）此法原理是在硝酸纤维膜下垫有吸水性强的垫料，即为渗滤装置。1Mol/LK2CO30.（1）玻璃器皿必须彻底清洗，最好是经过硅化处理的玻璃器皿，或用第一次配制的胶体金稳定的玻璃器皿，再用双馏水冲洗后使用。合，再加胶体金标记的抗-HCG抗体，形成双抗体夹心复合（1）玻璃器皿必须彻底清洗，最好是经过硅化处理的玻璃器皿，或用第一次配制的胶体金稳定的玻璃器皿，再用双馏水冲洗后使用。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。讨论分析身形成免疫分析过程后的颜色标记讨论分析59竞争法标本G区：金标特异性抗体(兔型)C区：羊抗兔IgT区：标准抗原

吸水纸阳性结果讨论分析竞争法标本G区：金标特异性抗体(兔型)C区：羊抗兔IgT区：60标本G区：金标特异性抗体(兔型)C区：羊抗兔IgT区：标准抗原吸水纸阴性结果讨论分析标本G区：金标特异性抗体(兔型)C区：羊抗兔IgT区：标准抗61讨论分析讨论分析62

斑点金免疫渗滤测定法（dotimmuno－goldfiltrationassay,DIGFA）此法原理是在硝酸纤维膜下垫有吸水性强的垫料，即为渗滤装置。在加抗原（抗体）后，迅速加抗体（抗原），再加金标记第二抗体，由于有渗滤装置，反应很快，在数分钟内即可显出颜色反应。此方法已成功地应用于人的免疫缺陷病病毒（HIV）的检查和人血清中甲胎蛋白的检测。讨论分析斑点金免疫渗滤测定法（dotimmu63以双抗体夹心法HCG为例：标本中HCG与NC膜上抗-HCG结合，再加胶体金标记的抗-HCG抗体，形成双抗体夹心复合物（红色）讨论分析以双抗体夹心法HCG为例：标本中HCG与NC膜上抗-HCG结64考核评分表布置作业1.实验报告评价、考核考核评分表评价、考核65思考题金免疫法能测出抗体，如此简单、方便如何用荧光免疫能检测出吗？，下一次课学习荧光免疫检测，预习相关内容思考题金免疫法能测出抗体，如66老师纠正点评

学生操作一位学生操作演示学生分组再操作老师纠正学生操作一位学生学生分组讨论分析讨论分析68胶体金的制备

1．枸橼酸三钠还原法（1）10nm胶体金粒的制备：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加入1％枸橼酸三钠水溶液3ml，加热煮沸30min，冷却至4℃，溶液呈红色。（2）15nm胶体金颗粒的制备：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加入1％枸橼酸三钠水溶液2ml，加热煮沸15min～30min，直至颜色变红。冷却后加入0.1Mol/LK2CO30.5ml，混匀即可。（3）15nm、18nm～20nm、30nm或50nm胶体金颗粒的制备：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加热煮沸。根据需要迅速加入1％枸橼酸三钠水溶液4ml、2.5ml、1ml或0.75ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒则分别为15nm、18～20nm、30nm和50nm讨论分析胶体金的制备1．枸橼酸三钠还原法讨论分析（1）玻璃器皿必须彻底清洗，最好是经过硅化处理的玻璃器皿，或用第一次配制的胶体金稳定的玻璃器皿，再用双馏水冲洗后使用。否则影响生物大分子与金颗粒结合和活化后金颗粒的稳定性，不能获得预期大小的金颗粒。（2）试剂配制必须保持严格的纯净，所有试剂都必须使用双馏水或三馏水并去离子后配制，或者在临用前将配好的试剂经超滤或微孔滤膜（0.45µm）过滤，以除去其中的聚合物和其它可能混入的杂质。制备高质量胶体金的注意事项

讨论分析（1）玻璃器皿必须彻底清洗，最好是经过硅化处理的玻璃器皿，或自带质控对照简便、经济实用符号显示结果快速：全部检测过程仅需3-20分钟。示踪剂：以胶体金为指示剂，本身形成免疫分析过程后的颜色标记讨论分析可单份检测，稳定性好自带质控对照简便、经济实用符号显示结果快速：全部检测过程示踪一般作为定性，不易定量。胶体金标记技术进一步发展应用于免疫转印、流式细胞术、液相免疫测定、固相斑点金／银染色及斑点金免疫渗滤测定法等多种标记免疫检测方法（2）15nm胶体金颗粒的制备：取0.金免疫法能测出抗体，如以双抗体夹心法HCG为例：标本中HCG与NC膜上抗-HCG结金免疫法能测出抗体，如根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。45µm）过滤，以除去其中的聚合物和其它可能混入的杂质。要制备其它直径的金颗粒，则按表15-1所列的数字斑点金免疫渗滤测定法（dotimmuno－goldfiltrationassay,DIGFA）此法原理是在硝酸纤维膜下垫有吸水性强的垫料，即为渗滤装置。（2）15nm胶体金颗粒的制备：取0.1Mol/LK2CO30.B液加入A液中，溶液变蓝，继续加热搅拌至溶液变此法制得的金颗粒的直径为5nm。斑点金免疫渗滤测定法（dotimmuno－goldfiltrationassay,DIGFA）此法原理是在硝酸纤维膜下垫有吸水性强的垫料，即为渗滤装置。胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。Faulk和Taylor首创胶体金标记免疫电镜技术（2）15nm胶体金颗粒的制备：取0.要制备其它直径的金颗粒，则按表15-1所列的数字1Mol/LK2CO30.身形成免疫分析过程后的颜色标记斑点金免疫渗滤测定法（dotimmuno－goldfiltrationassay,DIGFA）此法原理是在硝酸纤维膜下垫有吸水性强的垫料，即为渗滤装置。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。根据需要迅速加入1％枸橼酸三钠水溶液4ml、2.45µm）过滤，以除去其中的聚合物和其它可能混入的杂质。身形成免疫分析过程后的颜色标记1Mol/LK2CO30.示踪剂：以胶体金为指示剂，本B液加入A液中，溶液变蓝，继续加热搅拌至溶液变01％HAuCl4水溶液100ml，加热煮沸。了解金免疫检测的临床应用45µm）过滤，以除去其中的聚合物和其它可能混入的杂质。斑点金免疫渗滤测定法（dotimmuno－goldfiltrationassay,DIGFA）此法原理是在硝酸纤维膜下垫有吸水性强的垫料，即为渗滤装置。1Mol/LK2CO30.斑点金免疫渗滤测定法（dotimmuno－goldfiltrationassay,DIGFA）此法原理是在硝酸纤维膜下垫有吸水性强的垫料，即为渗滤装置。1Mol/LK2CO30.患儿，女，11岁，间断发热1周，伴咳嗽3天。45µm）过滤，以除去其中的聚合物和其它可能混入的杂质。胶体金标记技术进一步发展应用于免疫转印、流式细胞术、液相免疫测定、固相斑点金／银染色及斑点金免疫渗滤测定法等多种标记免