版权说明:本文档由用户提供并上传,收益归属内容提供方,若内容存在侵权,请进行举报或认领
文档简介
《发酵工艺学》倪孟祥张艳锋
生命科学与技术学院微生物制药教研室Email:nimx_2000@
2014.2《发酵工艺学》倪孟祥张艳锋1
一、教材:何建勇主编
《发酵工艺学》二、参考书以及文献:生物工艺学:储炬主编。生物工程学报食品与发酵工业中国抗生素杂志微生物学学报应用微生物学杂志BioengineeringandBiotechnology一、教材:何建勇主编
2第一章绪论一、生物技术与生物工程1生物技术(Biotechnology)------是应用自然科学以及工程学的原理,依靠生物作用剂(biologicalagents)的作用将物料进行加工,以提供产品或为社会服务的技术。------是将生物化学、生物学、微生物学和化学工程应用于工业生产过程(包括医药卫生、能源及农业的产品)以及环境保护的技术。------是对生物作用和生物物料加以评价和应用,并进行工业产品生产的技术。------是生物系统或生物过程的工业利用。发酵工艺学课件3特点:(1)多学科、综合性的科学技术(2)有生物催化剂的参与目的:是建立工业生产过程或进行社会服务。
生物技术的多学科性生物学、化学、工程学、医学、药学、农学等。发酵工艺学课件4化学生物学生化生物工程生物技术化学工程工程学化学生物学生化生物工程生物技术化学工程工程学52生物工程(bioengineering)一般是指医学工程、环境工程、卫生工程、农业工程、仿生工程、人体功能工程等的总称。物理过程与生物学的结合。发酵工艺学课件63生物化学工程(biochemicalengineering)运用化学工程的原理和方法,对实验室所取得的生物技术成果加以开发,使之成为生物反应过程的一门学科。发酵工艺学课件7生物技术工程基因工程酶工程细胞工程发酵工程产物产品产品生物技术工程基因工程酶工程细胞工程发酵工程产物产品产品8
发酵工程
──利用微生物进行产品生产抗生素、生物制药、氨基酸、核苷酸、有机酸、饲料添加剂、微生态制剂、生物农药、生物肥料等医药、轻工、食品、农业、环保、能源等行业基因工程药物、疫苗及抗体产品化学工程生物化工生物加工行业传统生物技术现代生物技术基因工程菌发酵发酵工程──利用微生物进行产品生产医药、轻9二、生物反应过程的特点生物反应过程:(1)原材料的预处理(2)生物催化剂的制备
(3)生物反应器及反应条件的选择(4)产物的分离纯化特点(1)常温、常压(2)原料来源丰富、价廉(3)生产设备简单
(4)酶反应过程和发酵过程各具特点。发酵工艺学课件10三、生物技术的发展简史1传统(古老)的生物技术2第一代(初期)生物技术产品的出现:19世纪末--------20世纪30年代3第二代(近代)生物技术产品的发展:20世纪40年代4第三代(现代)生物技术产品的出现发酵工艺学课件11发酵现象→酿造食品工业→非食品工业→青霉素→抗菌素发酵工业→氨基酸,核酸发酵(代谢控制发酵)→基因工程菌→动物细胞大规模培养→植物细胞大规模培养→藻类细胞大规模培养→转基因动物
第一个转折点:非食品工业第二个转折点:青霉素→抗菌素发酵工业第三个转折点:切断支路代谢:酶的活力调控,酶的合成调控(反馈控制和反馈阻遏),解除菌体自身的反馈调节,突变株的应用,前体、终产物、副产物等近代转折点:基因、动物、海洋发酵现象→酿造食品工业→非食品工业→青霉素→抗菌素发酵工业→12发酵工程的重大转折点二十世纪四十年代初,第二次世界大战爆发,青霉素的发现,迅速形成工业大规摸生产。1928年由Fleming发现青霉素1941年美国和英国合作对青霉素进行生产研究表面培养:1升扁瓶或锥形瓶,内装200mL麦麸培养基───40u/ml1943年沉浸培养:5m3───200u/ml当今:100m3─200m3───5-10万u/ml链霉素、金霉素、新霉索、红霉素发酵工程的重大转折点二十世纪四十年代初,第二次世界大战爆发,13主要的技术进展:通气搅拌解决了液体深层培养时的供氧问题。抗杂菌污染的纯种培养技术:无菌空气、培养基灭菌、无污染接种、大型发酵罐的密封与抗污染设计制造。意义:抗生素工业的发展建立了一套完整的好氧发酵技术,大型搅拌发酵罐培养方法推动了整个发酵工业的深入发展为现代发酵工程奠定了基础主要的技术进展:14大型发酵罐搅拌装置大型发酵罐搅拌装置15180M3发酵罐车间大型空气压缩机180M3发酵罐车间大型空气压缩机16发酵车间的空气过滤器发酵车间的空气过滤器1720世纪70年代
细胞融合技术、基因操作技术等生物技术发展,打破了生物种间障碍,能定向地制造出新的有用的微生物:增加微生物体内控制代谢产物产量的基因拷贝数,可以大幅度地提高目标产物的产量将动、植物或某些微生物特有产物的控制基因植入细胞中,快速经济地大量生产这些产物将具有不同性能的多种质粒植入,使新菌株在清除污染或以非粮食物质为原料进行发酵生产或环境保护20世纪70年代细胞融合技术、基因操作技术等生18动物细胞反应器动物细胞反应器19细胞大规模培养技术细胞大规模培养──微生物、动植物细胞、藻类细胞等细胞代谢产物、生物转化、酶、基因表达产物和基因质粒等占生物技术产品的40%以上,达1OOO亿美元。
细胞大规模培养技术细胞大规模培养──微生物、动植物细胞、20发酵工程产业化发展目前,全球发酵产品的年销售额在400亿美元左右,并以每年约7%~8%的速率增长。我国发酵行业生产企业有5000多家,主要发酵产品的年产值高达1300亿元。发酵工程技术给人类社会生产力的发展带来了巨大的潜力涉及到解决人类所面临的食品与营养、健康与环境、资源与能源等重大问题
发酵工程产业化发展目前,全球发酵产品的年销售额在400亿美元2121世纪是生物技术世纪未来学家说:21世纪是生物技术世纪;科学家预言:
21世纪世界即将在生物技术上取得重大突破,新世纪之初,科学方面的主要将在生物学、遗传学和医学、新型生物材料、能源、环境保护上有所突破;经济学家则认为:21世纪20年代,生物经济将由目前的形成阶段进入成长阶段,即工业生产与商业开发阶段。
21世纪是生物技术世纪未来学家说:21世纪是生物技术世纪;22现代生物技术:以基因工程为主导,发酵工程为中心,加上酶工程、细胞工程、蛋白质工程等的一个综合体系。主要包括:重组DNA技术、原生质体技术、突变生物合成、组合生物合成、单克隆抗体、组织培养技术。发酵工艺学课件23具体:开发新产品、改造现有生产菌种、代谢途径工程、生物转化、诊断药物的研制及治疗药物的研制、基因治疗、转基因动物和转基因植物等。发酵工艺学课件24四、发酵以及发酵工业的范畴1.发酵(fermentation)原始定义现代含义:是指利用培养微生物来制得产物的需氧或厌氧的任何过程。发酵工艺学课件252.发酵工业的范畴(1)微生物菌体发酵(2)微生物酶的生产(3)微生物代谢产物发酵:初级代谢产物和次级代谢产物(4)微生物转化发酵(5)工程菌发酵(6)动植物细胞发酵发酵工艺学课件26五、发酵工艺的培养方法和过程(一)培养方法:1.表面培养法2.深层培养法(二)生产过程1.菌种制备2.种子制备3.发酵4.下游处理五、发酵工艺的培养方法和过程27六、发酵工业的现状及发展趋向发酵工艺学课件28发酵工程在生物技术产业发展中的地位
21世纪的工业生物技术产业,究竟是一个什么样的格局?作为工业生物技术核心的发酵工程,在已经开始的生物经济时代,是处于一种什么状态?能起何种作用?又面临那些课题?这是人们所关注的问题!发酵工程在生物技术产业发展中的地位21世纪的工业生29小结1.发酵的定义,发酵工业的范畴2.生物工程和生物技术的特点3.生物反应过程的一般特点4.发酵工程的发展简史5.发酵过程的一般方法小结1.发酵的定义,发酵工业的范畴30本课程的学习内容通过《发酵工艺学》的学习,将技术基础课和专业课与发酵工业的操作原理结合起来,了解发酵工业控制的特性及共性,并且熟悉发酵工业的工艺流程及常用术语,为今后从事生物技术的有关科研和生产打下良好的基础。此外,发酵工程的最基本问题是过程优化与放大,通过本课程的学习,对上述过程工程问题与生物学基础有较深入的认识,对有关交叉学科的前沿技术在发酵工程中的应用有一定的了解。本课程的学习内容通过《发酵工艺学》的学习,将技术基础课和专业31第八、九章微生物代谢产物的生物合成与调控微生物的3个重要特点:
1.比表面积大
2.及其多样化的代谢反应
3.容易适应多种环境条件两类代谢产物:初级代谢产物次级代谢产物第八、九章微生物代谢产物的生物合成与调控32初级代谢和次级代谢的关系:1.生化代谢(1)具有一个共同的中间体(2)次级代谢产物很多是以初级代谢产物为母体衍生来的初级代谢和次级代谢的关系:33葡萄糖碳架掺入途径:链霉素、卡那
霉素
莽草酸途径:氯霉素、新生霉素
与核苷有关的途径:杀结核菌素
聚酮体和聚丙酸途径:四环素、制霉
菌素、灰黄霉素
由氨基酸衍生的途径:青霉素、头孢
菌素
甲羟戊酸途径:赤霉素
其他复合途径:博雷霉素、大环内酯类葡萄糖碳架掺入途径:链霉素、卡那
34(3)两个代谢途径中所涉及的酶不完全相同(4)都受到菌体代谢的调节,相互交错。2.遗传代谢(1)都受到核内遗传物质DNA的调节控制(2)次级代谢产物还受到与初级代谢产物合成无关的遗传物质的控制。发酵工艺学课件35第一节微生物初级代谢产物的生物合成与调控
一、微生物生物合成的初级代谢产物二、初级代谢产物生物合成中的主要调控机制代谢调控的类型主要有:酶活性的调节,酶合成的调节。(一)酶合成的调节1.酶合成的诱导调节组成酶和诱导酶第一节微生物初级代谢产物的36底物的结构类似物诱导顺序诱导
2.酶合成的阻遏降解酶:诱导和分解代谢产物调节合成酶:反馈调节(1)分解代谢物调节:葡萄糖效应(2)反馈阻遏:单一终产物阻遏、多价阻遏、累加阻遏底物的结构类似物诱导373.酶合成诱导及阻遏的调节机制:
操纵子学说4.分解代谢产物阻遏机制发酵工艺学课件38(二)酶活性的调节1.酶活性的激活2.酶活性的抑制包括:竞争性抑制和反馈抑制。发酵工艺学课件39反馈抑制:(1)协同反馈抑制(2)累积反馈抑制(3)增效反馈抑制(4)顺序反馈抑制(5)同功酶调节发酵工艺学课件403.酶活性的调节的机制:调节酶学说(变构酶学说/别构酶学说)(三)能荷调节能荷(%)=×100%三、初级代谢产物生物合成中的主要调控机制的实际应用3.酶活性的调节的机制:41第二节微生物次级代谢产物的生物合成与调控一、微生物合成的次级代谢产物的基本特征1.次级代谢产物具有种的特异性2.产生菌生长周期可分为三个时期3.次级代谢产物大多是结构相似的混合物4.次级代谢产物的合成受多基因控制发酵工艺学课件42二、次级代谢产物的构建单位前体1.短链脂肪酸与聚酮体内酯环(大环内酯类)、四环类、蒽醌环2.甲羟戊酸赤霉素、生物碱等3.糖类和氨基酸大环内酯二、次级代谢产物的构建单位434.非蛋白氨基酸D-氨基酸、N-甲基氨基酸、脱氢的和B-氨基酸5.环多醇和氨基环多醇氨基糖苷类发酵工艺学课件44三、次级代谢产物生物合成的主要调控机制(一)酶合成的诱导调节(二)反馈调节1.自身反馈调节抑制抗生素自身合成需要的抗生素浓度与产生菌的生产能力成正比关系。2.前体物质的自身反馈抑制缬氨酸的反馈作用3.支路产物的反馈抑制赖氨酸和青霉素的合成三、次级代谢产物生物合成的主要调控机制454.次级代谢产物的自身反馈调节(三)磷酸盐的调节0.3~300mmol/L生长10mmol/L表现出抑制1.促进初级代谢,抑制菌体的次级代谢2.抑制次级代谢产物前体的生物合成3.阻抑次级代谢中的磷酸酯酶4.ATP的调节5.对次级代谢产物生物合成的调节机制4.次级代谢产物的自身反馈调节46(四)碳分解产物的调节作用及机理(五)氮分解产物的调控1.次级代谢产物生物合成酶的合成2.铵能调节糖代谢中的某些酶的活性3.铵能调节某些氨基酸的合成4.铵能调节产生菌的淀粉酶和蛋白酶的活性(六)产生菌生长速率的调节(七)溶解氧的调节作用(四)碳分解产物的调节作用及机理47小结1.基本概念2.酶调节的机制3.次级代谢产物调节的特点。小结1.基本概念48第二章菌种选育理论与技术利用工业微生物发酵生产的过程中,决定生产水平高低最主要的有三个方面的因素:生产菌种,发酵工艺和后提取工艺。其中最重要的是生产菌种。菌种选育的最初目的是改良菌种的特性,使其符合工业生产的要求。第二章菌种选育理论与技术利用工业微生物发酵生产的过程中,决49菌种选育的目的菌种选育的目的50菌种选育的基本内容
根据菌种自然变异而进行的自然选育,以及用人工方法引起菌种变异或形成新的杂种,再按照工业生产的要求进行筛选来获得新的变种或杂种。菌种选育的基本内容根据菌种自然变异而进行的自然选育,以及用51菌种选育技术自然选育、诱变育种等方法属于经验育种的范畴;原生质体技术、杂交育种、分子生物学方法等现代菌种选育技术。菌种选育技术自然选育、诱变育种等方法属于经验育种的范畴;52第一节自然选育自然选育是一种纯种选育的方法。它利用微生物在一定条件下产生自发突变的原理,通过分离,筛选排除衰退型菌株,从中选择维持原有生产水平的菌株。第一节自然选育自然选育53一、自然选育的目的1.纯化菌种2.防止菌种衰退3.稳定生产4.提高产量一、自然选育的目的1.纯化菌种54一、菌种退化与变异原因
1.菌种遗传特性的改变(1)遗传基因型的分离异核体现象(2)自发突变(回复突变)自发突变的原因:①用沙土管等长期保藏;②菌种连续传代,这种自发突变比保藏过程中产生的比例要高;③活细胞内进行的新陈代谢活动,能产生一些具有诱变作用的物质,当这些物质在胞内累积到一定浓度时能诱发DNA结构的改变。④DNA中存在的增变基因也能诱发基因突变。⑤有的微生物的染色体上还存在有导致菌体退化的死亡基因,DNA的代谢失调也会引起基因突变而造成菌种退化。⑥多因素低剂量的诱变效应⑦互变异构效应一、菌种退化与变异原因1.菌种遗传特性的改变552.经诱变剂处理后的退化变异
①初筛出的菌落可能是由成对或成堆孢子发育成的,其中只有一个细胞诱发了基因突变,在传代中细胞核分裂时,未发生基因突变的细胞逐渐在数量上占优势,便表现出产量下降。②可能是诱变菌种的细胞是异核体,而发生基因突变的只是其中一个细胞核的遗传基因。那么在传代过程中由于产生细胞核的分离现象,高产突变基因的核在数量上失去了优势,便出现产量性状的退化变异。③突变发生在无意义链上,在遗传信息传递过程中被丢失,致使正突变性状的消失。④在诱变剂的作用下,被诱变菌种出现基因混杂,突变的高产基因虽然已经传递到下一代,但在传代使用过程中,当环境条件适合于低产型突变株繁殖时,使其在数量上占优势,便表现出低产水平。
2.经诱变剂处理后的退化变异①初筛出的菌落可能是由成对或成563.菌种生理状况的改变(1)一个菌种不是一个单一的群体,而是由一些变株混合而成的,这些变株所占的比例决定该菌种的特性。(2)菌种培养基的影响。(3)在某些培养条件下,菌体的某些基因处于活化状态或阻遏状态,而使得菌种的生理状态改变。3.菌种生理状况的改变(1)一个菌种不是一个单一的群体,而是57二、自然选育的方法二、自然选育的方法581.单孢子悬浮液的制备定量稀释后制成50~200个单细胞/ml的菌悬液2.分离及单菌落培养根据计数结果,按丝状真菌、放线菌菌落大小不同,分离量以5~20个菌落/平皿为宜。
3.筛选将分离培养后的各型单菌落,接斜面培养,成熟后接入发酵瓶,测定发酵单位的过程称为筛选。它分初筛、复筛两个过程。初筛系指初步筛选,以多量筛选为原则。复筛是对初筛得到的高产菌株的复试,以挑选出稳定高产菌株为原则。1.单孢子悬浮液的制备59初筛、复筛都要同时以生产菌株作对照。复筛选出的高单位菌株至少要比对照菌株产量提高5%以上,并经过菌落纯度、摇瓶单位波动情况,以及糖、氮代谢等的考察,合格后方可在生产罐上试验。复筛得到的高单位菌株应制成沙土管、冷冻管或液氮管进行保藏。发酵工艺学课件60第二节诱变育种通过诱变剂处理就可以大大提高菌种的突变频率,扩大变异幅度,从中选出具有优良特性的变异菌株,这种方法就称为诱变育种。诱变育种的特点:具有速度快、收效大、方法简便;但是诱发突变缺乏定向性、工作量大。诱变育种工作主要包括出发菌株的选择、诱变处理和筛选突变株三个部分。第二节诱变育种通过诱变剂处理就可以大大提高菌种的突变频率61发酵工艺学课件62一、诱变剂的种类1.物理诱变剂紫外线、快中子、X射线、r-射线、激光2.化学诱变剂(1)碱基类似物:5-Bu(2)与碱基起反应的物质:亚硝酸、氮芥、羟胺、硫酸二乙酯、NTG(N-甲基-N-硝基-N-硝基胍)(3)丫啶类3.生物诱变剂:噬菌体一、诱变剂的种类1.物理诱变剂63二、突变诱发过程前突变:诱变剂所造成的DNA分子的某一位置的结构改变称之。前突变可以通过影响DNA复制而成为真正的突变,也可以经过修复重新回到原有的结构,即不发生突变。二、突变诱发过程64(一)诱变剂接触DNA分子前1.细胞对诱变剂的透性将影响诱变效果。2.细胞质的某些组分和某些酶可和诱变剂相互作用而影响诱变效果。3.与基因所处的状态有关,而基因的状态又和培养条件有关。(一)诱变剂接触DNA分子前1.细胞对诱变剂的透性将影响诱变65(二)DNA损伤的修复
微生物有五种方式来修复DNA损伤。1.光复活作用2.切补修复:
四种酶的作用:核酸内切酶、核酸外切酶、DNA多聚酶、DNA连接酶3.重组修复:又称为复制后修复4.SOS修复系统
5.DNA多聚酶的校正作用:增变突变型(二)DNA损伤的修复66(三)从前突变到突变校正差错:光复活作用、切补修复和DNA多聚酶校正作用引起差错:重组修复和SOS修复系统一切影响这些修复系统中的酶活性的因素都能影响由前突变向突变转变这一过程。诱变前后的处理可影响诱变的效果:1.通过影响与DNA修复作用有关的酶的活性而影响诱变的效果;2.通过使诱变的目的基因处于活化状态(复制或转录状态),使之更容易被诱变剂所作用,从而影响目的基因的突变率。
(三)从前突变到突变校正差错:光复活作用、切补修复和DNA67(四)从突变到突变型表型迟延:突变基因的出现并不等于突变表型的出现,表型的改变落后于基因型改变的现象。1.分离性迟延是经诱变处理后,细胞中的基因处于不纯的状态(野生型基因和突变型基因并存于同一细胞中),突变型基因由于属于隐性基因而暂时得不到表达,需经过复制、分离,在细胞中处于纯的状态(一细胞中只有突变型基因,没有野生型基因)时,其性状才得以表达。2.生理性迟延突变基因由杂合状态变为纯合状态时,还不一定出现突变表型,新的表型必须等到原有基因的产物稀释到某一程度后才能表现出来。
(四)从突变到突变型表型迟延:突变基因的出现并不等于突变表68三、诱变育种方案的设计诱变育种包括三个环节:突变的诱发、突变株的筛选和突变高产基因的表现。
(一)制定筛选目标
(二)制定筛选方案
1.诱变过程
(1)出发菌种的斜面
(2)单孢子悬浮液制备
(3)孢子计数
(4)单菌落分离三、诱变育种方案的设计诱变育种包括三个环节:突变的诱发、突变692.筛选过程
(1)传种斜面(2)留种保藏菌种(3)筛选高产菌株
2.筛选过程(1)传种斜面70
四、突变的诱发突变的诱发受到菌种的遗传特性、诱变剂、菌种的生理状态以及诱变处理时环境条件的影响。1.出发出株的选择(1)选择纯种选择发酵产量稳定、波动范围小的菌株(2)选择具有优良性状的出发菌株选择的出发菌株应当具有我们所需要的代谢特性(3)对诱变剂敏感可以提高变异频率,而且高产突变株的出现率也大(4)选择多个出发菌株
四、突变的诱发712.诱变剂的选择(1)根据出发菌株的遗传背景(2)菌株遗传性质的稳定程度(3)诱变剂本身的特点(4)诱变剂的剂量2.诱变剂的选择(1)根据出发菌株的遗传背景72
3.影响诱变效果的因素
(1)菌种的遗传稳定性以及对诱变剂的敏感性(2)菌种的生理状态(3)菌种的预处理和后处理条件(4)其他外界条件
3.影响诱变效果的因素73五、突变株的筛选(一)随机筛选1.摇瓶筛选法2.琼脂块筛选法3.筛选自动化和筛选工具微型化
(二)理性化筛选指运用遗传学、生物化学的原理,根据产物已知的或可能的生物合成途径、代谢调控机制和产物分子结构来进行设计和采用一些筛选方法,以打破微生物原有的代谢调控机制,获得能大量形成产物的高产突变株的筛选方法。五、突变株的筛选(一)随机筛选741.初级代谢产物高产菌株的筛选
(1)降低终产物浓度:①筛选终产物营养缺陷型②筛选细胞膜透性改变的突变株
(2)筛选抗反馈调节突变菌株①筛选结构类似物(抗代谢物)抗性突变株抗反馈抑制、抗反馈阻遏②利用回复突变筛选抗反馈突变菌株
1.初级代谢产物高产菌株的筛选(1)降低终产物浓度:752.次级代谢产物(主要是抗生素)高产
菌株的筛选(1)利用营养缺陷型筛选渗漏缺陷型是遗传性障碍不完全的营养缺陷型,突变使某一种酶的活性下降而不是完全丧失,所以这种缺陷型能够少量地合成某一代谢产物,能在基本培养基上少量地生长。(2)筛选负变株或零变株的回复突变株(3)筛选去磷酸盐调节突变株(4)筛选去碳源分解代谢调节突变株(5)筛选氨基酸结构类似物抗性突变株2.次级代谢产物(主要是抗生素)高产
菌株的筛选(76(6)筛选二价金属离子抗性突变株(7)筛选前体或前体结构类似物抗性突变株(8)筛选自身所产的抗生素抗性突变株3.营养缺陷型筛选(1)营养缺陷型的富集抗生素富集法、过滤法。(2)营养缺陷型的检出点种法、夹层琼脂法(3)营养缺陷型的鉴定点种法、生长谱法六、突变高产基因的表现发酵工艺学课件77七、诱变育种工作前的准备工作1.菌种培养特性的摸索。2.最佳培养条件的摸索。3.产单位高峰时间。4.菌种保藏条件的建立。5.菌种的遗传背景。七、诱变育种工作前的准备工作1.菌种培养特性的摸索。78第三节杂交育种杂交育种是指将两个基因型不同的菌株经吻合(或接合)使遗传物质重新组合,从中分离和筛选具有新性状的菌株。杂交育种的目的在于:(1)通过杂交使不同菌株的遗传物质进行交换和重新组合,从而改变原有菌株的遗传物质基础,获得杂种菌株(重组体);(2)可以通过杂交把不同菌株的优良生产性能集中于重组体中,克服长期用诱变剂处理造成的菌株生活力下降等缺陷;(3)通过杂交,可以扩大变异范围,改变产品的质量和产量,甚至出现新的品种;(4)分析杂交结果,可以总结遗传物质的转移和传递规律,促进遗传学理论的发展。第三节杂交育种杂交育种是指将两个基因型不同的菌株79霉菌的杂交育种准性生殖(Parasexualreproduction)是指真菌中不通过有性生殖的基因重组过程。①选择直接亲本②异核体的形成③杂合双倍体的形成④体细胞重组染色体交换、染色体单倍化霉菌的杂交育种80第四节原生质体技术一、原生质体制备1.菌体的预处理2.菌体的培养时间3.酶浓度4.酶解温度5.酶解时间6.渗透压稳定剂第四节原生质体技术一、原生质体制备81二、原生质体的融合三、融合子的选择四、原生质体的再生五、原生质体的诱变六、原生质体再生与常规诱变相结合七、灭活原生质体融合技术在育种中的应用1.单一亲株灭活2.双亲株或多亲株灭活二、原生质体的融合82第三章培养基第一节概述一、培养基的组成培养基:是人们提供给微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的按一定比例配制的多种营养物质的混合物。培养基造成的影响:菌体生长、产物合成、产品的分离精制、产品的产量和质量第三章培养基第一节概述83二、配制工业发酵培养基的一般要求1.满足菌体生长及产物合成。2.理化性质稳定。3.黏度适中。4.原材料主要要有利于产物合成。5.不影响通气搅拌和产物的分离精制6.因地制宜,质优价廉。二、配制工业发酵培养基的一般要求84第二节培养基的成分一、碳源功能:碳架、能源1.糖类:单糖、双糖、多糖2.脂肪3.有机酸、醇4.碳氢化合物二、氮源功能:氮架第二节培养基的成分一、碳源851.无机氮源:特点:成分单一、质量稳定;容易被吸收利用改变培养液的PH氨水、铵盐2.有机氮源特点:成分复杂被菌体利用的速度不一微生物对氨基酸的利用有选择性易引起发酵水平的波动农副产品发酵工艺学课件86三、无机盐和微量元素四、水五、前体六、消沫剂七、其它发酵工艺学课件87第三节培养基的种类和选择一、培养基的种类1.孢子培养基要求:能使菌体快速生长,产孢子的数量多、质量好,不引起菌种变异。麸皮培养基、大(小)米培养基、琼脂培养基2.种子培养基要求:营养适当地丰富和完全,氮源和维生素的含量适当略高,但总浓度以略稀薄为宜,和发酵培养基相适应。3.发酵培养基要求:组成要适当丰富和完全,满足菌体生长和产物合成第三节培养基的种类和选择一、培养基的种类88二、培养基的设计1.碳氮比2.生理酸性和碱性物质比三、培养基的筛选单因子试验、正交设计、均匀设计等二、培养基的设计1.碳氮比89第四节影响培养基质量的因素一、原材料质量的影响品种、产地、加工方法、批号等二、水质的影响三、灭菌的影响四、其它第四节影响培养基质量的因素一、原材料质量的影响90第四章灭菌与除菌染菌的危害:1.消耗培养基中的营养成分。
2.分泌某些对产生菌有毒或能使抗生素失活得物质。
3.影响后处理工艺。
4.影响产品的质量和产量。
5.可能会引起大幅度染菌,连续染菌。第四章灭菌与除菌染菌的危害:1.消耗培养基中的营养成分。91第一节灭菌的基本原理一、几种常用的灭菌方法的基本原理1.化学物质灭菌甲醛、苯酚、高锰酸钾、新洁尔灭、来苏儿等。2.辐射灭菌:紫外线、X射线、r射线3.干热灭菌4.湿热灭菌5.臭氧灭菌6.过滤灭菌第一节灭菌的基本原理一、几种常用的灭菌方法的基本原理92二、湿热灭菌的原理范围低限高限嗜冷菌5~10020~30嗜温菌25~37545~50嗜热菌50~603070~80二、湿热灭菌的原理范围低限高限嗜冷菌5~10020~30嗜温93几个概念:1.致死温度2.致死时间3.热阻4.相对热阻对数残留定律:dN/dT=-KNT=(2.303logN0/NS)/K几个概念:1.致死温度94第二节培养基和发酵设备的灭菌一、培养基灭菌温度的选择杀死微生物的活化能大于营养成分破坏的活化能-------------------高温快速灭菌法二、培养基的灭菌方法1.分批灭菌(实罐灭菌,实消)2.连续灭菌(连消)第二节培养基和发酵设备的灭菌一、培养基灭菌温度的选择95连续灭菌的特点:1.可采用高温快速灭菌工艺,营养成分破坏较少。2.发酵罐非生产占用时间缩短,容积利用率提高。3.热能利用合理,适合实行自动化控制。4.不适合黏度大或固形物含量高的培养基的灭菌。5.增加一套连续灭菌设备,增加了操作环节,增加了染菌的机会。发酵工艺学课件96三、发酵设备的灭菌灭菌要点:1.设备的严密度。2.温度和压力是否相互对应。3.防止灭菌死角。三、发酵设备的灭菌灭菌要点:97第三节空气除菌主要的灭菌方法:1.加热灭菌2.静电除菌3.介质过滤除菌第三节空气除菌主要的灭菌方法:98第四节无菌检查与染菌的处理一、无菌检查分析:无菌试验、培养液的显微镜检查、培养液的生化指标变化无菌试验肉汤培养法、斜面培养法、双碟培养法第四节无菌检查与染菌的处理一、无菌检查99二、染菌的判断1.染菌罐的判断2.染菌率的统计三、染菌的处理1.种子罐染菌的处理2.发酵罐染菌的处理前期中后期3.染菌后的设备处理4.污染噬菌体的处理二、染菌的判断1.染菌罐的判断100第五节制服染菌的要点一、染菌原因的分析1.设备渗漏2.空气系统3.种子带菌4.操作失误二、制服染菌的要点1.对空气系统的要求2.对蒸汽的要求3.对设备的要求4.对工艺操作的要求5.环境的要求第五节制服染菌的要点一、染菌原因的分析101《发酵工艺学》倪孟祥张艳锋
生命科学与技术学院微生物制药教研室Email:nimx_2000@
2014.2《发酵工艺学》倪孟祥张艳锋102
一、教材:何建勇主编
《发酵工艺学》二、参考书以及文献:生物工艺学:储炬主编。生物工程学报食品与发酵工业中国抗生素杂志微生物学学报应用微生物学杂志BioengineeringandBiotechnology一、教材:何建勇主编
103第一章绪论一、生物技术与生物工程1生物技术(Biotechnology)------是应用自然科学以及工程学的原理,依靠生物作用剂(biologicalagents)的作用将物料进行加工,以提供产品或为社会服务的技术。------是将生物化学、生物学、微生物学和化学工程应用于工业生产过程(包括医药卫生、能源及农业的产品)以及环境保护的技术。------是对生物作用和生物物料加以评价和应用,并进行工业产品生产的技术。------是生物系统或生物过程的工业利用。发酵工艺学课件104特点:(1)多学科、综合性的科学技术(2)有生物催化剂的参与目的:是建立工业生产过程或进行社会服务。
生物技术的多学科性生物学、化学、工程学、医学、药学、农学等。发酵工艺学课件105化学生物学生化生物工程生物技术化学工程工程学化学生物学生化生物工程生物技术化学工程工程学1062生物工程(bioengineering)一般是指医学工程、环境工程、卫生工程、农业工程、仿生工程、人体功能工程等的总称。物理过程与生物学的结合。发酵工艺学课件1073生物化学工程(biochemicalengineering)运用化学工程的原理和方法,对实验室所取得的生物技术成果加以开发,使之成为生物反应过程的一门学科。发酵工艺学课件108生物技术工程基因工程酶工程细胞工程发酵工程产物产品产品生物技术工程基因工程酶工程细胞工程发酵工程产物产品产品109
发酵工程
──利用微生物进行产品生产抗生素、生物制药、氨基酸、核苷酸、有机酸、饲料添加剂、微生态制剂、生物农药、生物肥料等医药、轻工、食品、农业、环保、能源等行业基因工程药物、疫苗及抗体产品化学工程生物化工生物加工行业传统生物技术现代生物技术基因工程菌发酵发酵工程──利用微生物进行产品生产医药、轻110二、生物反应过程的特点生物反应过程:(1)原材料的预处理(2)生物催化剂的制备
(3)生物反应器及反应条件的选择(4)产物的分离纯化特点(1)常温、常压(2)原料来源丰富、价廉(3)生产设备简单
(4)酶反应过程和发酵过程各具特点。发酵工艺学课件111三、生物技术的发展简史1传统(古老)的生物技术2第一代(初期)生物技术产品的出现:19世纪末--------20世纪30年代3第二代(近代)生物技术产品的发展:20世纪40年代4第三代(现代)生物技术产品的出现发酵工艺学课件112发酵现象→酿造食品工业→非食品工业→青霉素→抗菌素发酵工业→氨基酸,核酸发酵(代谢控制发酵)→基因工程菌→动物细胞大规模培养→植物细胞大规模培养→藻类细胞大规模培养→转基因动物
第一个转折点:非食品工业第二个转折点:青霉素→抗菌素发酵工业第三个转折点:切断支路代谢:酶的活力调控,酶的合成调控(反馈控制和反馈阻遏),解除菌体自身的反馈调节,突变株的应用,前体、终产物、副产物等近代转折点:基因、动物、海洋发酵现象→酿造食品工业→非食品工业→青霉素→抗菌素发酵工业→113发酵工程的重大转折点二十世纪四十年代初,第二次世界大战爆发,青霉素的发现,迅速形成工业大规摸生产。1928年由Fleming发现青霉素1941年美国和英国合作对青霉素进行生产研究表面培养:1升扁瓶或锥形瓶,内装200mL麦麸培养基───40u/ml1943年沉浸培养:5m3───200u/ml当今:100m3─200m3───5-10万u/ml链霉素、金霉素、新霉索、红霉素发酵工程的重大转折点二十世纪四十年代初,第二次世界大战爆发,114主要的技术进展:通气搅拌解决了液体深层培养时的供氧问题。抗杂菌污染的纯种培养技术:无菌空气、培养基灭菌、无污染接种、大型发酵罐的密封与抗污染设计制造。意义:抗生素工业的发展建立了一套完整的好氧发酵技术,大型搅拌发酵罐培养方法推动了整个发酵工业的深入发展为现代发酵工程奠定了基础主要的技术进展:115大型发酵罐搅拌装置大型发酵罐搅拌装置116180M3发酵罐车间大型空气压缩机180M3发酵罐车间大型空气压缩机117发酵车间的空气过滤器发酵车间的空气过滤器11820世纪70年代
细胞融合技术、基因操作技术等生物技术发展,打破了生物种间障碍,能定向地制造出新的有用的微生物:增加微生物体内控制代谢产物产量的基因拷贝数,可以大幅度地提高目标产物的产量将动、植物或某些微生物特有产物的控制基因植入细胞中,快速经济地大量生产这些产物将具有不同性能的多种质粒植入,使新菌株在清除污染或以非粮食物质为原料进行发酵生产或环境保护20世纪70年代细胞融合技术、基因操作技术等生119动物细胞反应器动物细胞反应器120细胞大规模培养技术细胞大规模培养──微生物、动植物细胞、藻类细胞等细胞代谢产物、生物转化、酶、基因表达产物和基因质粒等占生物技术产品的40%以上,达1OOO亿美元。
细胞大规模培养技术细胞大规模培养──微生物、动植物细胞、121发酵工程产业化发展目前,全球发酵产品的年销售额在400亿美元左右,并以每年约7%~8%的速率增长。我国发酵行业生产企业有5000多家,主要发酵产品的年产值高达1300亿元。发酵工程技术给人类社会生产力的发展带来了巨大的潜力涉及到解决人类所面临的食品与营养、健康与环境、资源与能源等重大问题
发酵工程产业化发展目前,全球发酵产品的年销售额在400亿美元12221世纪是生物技术世纪未来学家说:21世纪是生物技术世纪;科学家预言:
21世纪世界即将在生物技术上取得重大突破,新世纪之初,科学方面的主要将在生物学、遗传学和医学、新型生物材料、能源、环境保护上有所突破;经济学家则认为:21世纪20年代,生物经济将由目前的形成阶段进入成长阶段,即工业生产与商业开发阶段。
21世纪是生物技术世纪未来学家说:21世纪是生物技术世纪;123现代生物技术:以基因工程为主导,发酵工程为中心,加上酶工程、细胞工程、蛋白质工程等的一个综合体系。主要包括:重组DNA技术、原生质体技术、突变生物合成、组合生物合成、单克隆抗体、组织培养技术。发酵工艺学课件124具体:开发新产品、改造现有生产菌种、代谢途径工程、生物转化、诊断药物的研制及治疗药物的研制、基因治疗、转基因动物和转基因植物等。发酵工艺学课件125四、发酵以及发酵工业的范畴1.发酵(fermentation)原始定义现代含义:是指利用培养微生物来制得产物的需氧或厌氧的任何过程。发酵工艺学课件1262.发酵工业的范畴(1)微生物菌体发酵(2)微生物酶的生产(3)微生物代谢产物发酵:初级代谢产物和次级代谢产物(4)微生物转化发酵(5)工程菌发酵(6)动植物细胞发酵发酵工艺学课件127五、发酵工艺的培养方法和过程(一)培养方法:1.表面培养法2.深层培养法(二)生产过程1.菌种制备2.种子制备3.发酵4.下游处理五、发酵工艺的培养方法和过程128六、发酵工业的现状及发展趋向发酵工艺学课件129发酵工程在生物技术产业发展中的地位
21世纪的工业生物技术产业,究竟是一个什么样的格局?作为工业生物技术核心的发酵工程,在已经开始的生物经济时代,是处于一种什么状态?能起何种作用?又面临那些课题?这是人们所关注的问题!发酵工程在生物技术产业发展中的地位21世纪的工业生130小结1.发酵的定义,发酵工业的范畴2.生物工程和生物技术的特点3.生物反应过程的一般特点4.发酵工程的发展简史5.发酵过程的一般方法小结1.发酵的定义,发酵工业的范畴131本课程的学习内容通过《发酵工艺学》的学习,将技术基础课和专业课与发酵工业的操作原理结合起来,了解发酵工业控制的特性及共性,并且熟悉发酵工业的工艺流程及常用术语,为今后从事生物技术的有关科研和生产打下良好的基础。此外,发酵工程的最基本问题是过程优化与放大,通过本课程的学习,对上述过程工程问题与生物学基础有较深入的认识,对有关交叉学科的前沿技术在发酵工程中的应用有一定的了解。本课程的学习内容通过《发酵工艺学》的学习,将技术基础课和专业132第八、九章微生物代谢产物的生物合成与调控微生物的3个重要特点:
1.比表面积大
2.及其多样化的代谢反应
3.容易适应多种环境条件两类代谢产物:初级代谢产物次级代谢产物第八、九章微生物代谢产物的生物合成与调控133初级代谢和次级代谢的关系:1.生化代谢(1)具有一个共同的中间体(2)次级代谢产物很多是以初级代谢产物为母体衍生来的初级代谢和次级代谢的关系:134葡萄糖碳架掺入途径:链霉素、卡那
霉素
莽草酸途径:氯霉素、新生霉素
与核苷有关的途径:杀结核菌素
聚酮体和聚丙酸途径:四环素、制霉
菌素、灰黄霉素
由氨基酸衍生的途径:青霉素、头孢
菌素
甲羟戊酸途径:赤霉素
其他复合途径:博雷霉素、大环内酯类葡萄糖碳架掺入途径:链霉素、卡那
135(3)两个代谢途径中所涉及的酶不完全相同(4)都受到菌体代谢的调节,相互交错。2.遗传代谢(1)都受到核内遗传物质DNA的调节控制(2)次级代谢产物还受到与初级代谢产物合成无关的遗传物质的控制。发酵工艺学课件136第一节微生物初级代谢产物的生物合成与调控
一、微生物生物合成的初级代谢产物二、初级代谢产物生物合成中的主要调控机制代谢调控的类型主要有:酶活性的调节,酶合成的调节。(一)酶合成的调节1.酶合成的诱导调节组成酶和诱导酶第一节微生物初级代谢产物的137底物的结构类似物诱导顺序诱导
2.酶合成的阻遏降解酶:诱导和分解代谢产物调节合成酶:反馈调节(1)分解代谢物调节:葡萄糖效应(2)反馈阻遏:单一终产物阻遏、多价阻遏、累加阻遏底物的结构类似物诱导1383.酶合成诱导及阻遏的调节机制:
操纵子学说4.分解代谢产物阻遏机制发酵工艺学课件139(二)酶活性的调节1.酶活性的激活2.酶活性的抑制包括:竞争性抑制和反馈抑制。发酵工艺学课件140反馈抑制:(1)协同反馈抑制(2)累积反馈抑制(3)增效反馈抑制(4)顺序反馈抑制(5)同功酶调节发酵工艺学课件1413.酶活性的调节的机制:调节酶学说(变构酶学说/别构酶学说)(三)能荷调节能荷(%)=×100%三、初级代谢产物生物合成中的主要调控机制的实际应用3.酶活性的调节的机制:142第二节微生物次级代谢产物的生物合成与调控一、微生物合成的次级代谢产物的基本特征1.次级代谢产物具有种的特异性2.产生菌生长周期可分为三个时期3.次级代谢产物大多是结构相似的混合物4.次级代谢产物的合成受多基因控制发酵工艺学课件143二、次级代谢产物的构建单位前体1.短链脂肪酸与聚酮体内酯环(大环内酯类)、四环类、蒽醌环2.甲羟戊酸赤霉素、生物碱等3.糖类和氨基酸大环内酯二、次级代谢产物的构建单位1444.非蛋白氨基酸D-氨基酸、N-甲基氨基酸、脱氢的和B-氨基酸5.环多醇和氨基环多醇氨基糖苷类发酵工艺学课件145三、次级代谢产物生物合成的主要调控机制(一)酶合成的诱导调节(二)反馈调节1.自身反馈调节抑制抗生素自身合成需要的抗生素浓度与产生菌的生产能力成正比关系。2.前体物质的自身反馈抑制缬氨酸的反馈作用3.支路产物的反馈抑制赖氨酸和青霉素的合成三、次级代谢产物生物合成的主要调控机制1464.次级代谢产物的自身反馈调节(三)磷酸盐的调节0.3~300mmol/L生长10mmol/L表现出抑制1.促进初级代谢,抑制菌体的次级代谢2.抑制次级代谢产物前体的生物合成3.阻抑次级代谢中的磷酸酯酶4.ATP的调节5.对次级代谢产物生物合成的调节机制4.次级代谢产物的自身反馈调节147(四)碳分解产物的调节作用及机理(五)氮分解产物的调控1.次级代谢产物生物合成酶的合成2.铵能调节糖代谢中的某些酶的活性3.铵能调节某些氨基酸的合成4.铵能调节产生菌的淀粉酶和蛋白酶的活性(六)产生菌生长速率的调节(七)溶解氧的调节作用(四)碳分解产物的调节作用及机理148小结1.基本概念2.酶调节的机制3.次级代谢产物调节的特点。小结1.基本概念149第二章菌种选育理论与技术利用工业微生物发酵生产的过程中,决定生产水平高低最主要的有三个方面的因素:生产菌种,发酵工艺和后提取工艺。其中最重要的是生产菌种。菌种选育的最初目的是改良菌种的特性,使其符合工业生产的要求。第二章菌种选育理论与技术利用工业微生物发酵生产的过程中,决150菌种选育的目的菌种选育的目的151菌种选育的基本内容
根据菌种自然变异而进行的自然选育,以及用人工方法引起菌种变异或形成新的杂种,再按照工业生产的要求进行筛选来获得新的变种或杂种。菌种选育的基本内容根据菌种自然变异而进行的自然选育,以及用152菌种选育技术自然选育、诱变育种等方法属于经验育种的范畴;原生质体技术、杂交育种、分子生物学方法等现代菌种选育技术。菌种选育技术自然选育、诱变育种等方法属于经验育种的范畴;153第一节自然选育自然选育是一种纯种选育的方法。它利用微生物在一定条件下产生自发突变的原理,通过分离,筛选排除衰退型菌株,从中选择维持原有生产水平的菌株。第一节自然选育自然选育154一、自然选育的目的1.纯化菌种2.防止菌种衰退3.稳定生产4.提高产量一、自然选育的目的1.纯化菌种155一、菌种退化与变异原因
1.菌种遗传特性的改变(1)遗传基因型的分离异核体现象(2)自发突变(回复突变)自发突变的原因:①用沙土管等长期保藏;②菌种连续传代,这种自发突变比保藏过程中产生的比例要高;③活细胞内进行的新陈代谢活动,能产生一些具有诱变作用的物质,当这些物质在胞内累积到一定浓度时能诱发DNA结构的改变。④DNA中存在的增变基因也能诱发基因突变。⑤有的微生物的染色体上还存在有导致菌体退化的死亡基因,DNA的代谢失调也会引起基因突变而造成菌种退化。⑥多因素低剂量的诱变效应⑦互变异构效应一、菌种退化与变异原因1.菌种遗传特性的改变1562.经诱变剂处理后的退化变异
①初筛出的菌落可能是由成对或成堆孢子发育成的,其中只有一个细胞诱发了基因突变,在传代中细胞核分裂时,未发生基因突变的细胞逐渐在数量上占优势,便表现出产量下降。②可能是诱变菌种的细胞是异核体,而发生基因突变的只是其中一个细胞核的遗传基因。那么在传代过程中由于产生细胞核的分离现象,高产突变基因的核在数量上失去了优势,便出现产量性状的退化变异。③突变发生在无意义链上,在遗传信息传递过程中被丢失,致使正突变性状的消失。④在诱变剂的作用下,被诱变菌种出现基因混杂,突变的高产基因虽然已经传递到下一代,但在传代使用过程中,当环境条件适合于低产型突变株繁殖时,使其在数量上占优势,便表现出低产水平。
2.经诱变剂处理后的退化变异①初筛出的菌落可能是由成对或成1573.菌种生理状况的改变(1)一个菌种不是一个单一的群体,而是由一些变株混合而成的,这些变株所占的比例决定该菌种的特性。(2)菌种培养基的影响。(3)在某些培养条件下,菌体的某些基因处于活化状态或阻遏状态,而使得菌种的生理状态改变。3.菌种生理状况的改变(1)一个菌种不是一个单一的群体,而是158二、自然选育的方法二、自然选育的方法1591.单孢子悬浮液的制备定量稀释后制成50~200个单细胞/ml的菌悬液2.分离及单菌落培养根据计数结果,按丝状真菌、放线菌菌落大小不同,分离量以5~20个菌落/平皿为宜。
3.筛选将分离培养后的各型单菌落,接斜面培养,成熟后接入发酵瓶,测定发酵单位的过程称为筛选。它分初筛、复筛两个过程。初筛系指初步筛选,以多量筛选为原则。复筛是对初筛得到的高产菌株的复试,以挑选出稳定高产菌株为原则。1.单孢子悬浮液的制备160初筛、复筛都要同时以生产菌株作对照。复筛选出的高单位菌株至少要比对照菌株产量提高5%以上,并经过菌落纯度、摇瓶单位波动情况,以及糖、氮代谢等的考察,合格后方可在生产罐上试验。复筛得到的高单位菌株应制成沙土管、冷冻管或液氮管进行保藏。发酵工艺学课件161第二节诱变育种通过诱变剂处理就可以大大提高菌种的突变频率,扩大变异幅度,从中选出具有优良特性的变异菌株,这种方法就称为诱变育种。诱变育种的特点:具有速度快、收效大、方法简便;但是诱发突变缺乏定向性、工作量大。诱变育种工作主要包括出发菌株的选择、诱变处理和筛选突变株三个部分。第二节诱变育种通过诱变剂处理就可以大大提高菌种的突变频率162发酵工艺学课件163一、诱变剂的种类1.物理诱变剂紫外线、快中子、X射线、r-射线、激光2.化学诱变剂(1)碱基类似物:5-Bu(2)与碱基起反应的物质:亚硝酸、氮芥、羟胺、硫酸二乙酯、NTG(N-甲基-N-硝基-N-硝基胍)(3)丫啶类3.生物诱变剂:噬菌体一、诱变剂的种类1.物理诱变剂164二、突变诱发过程前突变:诱变剂所造成的DNA分子的某一位置的结构改变称之。前突变可以通过影响DNA复制而成为真正的突变,也可以经过修复重新回到原有的结构,即不发生突变。二、突变诱发过程165(一)诱变剂接触DNA分子前1.细胞对诱变剂的透性将影响诱变效果。2.细胞质的某些组分和某些酶可和诱变剂相互作用而影响诱变效果。3.与基因所处的状态有关,而基因的状态又和培养条件有关。(一)诱变剂接触DNA分子前1.细胞对诱变剂的透性将影响诱变166(二)DNA损伤的修复
微生物有五种方式来修复DNA损伤。1.光复活作用2.切补修复:
四种酶的作用:核酸内切酶、核酸外切酶、DNA多聚酶、DNA连接酶3.重组修复:又称为复制后修复4.SOS修复系统
5.DNA多聚酶的校正作用:增变突变型(二)DNA损伤的修复167(三)从前突变到突变校正差错:光复活作用、切补修复和DNA多聚酶校正作用引起差错:重组修复和SOS修复系统一切影响这些修复系统中的酶活性的因素都能影响由前突变向突变转变这一过程。诱变前后的处理可影响诱变的效果:1.通过影响与DNA修复作用有关的酶的活性而影响诱变的效果;2.通过使诱变的目的基因处于活化状态(复制或转录状态),使之更容易被诱变剂所作用,从而影响目的基因的突变率。
(三)从前突变到突变校正差错:光复活作用、切补修复和DNA168(四)从突变到突变型表型迟延:突变基因的出现并不等于突变表型的出现,表型的改变落后于基因型改变的现象。1.分离性迟延是经诱变处理后,细胞中的基因处于不纯的状态(野生型基因和突变型基因并存于同一细胞中),突变型基因由于属于隐性基因而暂时得不到表达,需经过复制、分离,在细胞中处于纯的状态(一细胞中只有突变型基因,没有野生型基因)时,其性状才得以表达。2.生理性迟延突变基因由杂合状态变为纯合状态时,还不一定出现突变表型,新的表型必须等到原有基因的产物稀释到某一程度后才能表现出来。
(四)从突变到突变型表型迟延:突变基因的出现并不等于突变表169三、诱变育种方案的设计诱变育种包括三个环节:突变的诱发、突变株的筛选和突变高产基因的表现。
(一)制定筛选目标
(二)制定筛选方案
1.诱变过程
(1)出发菌种的斜面
(2)单孢子悬浮液制备
(3)孢子计数
(4)单菌落分离三、诱变育种方案的设计诱变育种包括三个环节:突变的诱发、突变1702.筛选过程
(1)传种斜面(2)留种保藏菌种(3)筛选高产菌株
2.筛选过程(1)传种斜面171
四、突变的诱发突变的诱发受到菌种的遗传特性、诱变剂、菌种的生理状态以及诱变处理时环境条件的影响。1.出发出株的选择(1)选择纯种选择发酵产量稳定、波动范围小的菌株(2)选择具有优良性状的出发菌株选择的出发菌株应当具有我们所需要的代谢特性(3)对诱变剂敏感可以提高变异频率,而且高产突变株的出现率也大(4)选择多个出发菌株
四、突变的诱发1722.诱变剂的选择(1)根据出发菌株的遗传背景(2)菌株遗传性质的稳定程度(3)诱变剂本身的特点(4)诱变剂的剂量2.诱变剂的选择(1)根据出发菌株的遗传背景173
3.影响诱变效果的因素
(1)菌种的遗传稳定性以及对诱变剂的敏感性(2)菌种的生理状态(3)菌种的预处理和后处理条件(4)其他外界条件
3.影响诱变效果的因素174五、突变株的筛选(一)随机筛选1.摇瓶筛选法2.琼脂块筛选法3.筛选自动化和筛选工具微型化
(二)理性化筛选指运用遗传学、生物化学的原理,根据产物已知的或可能的生物合成途径、代谢调控机制和产物分子结构来进行设计和采用一些筛选方法,以打破微生物原有的代谢调控机制,获得能大量形成产物的高产突变株的筛选方法。五、突变株的筛选(一)随机筛选1751.初级代谢产物高产菌株的筛选
(1)降低终产物浓度:①筛选终产物营养缺陷型②筛选细胞膜透性改变的突变株
(2)筛选抗反馈调节突变菌株①筛选结构类似物(抗代谢物)抗性突变株抗反馈抑制、抗反馈阻遏②利用回复突变筛选抗反馈突变菌株
1.初级代谢产物高产菌株的筛选(1)降低终产物浓度:1762.次级代谢产物(主要是抗生素)高产
菌株的筛选(1)利用营养缺陷型筛选渗漏缺陷型是遗传性障碍不完全的营养缺陷型,突变使某一种酶的活性下降而不是完全丧失,所以这种缺陷型能够少量地合成某一代谢产物,能在基本培养基上少量地生长。(2)筛选负变株或零变株的回复突变株(3)筛选去磷酸盐调节突变株(4)筛选去碳源分解代谢调节突变株(5)筛选氨基酸结构类似物抗性突变株2.次级代谢产物(主要是抗生素)高产
菌株的筛选(177(6)筛选二价金属离子抗性突变株(7)筛选前体或前体结构类似物抗性突变株(8)筛选自身所产的抗生素抗性突变株3.营养缺陷型筛选(1)营养缺陷型的富集抗生素富集法、过滤法。(2)营养缺陷型的检出点种法、夹层琼脂法(3)营养缺陷型的鉴定点种法、生长谱法六、突变高产基因的表现发酵工艺学课件178七、诱变育种工作前的准备工作1.菌种培养特性的摸索。2.最佳培养条件的摸索。3.产单位高峰时间。4.菌种保藏条件的建立。5.菌种的遗传背景。七、诱变育种工作前的准备工作1.菌种培养特性的摸索。179第三节杂交育种杂交育种是指将两个基因型不同的菌株经吻合(或接合)使遗传物质重新组合,从中分离和筛选具有新性状的菌株。杂交育种的目的在于:(1)通过杂交使不同菌株的遗传物质进行交换和重新组合,从而改变原有菌株的遗传物质基础,获得杂种菌株(重组体);(2)可以通过杂交把不同菌株的优良生产性能集中于重组体中,克服长期用诱变剂处理造成的菌株生活力下降等缺陷;(3)通过杂交,可以扩大变异范围,改变产品的质量和产量,甚至出现新的品种;(4)分析杂交结果
温馨提示
- 1. 本站所有资源如无特殊说明,都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
- 2. 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等,如果需要附件,请联系上传者。文件的所有权益归上传用户所有。
- 3. 本站RAR压缩包中若带图纸,网页内容里面会有图纸预览,若没有图纸预览就没有图纸。
- 4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
- 5. 人人文库网仅提供信息存储空间,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑,并不能对任何下载内容负责。
- 6. 下载文件中如有侵权或不适当内容,请与我们联系,我们立即纠正。
- 7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。
最新文档
- 环氧地坪漆工程合同范本
- 2024年度企业间广告发布协议3篇
- 2024年度工程建筑设计风险评估与控制合同2篇
- 艺术品展览合作合同
- 2024年度学校官方网站建设与维护合同2篇
- 美容美发店与顾客的2024年度会员服务合同
- 保教评估指南测试题
- 2024权许可使用及分成合同2篇
- 2024年度工程废料绿色运输合作协议3篇
- 2024版水电工程承包商服务合同3篇
- 护士长管理能力提升-课件
- 四年级数学上册试题- 竞赛试题A卷(含答案)人教新课标
- 六年级家长会完整版课件
- 发现你的优势课件
- 会说话的百分数-课件完整版
- TCAEC 003-2021 化工建设工程监理规程
- 九年级上期中家长会(共35张)课件
- 实验室定置化管理标准
- 六年级上册数学课件-求比一个数多(少)百分之几的数是多少 人教版
- 高中地理湘教版中国的洪涝灾害-以望谟县洪涝灾害为例部优课件
- 肌张力障碍精美医学
评论
0/150
提交评论