最新43饲料中粗蛋白的测定课件

43饲料中粗蛋白的测定43饲料中粗蛋白的测定

一、蛋白质的测定方法2．间接法

通过测定样品中总含氮量推算蛋白质含量（根据：每种蛋白质的含氮量是恒定的，N×6.25）。凯氏定氮法（Kjeldahl）8~9小时杜马斯燃烧定氮法（DumasCombustionMethod）—900℃~1200℃高温燃烧，燃烧过程中产生混合气体，其中的干扰成分被一系列适当的吸收剂所吸收，混合气体中的氮氧化物被全部还原成分子氮，随后氮的含量被热导检测器检测。3～5分钟强碱直接蒸馏法

—样品在强碱溶液中消煮，使蛋白质中的不稳定氮素以氨的形式释放出来，在一定条件下，所释放的氨和样品中的含氮量成正比且有很好的相关性，建立不稳定氮量与全氮量之间的回归方程。～20分钟

纳氏试剂比色法一、蛋白质的测定方法2．间接法

二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量19世纪（1883）建立的经典方法，结果可靠（最常用的标准方法），凯氏定氮法由于具有测定总有机氮量准确度高，可测定各种不同形态样品等两大优点，因而被公认为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准分析方法。但操作费时（8～9h）——改良方法：加催化剂加快分析速度、仪器改进（自动、半自动凯氏定氮仪）。

二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量19世纪（1883）建立的经

二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量1.原理

各种饲料的有机物质在还原性催化剂（如CuSO4，K2SO4或Na2SO4或Se粉）的帮助下，用浓硫酸进行消化作用，使蛋白质和其它有机态氮（如氨基酸、酰胺、核酸，在一定处理下也包括硝酸态氨）都转变成NH4+并与H2SO4化合成（NH4）2SO4，而非含氮物质，则以CO2↑，H2O↑，SO2↑状态逸出。然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量1.原理

二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量1.原理

：使有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮；

：将有机物炭化后的碳化为二氧化碳，硫酸则被还原成二氧化硫；

2H2SO4

＋C＝2SO2＋2H2O＋CO2

二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。

H2SO4＋2NH3

＝(NH4)2SO42NH2(CH)2COOH＋13H2SO4＝(NH4)2SO4

＋6CO2＋12SO2

＋16H2O①样品消化浓硫酸具有脱水性浓硫酸具有氧化性二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量1.原理2NH2(CH)2最新43饲料中粗蛋白的测定课件最新43饲料中粗蛋白的测定课件

二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量1.原理

消化液在浓碱的作用下进行蒸馏，释放出的氨态氮，用硼酸溶液吸收之并与之结合成为四硼酸铵。

②蒸馏2NaOH＋(NH4)2SO4＝

2NH3↓＋Na2SO4＋2H2O2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量1.原理②蒸馏2NaOH

二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量1.原理

以甲基红－溴甲酚绿作指示剂，用HCl标准溶液（0.1mol/L）滴定，根据标准酸的消耗量，即可计算有机氮的含量。而后，根据不同的饲料再乘以一定的系数（通常用6.25系数计算），即为粗蛋白质的含量。③滴定

(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量1.原理③滴定(NH4

二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量凯氏定氮瓶（或消化管）及蒸馏装置硫酸铜硫酸钾硫酸2%硼酸溶液

40%氢氧化钠溶液0.2%甲基红0.2%溴甲酚绿0.2%甲基红及0.2%溴甲酚绿的1+5混合指示剂0.1mol/L的标准盐酸溶液(或1/2硫酸溶液)2.主要仪器及试剂二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量凯氏定氮瓶（或消化管）及蒸馏

二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3.测定步骤

第一步样品消化

称取适量样品0.5~1g（含氮量5～80mg），无损失（用滤纸包好）地放入干燥凯氏烧瓶或消化管中，加入0.2g硫酸铜（CuSO4·5H2O），3g无水硫酸钾（或无水硫酸钠）及10mL硫酸，轻轻摇匀后进行消化。（样品＋CuSO4·5H2O＋K2SO4＋浓硫酸）透明蓝绿色空白试验：取与处理样品相同量的硫酸铜，硫酸钾，硫酸按同一方法作试剂空白试验。二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3.测定步骤空白试验：取与

二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3.测定步骤

第一步样品消化

硫酸铜/无水硫酸钾（或无水硫酸钠）的作用？（大家想想！）

（1）K2SO4或Na2SO4的作用：提高溶液的沸点而加快有机物的分解；K2SO4+H2SO4=2KHSO4

2KHSO4=K2SO4+H2O↑+SO3

但硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过高，又会引起已生成的铵盐发生热分解而造成损失。二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3.测定步骤

二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3.测定步骤

第一步样品消化

硫酸铜/无水硫酸钾（或无水硫酸钠）的作用？（大家想想！）

（2）CuSO4的作用

①催化剂，加速氧化分解；

2CuSO4=CuSO4+SO2↑+O2C+2CuSO4=Cu2SO4+SO2↑+O2↑Cu2SO4+2H2SO4=2CuSO4+2H2O+SO2↑

此反应不断进行，待有机物被消化完后，不再有硫酸亚铜（褐色）生成，溶液呈现清澈的蓝绿色。

②可以指示消化终点的到达；

③下一步蒸馏时作为碱性反应（加入碱量）的指示剂。二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3.测定步骤

二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3.测定步骤

第一步样品消化注意事项：总氮测定时，消化至关重要。①消化在通风橱中进行（若无通风橱......）。②在消化开始时，应控制火力（应从低温开始分阶段升温至360～410℃

），保持缓慢沸腾，避免试样溅于瓶壁，难于消化使氨损失。③实验中要保证硫酸足量，否则过多的硫酸钾形成硫酸氢钾，而削弱了硫酸的消化作用。二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3.测定步骤

二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3.测定步骤

第二步氨的蒸馏

样品分解液定容

试样消煮液令却，小心加20ml水，移人100ml容量瓶中，冷却后，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容置瓶中，再加水至刻度，作为试样分解液备用。二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3.测定步骤

二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3.测定步骤

第二步氨的蒸馏

蒸馏

①蒸汽发生器的准备：装好定氮装量，于水蒸气发生瓶内装蒸馏水至约2／3处，加甲基红指示液数滴及硫酸数滴，以保持水呈酸性（水为橙红色，否则补加硫酸，大家想想为什么？）。加入数粒玻璃珠以防暴沸，用调压器控制，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。防止水中氨态氮的逸失而影响测定值。二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3.测定步骤防止水中氨态氮

二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3.测定步骤

第二步氨的蒸馏

蒸馏②硼酸溶液的准备：向接收瓶内加入20mL2%硼酸及2滴混合指示剂并使冷凝管下端插入液面下。

二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3.测定步骤

二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3.测定步骤

第二步氨的蒸馏

蒸馏③开始蒸馏：吸取10.0mL样品消化稀释液注入凯氏定氮仪的反应室中，用10mL蒸馏水冲洗进样入口，再加10mL40%氢氧化钠溶液入反应室（动作要快，以防氨逸出），塞好入口玻璃塞，在入口处加水密封，防止漏气。打开水蒸汽发生器与反应室之间的夹子，蒸汽通入反应室使氨气被蒸发出来，并通过冷凝管而进入接收瓶内，以第一滴馏液滴下开始计时，蒸馏5min，使冷凝管离开吸收液面，在蒸馏1min，用水冲洗冷凝管末端，洗液流入接收瓶中，取下接收瓶。最后关闭电源，绝不能先关闭电源，否则吸收液将发生倒吸！二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3.测定步骤

二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3.测定步骤

第二步氨的蒸馏注意事项：凯氏定氮蒸馏过程中，要求整套装置呈密闭状态，蒸馏前应检查定氮仪各导管间的连接处是否密闭，以免产生泄露；测定样品前应清洗蒸馏装置，即用蒸馏水空蒸一次或数次；蒸馏后立即清洗蒸馏器。蒸馏完毕后，移取热源，夹紧蒸汽发生器和收集器间的橡皮管，此时由于收集器温度突然下降，即可将反应室残液吸至收集器。蒸馏时，火力稳定，蒸汽发生要均匀充足，蒸馏中途不得停火断汽，否则发生倒吸。加碱要足量（反应室液体呈深蓝色或褐色）并且碱液不能污染冷凝管及接收瓶。二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3.测定步骤

二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3.测定步骤

第三步滴定用微量酸式滴定管，以0.1或0.02mol/L盐酸标准溶液进行滴定，溶液由蓝绿色变为灰红色为终点。空白试验：同时取10.0mL空白消化稀释液同上操作，以校正药品不纯所发生的误差。

二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3.测定步骤

二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量4．结果计算CP——样品中蛋白质的含量（%）；V1——样品消耗盐酸标准液的体积（mL）；V2——空白实验消耗盐酸标准液的体积（mL）；C——盐酸标准溶液通过标定后的摩尔浓度（mol/L）；0.014——每毫升盐酸标准液（1mol/L）相当于氮的克数；m——样品质量（g）；6.25——氮换算为蛋白质的系数（换算系数）。（大家想想6.25是如何计算出来的？）二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量4．结果计算

二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量5.方法的评价凯氏法的优点是适用范围广，可用于动植物的各种组织，器官、各种饲料等成组复杂样品的测定，只要细心操作都能得到较准确的结果，至今仍被作为标准检验方法。但此法灵敏度低，适用于0.2-1.0mg氮，操作比较复杂，所需时间长。

用凯氏定氮法通过测总氮量来确定蛋白质含量，包含了核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉、以及含氮色素等非蛋白质含氮化合物，所以这样的测定结果称为粗蛋白。

事件二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量5.方法的评价事件

二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量5.方法的评价不同的蛋白质其氨基酸组成及比例方式不同，故各种不同的蛋白质其含氮量也不同（约在14.7～19.5％，平均为16％），因而不同蛋白质系数也不一样。

Tyr（酪氨酸）：分子量181.9，含氮量7.69；Ala（丙氨酸）：分子量89.1，含氮量15.7；Lys（赖氨酸）：分子量146.9，含氮量9.06。二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量5.方法的评价Tyr（酪氨

三、蛋白质含量测定的其它方法（直接法）（一）双缩脲法（Biuret法）1．原理

双缩脲是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。NH2-CO-NH2+NH2-CO-NH2

NH2-CO-NH-CO-NH2

+NH3

在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。蛋白质及多肽含有两个以上的肽键（—CO—NH—），与双缩脲的结构类似，也能与Cu2+形成紫红色络合物，其最大光吸收在540nm处。其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸的组成无关。故可用来测定蛋白质含量。三、蛋白质含量测定的其它方法（直接法）（一）双缩脲法

三、蛋白质含量测定的其它方法（直接法）（一）双缩脲法（Biuret法）1．原理

在一定条件下，未知样品的溶液与标准蛋白质溶液同时反应，并于540—560nm下比色，可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知的蛋白质浓度，标准蛋白溶液可以用结晶的牛（或人）血清白蛋白、卵清蛋白或酪蛋白粉末配制。三、蛋白质含量测定的其它方法（直接法）（一）双缩脲法（B

三、蛋白质含量测定的其它方法（直接法）（一）双缩脲法（Biuret法）2．方法评价该法的优点是样品不需消化处理，结果为饲料中蛋白质的真实含量，操作简单，具有快速、准确等优点。但二肽含量不能测定（想想为什么？）。该法灵敏度低，测定蛋白质的浓度范围适于1~10mg/mL。双缩脲法常用于蛋白质的快速测定，但并不需要十分精确的蛋白质测定。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。除-CO-NH-有此反应外，-CONH2-，-CH2-，NH2-，-CS-CS-NH2，等基团亦有此反应。

三、蛋白质含量测定的其它方法（直接法）（一）双缩脲法（B

三、蛋白质含量测定的其它方法（直接法）（二）Folin-酚试剂法(Lowry法)1．原理

此法的显色原理与双缩脲方法相同，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。

这两种显色反应产生深兰色，原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸或色氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。三、蛋白质含量测定的其它方法（直接法）（二）Folin-

三、蛋白质含量测定的其它方法（直接法）（二）Folin-酚试剂法(Lowry法)2．方法评价本法的优点是操作简便、灵敏度高,定量范围为5～100μg蛋白质，较双缩脲法灵敏100倍。此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。其不足之处是此反应受多种因素干扰。Folin试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用。不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。Folin—酚试剂的配制较为困难（现在已可以订购）。三、蛋白质含量测定的其它方法（直接法）（二）Folin-

三、蛋白质含量测定的其它方法（直接法）（三）紫外吸收法1．原理

蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。

此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。三、蛋白质含量测定的其它方法（直接法）（三）紫外吸收法

三、蛋白质含量测定的其它方法（直接法）（三）紫外吸收法2．方法评价紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。低浓度的盐，例如生化制备中常用的(NH4)2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。三、蛋白质含量测定的其它方法（直接法）（三）紫外吸收法

三、蛋白质含量测定的其它方法（直接法）（三）紫外吸收法2．方法评价若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。此外，进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，因此要注意溶液的pH值，测定样品时的ph要与测定标准曲线的pH相一致。因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间。三、蛋白质含量测定的其它方法（直接法）（三）紫外吸收法

三、蛋白质含量测定的其它方法（直接法）（四）考马斯亮蓝染色法1．原理

考马斯亮蓝G-250（CoomassiebrilliantblueG-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。三、蛋白质含量测定的其它方法（直接法）（四）考马斯亮蓝染

三、蛋白质含量测定的其它方法（直接法）经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。该法是1976年Bradford建立，因而又叫Bradford法。PROTEIN+Amax=595nmBLUEAcidCoomassieG-250Protein-DyeComplexOCH2CH3NHCCH3CH3NCH2SO3-CH3CH2NCH2CH2CH3SO3Na+（四）考马斯亮蓝染色法1．原理三、蛋白质含量测定的其它方法（直接法）经研究认为，染料主

三、蛋白质含量测定的其它方法（直接法）试剂配制简单，干扰物质少，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定浓度范围为0～1000μg/mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。操作简便快捷，完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。（四）考马斯亮蓝染色法2．方法评价三、蛋白质含量测定的其它方法（直接法）试剂配制简单，干扰

三、蛋白质含量测定的其它方法（直接法）（四）考马斯亮蓝染色法2．方法评价有些阳离子，如K+、Na+、Mg2+、(NH4)2SO4、乙醇等物质不干扰测定，但大量的去污剂如TritonX-100、SDS等严重干扰测定。由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用γ—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。三、蛋白质含量测定的其它方法（直接法）（四）考马斯亮蓝染相关事件三鹿毒奶粉事件（2008）美国宠物饲料事件：“宠物毒粮”

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一、蛋白质的测定方法2．间接法

通过测定样品中总含氮量推算蛋白质含量（根据：每种蛋白质的含氮量是恒定的，N×6.25）。凯氏定氮法（Kjeldahl）8~9小时杜马斯燃烧定氮法（DumasCombustionMethod）—900℃~1200℃高温燃烧，燃烧过程中产生混合气体，其中的干扰成分被一系列适当的吸收剂所吸收，混合气体中的氮氧化物被全部还原成分子氮，随后氮的含量被热导检测器检测。3～5分钟强碱直接蒸馏法

—样品在强碱溶液中消煮，使蛋白质中的不稳定氮素以氨的形式释放出来，在一定条件下，所释放的氨和样品中的含氮量成正比且有很好的相关性，建立不稳定氮量与全氮量之间的回归方程。～20分钟

纳氏试剂比色法一、蛋白质的测定方法2．间接法

二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量19世纪（1883）建立的经典方法，结果可靠（最常用的标准方法），凯氏定氮法由于具有测定总有机氮量准确度高，可测定各种不同形态样品等两大优点，因而被公认为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准分析方法。但操作费时（8～9h）——改良方法：加催化剂加快分析速度、仪器改进（自动、半自动凯氏定氮仪）。

二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量19世纪（1883）建立的经

二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量1.原理

各种饲料的有机物质在还原性催化剂（如CuSO4，K2SO4或Na2SO4或Se粉）的帮助下，用浓硫酸进行消化作用，使蛋白质和其它有机态氮（如氨基酸、酰胺、核酸，在一定处理下也包括硝酸态氨）都转变成NH4+并与H2SO4化合成（NH4）2SO4，而非含氮物质，则以CO2↑，H2O↑，SO2↑状态逸出。然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量1.原理

二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量1.原理

：使有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮；

：将有机物炭化后的碳化为二氧化碳，硫酸则被还原成二氧化硫；

2H2SO4

＋C＝2SO2＋2H2O＋CO2

二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。

H2SO4＋2NH3

＝(NH4)2SO42NH2(CH)2COOH＋13H2SO4＝(NH4)2SO4

＋6CO2＋12SO2

＋16H2O①样品消化浓硫酸具有脱水性浓硫酸具有氧化性二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量1.原理2NH2(CH)2最新43饲料中粗蛋白的测定课件最新43饲料中粗蛋白的测定课件

二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量1.原理

消化液在浓碱的作用下进行蒸馏，释放出的氨态氮，用硼酸溶液吸收之并与之结合成为四硼酸铵。

②蒸馏2NaOH＋(NH4)2SO4＝

2NH3↓＋Na2SO4＋2H2O2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量1.原理②蒸馏2NaOH

二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量1.原理

以甲基红－溴甲酚绿作指示剂，用HCl标准溶液（0.1mol/L）滴定，根据标准酸的消耗量，即可计算有机氮的含量。而后，根据不同的饲料再乘以一定的系数（通常用6.25系数计算），即为粗蛋白质的含量。③滴定

(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量1.原理③滴定(NH4

二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量凯氏定氮瓶（或消化管）及蒸馏装置硫酸铜硫酸钾硫酸2%硼酸溶液

40%氢氧化钠溶液0.2%甲基红0.2%溴甲酚绿0.2%甲基红及0.2%溴甲酚绿的1+5混合指示剂0.1mol/L的标准盐酸溶液(或1/2硫酸溶液)2.主要仪器及试剂二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量凯氏定氮瓶（或消化管）及蒸馏

二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3.测定步骤

第一步样品消化

称取适量样品0.5~1g（含氮量5～80mg），无损失（用滤纸包好）地放入干燥凯氏烧瓶或消化管中，加入0.2g硫酸铜（CuSO4·5H2O），3g无水硫酸钾（或无水硫酸钠）及10mL硫酸，轻轻摇匀后进行消化。（样品＋CuSO4·5H2O＋K2SO4＋浓硫酸）透明蓝绿色空白试验：取与处理样品相同量的硫酸铜，硫酸钾，硫酸按同一方法作试剂空白试验。二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3.测定步骤空白试验：取与

二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3.测定步骤

第一步样品消化

硫酸铜/无水硫酸钾（或无水硫酸钠）的作用？（大家想想！）

（1）K2SO4或Na2SO4的作用：提高溶液的沸点而加快有机物的分解；K2SO4+H2SO4=2KHSO4

2KHSO4=K2SO4+H2O↑+SO3

但硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过高，又会引起已生成的铵盐发生热分解而造成损失。二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3.测定步骤

二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3.测定步骤

第一步样品消化

硫酸铜/无水硫酸钾（或无水硫酸钠）的作用？（大家想想！）

（2）CuSO4的作用

①催化剂，加速氧化分解；

2CuSO4=CuSO4+SO2↑+O2C+2CuSO4=Cu2SO4+SO2↑+O2↑Cu2SO4+2H2SO4=2CuSO4+2H2O+SO2↑

此反应不断进行，待有机物被消化完后，不再有硫酸亚铜（褐色）生成，溶液呈现清澈的蓝绿色。

②可以指示消化终点的到达；

③下一步蒸馏时作为碱性反应（加入碱量）的指示剂。二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3.测定步骤

二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3.测定步骤

第一步样品消化注意事项：总氮测定时，消化至关重要。①消化在通风橱中进行（若无通风橱......）。②在消化开始时，应控制火力（应从低温开始分阶段升温至360～410℃

），保持缓慢沸腾，避免试样溅于瓶壁，难于消化使氨损失。③实验中要保证硫酸足量，否则过多的硫酸钾形成硫酸氢钾，而削弱了硫酸的消化作用。二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3.测定步骤

二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3.测定步骤

第二步氨的蒸馏

样品分解液定容

试样消煮液令却，小心加20ml水，移人100ml容量瓶中，冷却后，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容置瓶中，再加水至刻度，作为试样分解液备用。二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3.测定步骤

二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3.测定步骤

第二步氨的蒸馏

蒸馏

①蒸汽发生器的准备：装好定氮装量，于水蒸气发生瓶内装蒸馏水至约2／3处，加甲基红指示液数滴及硫酸数滴，以保持水呈酸性（水为橙红色，否则补加硫酸，大家想想为什么？）。加入数粒玻璃珠以防暴沸，用调压器控制，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。防止水中氨态氮的逸失而影响测定值。二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3.测定步骤防止水中氨态氮

二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3.测定步骤

第二步氨的蒸馏

蒸馏②硼酸溶液的准备：向接收瓶内加入20mL2%硼酸及2滴混合指示剂并使冷凝管下端插入液面下。

二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3.测定步骤

二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3.测定步骤

第二步氨的蒸馏

蒸馏③开始蒸馏：吸取10.0mL样品消化稀释液注入凯氏定氮仪的反应室中，用10mL蒸馏水冲洗进样入口，再加10mL40%氢氧化钠溶液入反应室（动作要快，以防氨逸出），塞好入口玻璃塞，在入口处加水密封，防止漏气。打开水蒸汽发生器与反应室之间的夹子，蒸汽通入反应室使氨气被蒸发出来，并通过冷凝管而进入接收瓶内，以第一滴馏液滴下开始计时，蒸馏5min，使冷凝管离开吸收液面，在蒸馏1min，用水冲洗冷凝管末端，洗液流入接收瓶中，取下接收瓶。最后关闭电源，绝不能先关闭电源，否则吸收液将发生倒吸！二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3.测定步骤

二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3.测定步骤

第二步氨的蒸馏注意事项：凯氏定氮蒸馏过程中，要求整套装置呈密闭状态，蒸馏前应检查定氮仪各导管间的连接处是否密闭，以免产生泄露；测定样品前应清洗蒸馏装置，即用蒸馏水空蒸一次或数次；蒸馏后立即清洗蒸馏器。蒸馏完毕后，移取热源，夹紧蒸汽发生器和收集器间的橡皮管，此时由于收集器温度突然下降，即可将反应室残液吸至收集器。蒸馏时，火力稳定，蒸汽发生要均匀充足，蒸馏中途不得停火断汽，否则发生倒吸。加碱要足量（反应室液体呈深蓝色或褐色）并且碱液不能污染冷凝管及接收瓶。二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3.测定步骤

二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3.测定步骤

第三步滴定用微量酸式滴定管，以0.1或0.02mol/L盐酸标准溶液进行滴定，溶液由蓝绿色变为灰红色为终点。空白试验：同时取10.0mL空白消化稀释液同上操作，以校正药品不纯所发生的误差。

二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3.测定步骤

二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量4．结果计算CP——样品中蛋白质的含量（%）；V1——样品消耗盐酸标准液的体积（mL）；V2——空白实验消耗盐酸标准液的体积（mL）；C——盐酸标准溶液通过标定后的摩尔浓度（mol/L）；0.014——每毫升盐酸标准液（1mol/L）相当于氮的克数；m——样品质量（g）；6.25——氮换算为蛋白质的系数（换算系数）。（大家想想6.25是如何计算出来的？）二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量4．结果计算

二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量5.方法的评价凯氏法的优点是适用范围广，可用于动植物的各种组织，器官、各种饲料等成组复杂样品的测定，只要细心操作都能得到较准确的结果，至今仍被作为标准检验方法。但此法灵敏度低，适用于0.2-1.0mg氮，操作比较复杂，所需时间长。

用凯氏定氮法通过测总氮量来确定蛋白质含量，包含了核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉、以及含氮色素等非蛋白质含氮化合物，所以这样的测定结果称为粗蛋白。

事件二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量5.方法的评价事件

二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量5.方法的评价不同的蛋白质其氨基酸组成及比例方式不同，故各种不同的蛋白质其含氮量也不同（约在14.7～19.5％，平均为16％），因而不同蛋白质系数也不一样。

Tyr（酪氨酸）：分子量181.9，含氮量7.69；Ala（丙氨酸）：分子量89.1，含氮量15.7；Lys（赖氨酸）：分子量146.9，含氮量9.06。二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量5.方法的评价Tyr（酪氨

三、蛋白质含量测定的其它方法（直接法）（一）双缩脲法（Biuret法）1．原理

双缩脲是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。NH2-CO-NH2+NH2-CO-NH2

NH2-CO-NH-CO-NH2

+NH3

在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。蛋白质及多肽含有两个以上的肽键（—CO—NH—），与双缩脲的结构类似，也能与Cu2+形成紫红色络合物，其最大光吸收在540nm处。其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸的组成无关。故可用来测定蛋白质含量。三、蛋白质含量测定的其它方法（直接法）（一）双缩脲法

三、蛋白质含量测定的其它方法（直接法）（一）双缩脲法（Biuret法）1．原理

在一定条件下，未知样品的溶液与标准蛋白质溶液同时反应，并于540—560nm下比色，可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知的蛋白质浓度，标准蛋白溶液可以用结晶的牛（或人）血清白蛋白、卵清蛋白或酪蛋白粉末配制。三、蛋白质含量测定的其它方法（直接法）（一）双缩脲法（B

三、蛋白质含量测定的其它方法（直接法）（一）双缩脲法（Biuret法）2．方法评价该法的优点是样品不需消化处理，结果为饲料中蛋白质的真实含量，操作简单，具有快速、准确等优点。但二肽含量不能测定（想想为什么？）。该法灵敏度低，测定蛋白质的浓度范围适于1~10mg/mL。双缩脲法常用于蛋白质的快速测定，但并不需要十分精确的蛋白质测定。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。除-CO-NH-有此反应外，-CONH2-，-CH2-，NH2-，-CS-CS-NH2，等基团亦有此反应。

三、蛋白质含量测定的其它方法（直接法）（一）双缩脲法（B

三、蛋白质含量测定的其它方法（直接法）（二）Folin-酚试剂法(Lowry法)1．原理

此法的显色原理与双缩脲方法相同，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。

这两种显色反应产生深兰色，原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸或色氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。三、蛋白质含量测定的其它方法（直接法）（二）Folin-

三、蛋白质含量测定的其它方法（直接法）（二）Folin-酚试剂法(Lowry法)2．方法评价本法的优点是操作简便、灵敏度高,定量范围为5～100μg蛋白质，较双缩脲法灵敏100倍。此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。其不足之处是此反应受多种因素干扰。Folin试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用。不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。Folin—酚试剂的配制较为困难（现在已可以订购）。三、蛋白质含量测定的其它方法（直接法）（二）Folin-

三、蛋白质含量测定的其它方法（直接法）（三）紫外吸收法1．原理

蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。

此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。三、蛋白质含量测定的其它方法（直接法）（三）紫外吸收法

三、蛋白质含量测定的其它方法（直接法）（三）紫外吸收法2．方法评价紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。低浓度的盐，例如生化制备中常用的(NH4)2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不