拟南芥漆酶基因AtLAC4参与生长及非生物胁迫响应课件

拟南芥漆酶基因AtLAC4参与生长及非生物胁迫响应符晓婕摘要植物漆酶基因家族在拟南芥中共有17个成员,目前各基因的具体功能尚不十分清楚。该研究利用过量表达的方法初步分析了拟南芥AtLAC4的功能。GUS染色显示AtLAC4在拟南芥的维管组织中有较强的表达,并在叶片排水器中特异表达。AtLAC4过量表达导致植株木质素含量增多、次生壁加厚、植株变小和莲座叶叶柄变短。ABA对AtLAC4的表达具有明显的诱导作用,AtLAC4过量表达植株对外源ABA敏感;干旱处理后,AtLAC4过量表达植株的耐旱能力比野生型明显增强。作为多酚氧化酶家族的漆酶还能够使酚类化合物聚合,参与对伤害的防御反应,使植物免受昆虫和病原体的侵袭。拟南芥中漆酶基因家族共有17个成员。McCaig等运用构建系统进化树等生物信息学方法将此17个基因归类至6个漆酶亚家族中。关于漆酶家族成员生物学功能的研究则报道较少。Zhou和Berthet等对拟南芥的研究发现,AtLAC4可能在木质素及植物次生壁合成过程中起重要作用。但是其在植物生长发育中的具体生物学功能尚不十分清楚,需要更多的实验数据来阐明。本文主要以过量表达AtLAC4植株和AtLAC4启动子与β-glucuronidase(GUS)报告基因融合表达植株为材料,研究在植物生长发育过程中和响应外界环境时该基因的功能,为AtLAC4基因及植物漆酶基因家族的功能研究提供证据。1.1植物材料与处理拟南芥种子先经70%乙醇表面消毒30秒,之后加入10%次氯酸钠消毒10分钟,无菌水冲洗4–5次后均匀播种于MS平板上。4°C保湿黑暗冷藏3天打破休眠,之后移至拟南芥培养室中培养。10天后移至土壤中生长,培养温度为(22±2)°C,光暗周期为16小时光照/8小时黑暗,光照强度为120–150μmol·m–2·s–1。取MS培养基上生长14天的野生型拟南芥,分别用无菌水、100μmol·L–1赤霉素、100μmol·L–1萘乙酸、100μmol·L–1脱落酸、1mmol·L–1水杨酸、30mmol·L–1蔗糖、15%聚乙二醇、5μmol·L–1CuSO4以及4°C处理3个小时,然后取样,用于提取RNA进行基因表达检测。以野生型为对照,观察各转基因植株及突变体在不同生长发育时期的生长状况,拍照并测定相关数据。种子萌发以胚根突破种皮为标准.叶柄长度统计时,分别取16株野生型35S:AtLAC4植株的第5–10片莲座叶进行测定。取生长20天左右的野生型和过量表达植物进行干旱胁迫处理,连续处理10天和20天后进行表型观察。所有表型分析实验均在相同条件下重复进行3次。利用引物5′AGTTCTAGAATGGGGTCTCATATGGTTTG-3′和5′-ATTGGATCCTTAGCACTTGGGAAGATC-3′将AtLAC4基因的CDS连接到T载体上;测序正确后,利用XbaI和BamHI将CDS连接到植物过量表达载体中。分别以pCAMB-IA1303和改造过的pCAMBIA1390质粒为对照,用连接成功的植物表达载体质粒转化农杆菌LBA4404,并用花粉管浸染法转化拟南芥,潮霉素筛选转基因植株并进行PCR检测,选取单位点插入的纯合转基因株系用于后续实验。1.4GUS组织化学染色在含有1mmol·L–1EDTA、0.1%TritonX-100、100μg·mL–1氯霉素、2mmol·L–1铁氰化钾和2mmol·L–1亚铁氰化钾的50mmol·L–1磷酸缓冲液(pH7.0)中,加入100mg·mL–1X-Gluc母液(N,N-二甲基甲酰胺溶解),使X-Gluc终浓度为1mg·mL–1。取幼苗或组织剪成小块置于1mL配制好的上述染色液中,37°C温育12小时,期间摇动数次,70%乙醇脱色至透明。2结果与分析

2.1AtLAC4的时空表达结果表明,AtLAC4基因启动子驱动GUS可以在萌发3天种子的子叶和胚根(图1A)、萌发5天幼苗的根维管束(图1B)、10天幼苗的子叶叶脉(图1C)、45天植株花器官中的萼片、雌蕊柱头、雄蕊花丝以及角果与果柄连接处(图1J,K)等明显表达,且AtLAC4在以上部位的表达模式与Berthet等(2011)的研究结果基本一致。此外,AtLAC4基因启动子驱动GUS在植物的茎尖(图1I)、根与花序轴的维管组织(图1E,G)、下胚轴与根的连接处以及根的维管组织中(图1F)也有非常强的表达,并在真叶(图1D)和莲座叶叶缘排水器(图1H)中有非常特异的表达。(A),(B)分别为3天和5天的幼苗;(C)10天幼苗的子叶;(D)10天幼苗真叶叶缘排水器;(E)花序轴维管组织;(F),(G)根维管组织;(H)莲座叶叶缘排水器;(I)茎尖;(J)幼嫩的角果;(K)花器官。2.2AtLAC4过量表达引起植株变小我们利用转基因方法共获得24个AtLAC4过量表达转基因株系,并选取其中潮霉素筛选过程中幼苗黄绿比符合1:3并且纯合的2个转基因株系进行后续的功能分析。首先,我们对筛选的纯合35S:AtLAC4转基因植株进行AtLAC4基因表达水平检测。RT-PCR结果(图2B)表明,转基因植株中AtLAC4基因表达水平明显升高。表型分析发现,与野生型拟南芥相比,AtLAC4过量表达会引起植株变小。(A)35天和40天的35S:AtLAC4转基因植株的表型,其中40天为去除花茎的植株(1)在由营养生长转化为生殖生长的过程中,特别是在抽薹后(30–40天),AtLAC4过量表达植株的花茎比野生型伸长得慢,莲座叶的直径明显小于野生型(图2A);(2)40天的植株去除花茎后,AtLAC4过量表达植株各莲座叶所形成的莲座大小明显小于野生型(图2A)。2.3AtLAC4过量表达植株木质素相对含量增多在AtLAC4过量表达植株变小的同时,我们还发现转基因植株的叶片硬度比野生型的要大。已有的研究表明,漆酶基因可能与木质素的合成有关。因此我们推测,AtLAC4过量表达植株叶片变硬可能与木质素的含量增加有关。木质素是一种复杂的酚类聚合物主要存在于植物木质组织中的次生壁上。在盐酸存在的情况下,木质素可与间苯三酚聚合形成一种紫红色化合物。染色愈深且染色细胞愈多说明木质素含量越高.取40天的野生型和35S:AtLAC4拟南芥的花序轴靠近基部一节的相同部位,进行徒手切片,然后以盐酸为介质分别对其进行间苯三酚染色。2.4非生物胁迫和激素对AtLAC4表达的影响首先,我们对AtLAC4基因的启动子区域进行了生物信息学分析,发现其启动子区域含有大量与植物激素以及非生物胁迫相关的顺式作用元件。我们推测AtLAC4可能与激素及其它非生物胁迫相关,并进一步考察了相关激素及非生物胁迫对AtLAC4表达的影响。选取在MS培养基上生长14天的拟南芥幼苗,经GA3、NAA、ABA、SA、蔗糖(Suc)、聚乙二醇(PEG)和CuSO4等各种激素和非生物胁迫因素处理3小时,利用RT-PCR检测AtLAC4基因的表达情况。结果表明,与对照相比,ABA和SA能够促进AtLAC4的表达,而蔗糖、低温和Cu2+则抑制其表达(图4)。其中ABA对AtLAC4基因表达的诱导作用最为明显,ABA处理组AtLAC4的表达量与对照相比增加了3倍多(图4B),表明AtLAC4基因可能在响应ABA信号过程中起作用。图4外界因素与激素对AtLAC4表达的影响(A)RT-PCR电泳检测(4°C(无菌水),CuSO4(5μmol·L–1));(B)RT-PCR结果的量化,比值=目的带吸光度峰值/Actin吸光度峰值。CK:对照(无菌水);GA:赤霉(100μmol·L–1);NAA:萘乙酸(100μmol·L–1);ABA:脱落酸(100μmol·L–1);SA:水杨酸(1mmol·L–1);Suc:蔗糖(30mmol·L–1);PEG:15%聚乙二醇在含有ABA的培养基上萌发4天后,野生型种子的萌发率可达40%,而AtLAC4过量表达植株种子的萌发率仅为8%(图5B)。到萌发12天时,虽然二者的萌发率已基本相近,但是AtLAC4过量表达植株的胚根生长明显受到抑制(图5A)。以上结果表明,AtLAC4过量表达植株对外源ABA的敏感性增加,进一步说明At-LAC4基因可能在植物响应ABA过程中起一定作用。2.6AtLAC4过量表达植株耐旱能力增强一般来说,对ABA敏感的植物往往耐旱能力较强。为了进一步研究AtLAC4过量表达植株对ABA敏感性的增加是否通过ABA信号途径增强了植物的耐旱能力,我们分析了AtLAC4过量表达植株在干旱条件下与野生型植株的差异.结果发现,生长20天的植株经过干旱处理10天后,AtLAC4过量表达植株的表型与野生型相比差别更加明显,过量表达植株的莲座叶明显变小,叶柄变短(图6A,B),可能是因为干旱胁迫诱导ABA合成后,ABA进一步上调了AtLAC4基因的表达量,从而引起木质素的含量增加,导致过量表达植株的表型更加明显。当干旱胁迫处理第20天时,相同生长时期的野生型拟南芥基本上已经全部萎蔫,而AtLAC4过量表达植株仍然能够正常生长(图6C),表明AtLAC4过量表达植株的耐旱能力比野生型明显增强。3讨论

3.1AtLAC4参与植物木质素的合成植物的维管组织起源于原形成层细胞,这些细胞来源于植物的顶端分生组织。木质素是维管组织细胞次生壁的重要组分,主要存在于次生细胞壁中,影响维管的厚度和硬度。木质素含量越高,细胞的次生壁也越厚,其含量的高低对植物维管系统的发育起重要决定作用。AtLAC4基因在茎、叶柄、根以及胚轴维管组织中的表达非常明显,并且在茎尖顶端分生组织处有非常强烈的表达,这些表达部位与维管组织的起始和发育部位十分一致,表明AtLAC4可能在维管系统的发育过程中起重要作用。在我们的研究中,采用间苯三酚对花序轴横切面进行染色,发现At-LAC4过量表达植株的木质化细胞与野生型相比明显增多,木质素含量明显升高且次生壁明显加厚.以上研究结果表明,AtLAC4在调控木质素的合成过程中确实起着重要作用3.2AtLAC4与外源激素及非生物胁迫的关系对漆酶家族启动子顺式作用元件的生物信息学分析表明,AtLAC4的启动子中ABA应答元件的数目最多。我们通过RT-PCR检测发现,ABA能使AtLAC4表达明显增强(图4)。因此,我们研究了ABA对AtLAC4转基因植株种子萌发的影响,结果表明,AtLAC4过量表达植株种子的萌发受到明显抑制且对ABA的敏感性增强(图5)。其原因可能是在35S:AtLAC4转基因植株中,AtLAC4的过量表达增强了ABA对种子休眠的作用。根据AtLAC4启动子驱动GUS时空表达的结果来看,其在叶缘排水器及根部维管组织中有较强的表达,说明AtLAC4可能与植物的抗旱性有关。我们进一步对野生型及AtLAC4过量表达植株进行干旱处理,结果表明AtLAC4过量表达植株的耐干旱能力明显增强(图6)。我们还发现干旱处理后AtLAC4过量表达植株与野生型的差异更加明显(图6),表明干旱可能促进ABA的合成,进而促进AtLAC4的表达。过量表达植株中AtLAC4表达显著增强,从而导致植株更加矮小。AtLAC4过量表达植株的木质素含量升高可能导致维管组织发育模式的改变,从而影响了植物对水分以及植物激素(如ABA)的运输能力,导致过量表达植株对A