高级生物化学-氨基酸1课件

第2章氨基酸(aminoacids)蛋白质(Protein，pr)：是一切生物体中普遍存在的，由天然氨基酸按照一定的顺序，通过肽键连接而成的一条或多条肽链构成的生物大分子；其种类繁多，各具有一定的相对分子质量，复杂的分子结构和特定的生物功能；是表达生物遗传性状的一类主要物质。一、蛋白质的化学组成和分类一般蛋白质含氮量平均为16%,即1份氮素相当于6.25份蛋白质,此即蛋白质系数。蛋白质的分类二、蛋白质的水解碱水解会降低蛋白质的营养价值酶解法（内切酶）酶解法（内切酶）酶解法:胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶等。1、不同氨基酸的R基不同，R基决定了氨基酸的性质2、兼性离子→晶体溶点高→离子晶格，不是分子晶格。3、溶解性：一般都溶于水，不溶或微溶于醇4、介电常数高→水溶液中的氨基酸是极性分子。三、氨基酸的结构通式

基本氨基酸的分类-方式1按R基结构分类AliphaticAminoAcidsAromaticAminoAcids一氨基一羧基的氨基酸

Gly,Ala,Val,Leu,Ile,Ser.Thr,Cys,Met一氨基二羧基的氨基酸（酸性氨基酸）及酰胺:Asp,Glu.Asn,Gln二氨基一羧基的氨基酸（碱性氨基酸）:Arg,Lys(1)脂肪族氨基酸(2)芳香族氨基酸:Phe,Tyr,Trp(3)杂环族氨基酸：His,Pro（2）.侧链含有羟基的氨基酸（2种）丝氨酸苏氨酸Ser的-CH2OH基（pKa=15）在生理条件下不解离，但在大多数酶的活性中心都发现有Ser残基存在。

Ser和Thr的-OH往往与糖链相连，形成糖蛋白。两个半胱氨酸氧化可以形成胱氨酸（4）侧链含有羧基或酰胺基的氨基酸（4种）

天冬氨酸侧链为-羧基谷氨酸侧链为-羧基天冬酰胺谷氨酰胺Asp和Glu它们是唯一在生理条件下带有负电荷的的两个

氨基酸（5）.侧链含有碱性基团的氨基酸（3种）组氨酸赖氨酸精氨酸侧链有咪唑环侧链有-氨基侧链有胍基它们是唯一在生理条件下带有正电荷的的三个

氨基酸碱性氨基酸

Lys侧链氨基的pKa为10.53，生理条件下，Lys侧链带有一个正电荷（—NH3+），侧链的氨基反应活性增大。胶原蛋白中的Lys侧链氧化时能形成很强的分子间(内)交联。

Arg是碱性最强的氨基酸，侧链上的胍基是已知碱性最强的有机碱，pKa值为12.48，生理条件下完全质子化。与NaOH相当

His是pKa值最接近生理pH值的一种（游离氨基酸中为6.00，在多肽链中为7.35），是在生理pH条件下唯一具有缓冲能力的氨基酸。His在酶的酸碱催化机制中起重要作用。它往往存在于许多酶的活性中心。

BasicAminoAcids组蛋白中较多乙酰-CoA羧化酶的组成上面的生物素辅基象一个摆臂丙酮酸脱氢酶复合体

R为芳香族基团的氨基酸三种芳香族氨基酸在紫外光区都吸收紫外光，在中性pH条件下，色氨酸和酪氨酸的紫外吸收峰在280nm，而苯丙氨酸的在260nm，大多数蛋白质中都含有色氨酸和酪氨酸或其中的一种，所以溶液中280nm吸收的测量常用来估算蛋白质的浓度。(7)杂环氨基酸：脯氨酸一种亚氨酸，具有固定的构型ProPro的α-亚氨基是环的一部分，因此具有特殊的刚性结构。一般出现在两段α-螺旋之间的转角处，Pro残基所在的位置必然发生骨架方向的变化，按侧链R基极性分类基本氨基酸的分类-方式2（1）不带电荷的极性R基的aa：丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺（2）带正电荷的极性R基aa（碱性aa）：赖氨酸，精氨酸，组氨酸（3）带负电荷的极性R基aa（酸性aa）：天冬氨酸，谷氨酸1.非极性R基氨基酸，侧链无极性甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，色氨酸、脯氨酸，2.极性R基氨基酸NonpolarAminoAcidsAnaminoacidisnonpolarwhentheRgroupisH,

alkyl(烷基),oraromatic(芳香族).AcidicandBasicAminoAcidsPositivelychargedatphysiologicalpHNegativelychargedatphysiologicalpHAnaminoacidisacidicwhentheRgroupisacarboxylic(羧基的)acid.basicwhentheRgroupisanamine.PolarChargedSideChains氨基酸的极性分类R-Groups氨基酸的亲疏水性指数氨基酸的疏水性和蛋白质三维结构

思考：假设该序列只是大的球蛋白的一部分，下面氨基酸残基中哪些可能分布在蛋白的外表面，哪些分布在内部？

天冬氨酸；异亮氨酸；苏氨酸；缬氨酸；谷氨酰胺；赖氨酸

分析：分布在外表面的为极性和带电荷的残基：Asp、Gln和Lys；分布在内部的是非极性的氨基酸残基：Try、Leu和Val；Thr尽管有极性，但疏水性也很强，因此，它出现在外表面和内部的可能性都有。氨基酸的疏水性和蛋白质三维结构思考：有一个蛋白质分子在pH7的水溶液中可以折叠成球状，通常是带极性侧链的氨基酸位于分子外部，带非极性侧链的氨基酸位于分子内部。请回答：

（1）在Val、Pro、Phe、Asp、Lys、Ile和His中，哪些位于分子内部，哪些位于分子外部？

（2）为什么在球蛋白内部和外部都能发现Gly和Ala？

（3）Ser、Thr、Asn和Gln都是极性氨基酸，为什么会在分子内部发现？

（4）在球蛋白的分子内部和外部都能找到Gys，为什么？氨基酸的疏水性和蛋白质三维结构分析：（1）Val、Pro、Phe、Ile是带有非极性测链的氨基酸，这些氨基酸残基位于分子内部；Asp、Lys、His是带有极性侧键的氨基酸，这些氨基酸残基位于分子的外部。

（2）因为Ala和Gly两者的侧链都比较小，疏水性和极性都小；Gly只有一个H＋与α–碳原子相连，Ala只有—CH3与α–碳原子相连，故它们既可以出现在分子内部，也可以出现在分子外部。

（3）Ser、Thr、Asn、Gln在

pH7.0时含有不带电荷的极性侧链，参与分子内部的氢键形成，从而减少了它们的极性，故会在分子内部发现。

（4）因为Cys属于不带电荷的极性氨基酸，可位于分子外部，但又由于Cys常常参与链内和链间的二硫键形成，使其极性减弱（少），Foldingproceedsviaintermediatesteps,formingmoltenglobule–whichisrefinedtominimumenergy(native)stateFreeenergydifferencebetweenfoldedandunfoldedstructureis~42kJ/mole(aboutthesameas1.5ATP)Becausefoldingiscooperative,onceaproteinbeginstofoldorunfold,theentireprocessiscompletedquickly.维持蛋白质三维结构或DNA双螺旋最稳定的因素是（？）疏水作用与蛋白质折叠基本氨基酸的分类-方式3Essential/Non-EssentialAminoAcids按氨基酸是否能在人体内合成分：（1）必需氨基酸：指人体内不能合成的氨基酸，必须从食物中摄取，有八种：Lys,赖氨酸、Trp,色氨酸、Met甲硫氨酸、Met苯丙氨酸、Val缬氨酸、Leu亮氨酸、Ile异亮氨酸、Thr苏氨酸。（2）非必需氨基酸：指人体内可以合成的氨基酸。有十种。（3）半必需氨基酸：指人体内可以合成但合成量不能满足人体需要（特别是婴幼儿时期）的氨基酸，有两种：组氨酸(His)、精氨酸(Arg)。OtheraminoacidderivativeI21st&22ndAAs含硒半胱氨酸只存在于含硒蛋白之中，而吡咯赖氨酸仅存在于一些真细菌和古细菌体内，作为与产甲烷代谢有关的某些酶的组分。2、不常见蛋白质氨基酸也称修饰氨基酸，是在蛋白质合成后，由基本氨基酸修饰而来①胱氨酸（Cystine)广泛地存在于蛋白质中。它由两个半胱氨酸的巯基氧化之后形成的，形成二硫键。不常见蛋白质氨基酸及非蛋白质氨基酸：存在于生物体内，但不组成蛋白质的呈游离或结合态的氨基酸，约150种，具有多种生理功能。（1）L-α-氨基酸的衍生物L-瓜氨酸和L-鸟氨酸是合成精氨酸的中间产物。（2）D-α-氨基酸D-Ala存在于肽聚糖中，D-Phe是短杆菌肽S的组分（3）β、γ、δ-氨基酸β-Ala是泛酸的前体，γ-氨基丁酸是传递神经冲动的化学介质。

3、非蛋白质氨基酸真核生物中的D型氨基酸

1990年以后陆续发现哺乳动物体内大量存在D-Ser,D-Asn。D-Ser在大脑前叶中与谷氨酸受体(NMDA受体)的分布一致，能激活NMDA受体，与学习记忆有关。而D-Asn则在大鼠的所有组织中都有分布，可能与成熟有关。五、氨基酸的酸碱性质（一）、氨基酸的解离

兼性(两性)离子：指在同一分子上带有能释放质子的正离子基团和能接受质子的负离子基团。兼性离子本身既是酸又是碱。因此它既可以和酸反应，也可以和碱反应。①晶体溶点高→离子晶格，不是分子晶格。②不溶于非极性溶剂→极性分子。③介电常数高→水溶液中的氨基酸是极性分子氨基酸的解离零电荷氨基后解离羧基先解离酸性环境

中性环境

碱性环境完全质子化的氨基酸甘氨酸的解离曲线正电荷越？负电荷越？pKa值pKa值pKa值甘氨酸的解离曲线pKa值pKa值正电荷越？负电荷越？甘氨酸的解离曲线得出信息

在pH2.34和pH9.60处，Gly具有缓冲能力。

起点：100%Gly+

净电荷：+1第一拐点：50%Gly+

，50%Gly±平均净电荷：+0.5

pH=pK+lg[Gly±]/[Gly+]=pK1=2.34第二拐点：100%Gly±

净电荷：0等电点pI第三拐点：50%Gly±，50%Gly-

平均净电荷：-0.5

pH=pK2+lg[Gly-]/[Gly±]=pK2=9.6终点：100%Gly-净电荷：-1pKa值pKa值氨基酸的解离--pKa值(1)、α-COOH(羧基)

pK值在2.0左右，当pH>3.5，

α-COOH以α-COO-形式存在。

(2)α-ΝΗ2（氨基）pK值在9.4左右，当pH<8.0时，

α-ΝΗ2以α-ΝΗ3+

形式存在。pKa值就是指某种解离基团有一半解离时的pH值,pK值的大小可以表示解离基团酸性的强弱,pK值小则酸性强。在pKa时缓冲能力最强氨基酸解离的PKaHis是唯一具有近中性pKa基团(imidazole)的氨基酸氨基酸氨基和羧基的解离和PKa值当溶液的pH值在3.5-8.0范围内时，氨基酸是两性离子（偶极离子）存在,为什么?熔点：氨基酸的熔点一般都比较高，一般都大于200℃，超过熔点以上氨基酸分解产生胺和二氧化碳。Henderson-Hasselbalch方程式氨基酸和相应脂肪酸（胺）解离比较氨基酸pKa比脂肪酸的-COOH的pKa（一般为4—5）,小氨基酸pKa脂肪胺中的--NH3+的pKa（一般为10—11）.小自由氨基酸的pK要比肽中C端的羧基的pK小.自由氨基酸的pK要比肽中N端的氨基的pK大，-e++

氨基酸解离程度取决于所处溶液的酸碱度。1、氨基酸的等电点(isoelectricpoint,pI)：指氨基酸的正离子浓度和负离子浓度相等时的溶液的pH值称为该氨基酸的等电点,用符号pI表示

(或使氨基酸净电荷为零时溶液的pH值)。氨基酸的等电点和计算K1=[Gly±][H+][Gly+]K2=[Gly-][H+][Gly±]pI时，[Gly+]=[Gly-][Gly±][H+]K1=[Gly±]K2[H+][H+]2=K1K2pH=（pK1+pK2）/2pI=（pK1+pK2）/2pI=（2.34+9.60）/2=5.97Gly等电点的计算：中性氨基酸：以Gly为例由此可知:

等电点相当于该aa两性离子状态两侧

基团pK值之和的一半。即：等电点pH值与离子浓度无关，只取决于兼性离子两侧基团的pK值。氨基酸的等电点酸性氨基酸，以Asp为例：pK1-COOH=2.2pK2–NH3+=9.0pK3-Rgroup=10.5pI=(pK2+pK3)/2pI=(9+10.5)/2pI=9.75碱性氨基酸，以Lys为例：酸性氨基酸，以Glu为例：谷氨基的两性离子两边的pK值的平均值：pI=(2.19+4.25)/2=3.22总结1.酸性氨基酸的等电点在3左右2.中性氨基酸的等电点在6.5左右3.碱性氨基酸的等电点在10左右1.在PH值=3时上述三种氨基酸各带什么电荷？当PH值分别等于6或7呢？2.PH小于（或大于）等电点，等电点越大可能带的正电荷越―？等电点越小带的正电荷越―？3.等电点不同，在同一PH值时所带电荷不同氨基酸等电点计算问题1：把一个氨基酸结晶加入pH7.0的纯水中，得到pH6.0的溶液，此氨基酸的pI值是大于6.0？小于6.0?还是等于6.0？（小于6.0）

问题2：

血液pH=7.35—7.45,哪一种氨基酸在血液保持pH稳定方面起重要的缓冲作用？为什么？pH6.0氨基酸等电点思考晶体PH=7PH小于7加酸H+H+PH大于7H+加碱问题1：把一个氨基酸结晶加入pH7.0的纯水中，得到pH6.0的溶液，此氨基酸的pI值是大于6.0？小于6.0?还是等于6.0？（小于6.0）H+H+PHPHLyslysCOOHNH２LyslysCOO－LyslysCOO－LyslysNH２COO－+3+2+10氨基酸等电点思考Lys--lys--lysCOOHLys--lys--lysCOO－Lys--lys--lysNH２Lys--lys--lysNH２COO－COO－思考题保留三分之一+

2、氨基酸在等电点的特点：（b）等电点时缓冲能力最小（c）蛋白质等电点时溶解度最小。蛋白质等电点沉淀

思考：蛋白质的等电点和等离子点（a）甲醛滴定法在一般情况下，α−NH3

+在pH12-13时才能出现解离，一般的指示剂则难以指示。加入过量甲醛，滴定过程中降低了氨基的碱性。使滴定曲线向低pH=9转移。甲醛滴定法应用：氨基酸定量分析—甲醛滴定法（间接滴定）

A.与甲醛反应，滴定终点在9左右，可用酚酞作指示剂。

B.

释放一个氢离子，相当于一个氨基（摩尔比1：1）

试题：将400ml的丙氨酸溶液调到pH8.0，然后向该溶液中加入过量的甲醛，所得的溶液用NaOH反滴定到pH8.0，消耗0.2mol/L的NaOH溶液250ml。问，在起始的溶液中丙氨酸为多少克？（丙氨酸的分子量按89计）（６分）

2003年厦门大学

蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。在蛋白质分子中，游离的α-NH2和α—COOH相距较远，静电引力减弱，故：

a末端的α—NH2的pK′值减少

b末端的α—COOH的pK′值增大蛋白质的两性电离蛋白质的等电点(isoelectricpoint,pI)

当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。在等电点时蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。蛋白质的等电点(isoelectricpoint,pI)

pH=pI时，蛋白质净电荷为零，蛋白质分子在电场中不移动pH＞pI时，蛋白质净电荷为负，蛋白质分子在电场中向阳极移动pH＜pI

时，蛋白质净电荷为正，蛋白质分子在电场中向阴极移动在pI时，蛋白质失去了胶体的稳定条件，即没有相同电荷相互排斥的作用。所以不稳定，溶解度最小，易沉淀。蛋白质的等电点在有中性盐存在下可以发生明显的变化，原因是蛋白质分子中某些解离基团与中性盐中的离子相结合。蛋白质的等电点在一定程度上决定于介质中离子的组成。

等离子点（isoionicpoint）：没有其它盐类干扰时，蛋白质质子供体基团解离出来的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的pH称为等离子点(蛋白质的等离子点：指在纯水中（即没有其它盐类存在）蛋白质的正离子数等于负离子数的pH值。)蛋白质的等离子点（特征常数）

核酸的酸碱性质

核酸的磷酸基具有酸性，碱基具有碱性，因此，核酸具有两性电离的性质。但核酸中磷酸基的酸性大于碱基的碱性，其等电点偏酸性。

DNA的pI约为4～5，

RNA的pI约为2.0～2.5，在pH7～8电泳时泳向正极。电泳点样在负极胞嘧啶核苷酸的解离123六、氨基酸的化学性质1).α-NH2参与的反应

(1).茚三酮的颜色反应(2).成肽反应2).α-COOH参与的反应

(1).与亚硝酸反应(2).与甲醛反应(3).酰化反应

(4).烷化反应(5).希夫反应3).由α-氨基与羧基共同参与的反应

(1).成盐反应(2).成酯反应(3).酰卤化反应

(4).脱羧反应(5).叠氮反应4).氨基酸的侧链基团的反应（一）

α-羧基参与的反应成盐、成酯后羧基的化学反应性能被保护，而氨基的化学反应性能得到加强或说氨基被活化，易与酰基或烃基结合。为什么氨基酸的酰基化和烃基化在碱性溶液中进行？1、成酯和成盐反应：

Hcl

α-羧基参与的反应用途：这是使氨基酸羧基活化2、形成酰卤的反应3、成酰胺反应氨基酸的氨基与酰氯或酸酐在弱碱溶液中发生作用时，氨基即被酰基化。例如与苄氧（苯甲氧）甲酰氯反应。1、与酰化试剂反应（二）．a-氨基参与的反应酰化试剂作用用途：是鉴定多肽N-端aa和aa顺序的重要方法。2.烃基化反应-Edman试剂反应3、形成西佛碱（Schiff）反应氨基酸的α-氨基能与醛类反应生成弱碱，这个弱碱叫西佛碱（Schiff’sbase).西佛碱是某些酶促反应的中间产物（如转氨基反应的中间产物）。

思考：有两种重要的具维生素组分的辅酶。它们在酶促反应中都具稳定碳阴离子中间物的作用。请讲出这两种辅酶和对应的维生素的名称，及它们参与催化的主要反应（TPP和PLP）

Effectiveelectronsinks.Pyridoxalphosphate(PLP)stabilizescarbanionic碳负离子

intermediatesbyservingasanelectronsink.Whichotherprostheticgroupcatalyzesreactionsinthisway?（Thiaminepyrophosphate.TPP）electronsinks上海交通大学电子穴（电子陷阱）电子穴（电子陷阱）PLP做电子受体脱氨基脱羧基碳负离子醌型electronsinks（三）．α-氨基和羧基共同参与的反应茚三酮反应

所有氨基酸及具有游离α-氨基的肽与茚三酮反应都产生蓝紫色物质，只有脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生黄色物质。应用：氨基酸定性和定量分析

茚三酮反应应用：氨基酸定性和定量分析（光吸收法和测压法）

注意：所有α—氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。β-丙氨酸、氨和许多一级胺都呈阳性反应虽然蛋白质和氨基酸均有茚三酮反应，但能与茚三酮呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸茚三酮反应的修改李绍军,郭蔼光,梁宗锁,生化教材中关于脯氨酸与茚三酮反应描述的修改建议，生命的化学，2005(6):509-510⑴脯氨酸是亚氨基酸，没有具α-氨基的氨基酸酸性茚三酮反应。⑵脯氨酸可以与茚三酮反应，在酸性条件下生成的直接产物是红色的，最大吸收峰值是520nm。⑶脯氨酸与酸性茚三酮在有氰化物存在时反应产物是黄色或橙黄色，最大吸收值是440nm；⑷脯氨酸与茚三酮在碱性条件下生成不稳定的黄色产物。2、成肽反应体内的成肽反应如何？(四)氨基酸的侧链基团的反应氨基酸的侧链基团的反应氨基酸的侧链基团的反应(续)氨基酸的侧链基团的反应pauly反应His+重氮苯磺酸红色（棕红色）Tyr+重氮苯磺酸橘黄色

Folin一酚反应+磷钼酸Tyr磷钨酸orTrp蓝色（钼蓝与钨蓝混合物）氨基酸的侧链基团的反应断开二硫键氧化法还原法烷基化试剂保护巯基乙醇二硫苏糖醇过甲酸五、氨基酸的光学性质和光谱性质（一）、氨基酸的旋光性和立体化学氨基酸的构型也是与甘油醛构型比较而确定的氨基酸的旋光性和立体化学1、除R=H的甘氨酸外，其他19种基本氨基酸a－碳原子均有不对称碳原子，有D-型和L－型两种异构体，因而是光学活性物质，构成蛋白质的氨基酸除Gly外均为L-型异构体。2.Thr和Ile有四种光学异构体。3、氨基酸的旋光性（符号和大小）取决于它的R基的性质，并与溶液的PH值有关。比旋光度是氨基酸的重要物理常数之一，是鉴别各种氨基酸的重要依据。

氨基酸的旋光性氨基酸的旋光性（符号和大小）取决于它的R基的性质，并与溶液的PH值有关。比旋光度是氨基酸的重要物理常数之一，是鉴别各种氨基酸的重要依据。外消旋物：D-型和L-型的等摩尔混合物。内消旋物：分子内消旋物质的构型1.手性碳的D型和L型：如单糖、氨基酸和磷脂2.

双键的顺式与反式：肽键和脂肪酸中的双键3.单糖醛基环化后的α和β型，后者又联系嘧啶或嘌呤碱糖苷键的β型多是顺式糖的旋光性和构型α和β嘧啶或嘌呤碱糖苷键的β型糖的D型和L型旋光性和构型1.肽链中的肽键一般是反式构型，2.天然存在的已醛糖都是D型的3.天然氨基酸为多L型4.戊糖与嘧啶或嘌呤碱以C-N糖苷键连接就称为核苷，β型糖苷键,碱基与糖环平面互相垂直，反式存在。Originofaminoacidhomochirality

TamuraK.Molecularhandednessoflife:significanceofRNAaminoacylation.JBiosci.2009,34(6):991-4.（二）氨基酸光谱性质氨基酸紫外吸收性质蛋白质中的荧光主要来自：酪氨酸和色氨酸

氨基酸的一个重要光学性质是对光有吸收作用，20种蛋白质氨基酸在可见光区域均无光吸收,在远紫外区(220nm)均有光吸收,在紫外区(近紫外区)(220nm—300nm)只有三种氨基酸有光吸收能力六、氨基酸的分离分析(一).

层析法(chromatography)

–分配柱层析–纸层析–薄层层析–离子交换层析法(二).

电泳法(Electophy)(三).

气相色谱法(四).

高效液相层析(一).层析法(chromatography)层析法分类1、原理：组成层析系统的固定相和流动相具有相反的极性。被分析的样品（如aa混合物）中的各组分依据其自身极性的强弱，与此两相的亲和力不同。与固定相亲和力大者，易留滞于原地，与流动相亲和力大者，易随流动相移动，因而达到分离的目的。（一）.分配层析分配定律：当一种溶质在两种一定的互不相溶的溶剂中分配时，在一定的温度下达到平衡后，溶质在两相中的浓度比值为一常数。即分配系数（kd）。分离的先决条件：各种AA成分的分配系数有差异，差异越大，越容易分开。分配层析分配层析的原理：逆流分配固定相流动相48362720.5

分离的先决条件：各种AA成分的分配系数有差异，差异越大，越容易分开。固定相流动相646464646464166464646448分配系数：3:1分配层析的原理：逆流分配固定相流动相166464646448166464646448644646464123612分配层析的原理：逆流分配固定相流动相4126464641241264646412641646496183363627分配层析的原理：逆流分配分配层析的原理：逆流分配固定相流动相1696464316964643640.25646.756.752.256.750.75181820.25272720.25分配层析的原理：逆流分配固定相流动相0.252.256.756.75640.750.252.256.756.75640.75640.065.16.83.40.752.250.196.756.7510.120.2520.2520.220.2520.2515.2分配层析的原理：逆流分配固定相流动相646464646464326464646432分配系数：1:1分配层析的原理：逆流分配固定相流动相326464646432161664646416分配系数：1:13216分配层析的原理：逆流分配固定相流动相412124644412124644642281288212121212128442分配层析的原理：逆流分配固定相流动相64/64646464646432/166464646432/48A物质B物质分配层析的原理：逆流分配固定相流动相64/64121246444121246446422812882121212/10.112128

/20.2442分配层析的原理：逆流分配若是逆流分溶或逆流分配，当转移n次后，某一物质在（n+1）个管中分布的分数含量是（p+q)n=1展开式的相应项的值。这里p和q分别为某一物质在静相和动相中的分数含量，即p+q=1。例如物质Y的Kd=q(动相)/(静相)p=1即:p+q=1/2+1/2=1转移n次后,在第k号管中某一物质的含量可由下式计算:

n！·pn-k+1·qk-1Tn,k=———————————（n-k+1）！·（k-1）！2分配柱层析3、纸层析原理：纸层析法属于分配层析。纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。纤维素吸附的水为固定相，有机溶剂为流动相。当有机溶剂沿滤纸流动时，层析点中的物质就会在有机相和水相中进行分配，其中部分溶质随有机相的不断流动进入水相，或从水相进入有机相，如此进行反复的分配，由于不同物质的分配系数不同、移动速度不同因而得以分离。相对迁移率Rf

Rf主要与R基的极性有关，溶剂的pH可影响R基的极性，氨基酸与滤纸的吸附作用也影响Rf。在流动相中分配系数越大，移动越快。预测在以苯酚-甲酚-水为展层剂利用纸层析分离下列氨基酸时Rf值大小顺序：

（1）Ala、Leu、Ser（2）Val、Gly、GluR基的疏水性双向纸层析图4、薄层层析4．离子交换层析

原理：分离氨基酸时，用离子交换树脂作为支持物，利用离子交换树脂上的活性基团与溶液中的离子进行交换反应，由于各种离子交换能力不同，与树脂结合的牢固程度就不同，在洗脱过程中，各种离子以不同的速度移动，从而达到分离的目的。离子交换层析，利用氨基酸的两性游离性质，在某一特定PH时，各氨基酸的电荷量及性质不同，故可以通过离子交换层析得以分离。

氨基酸与树脂的亲和力:取决于它们之间的（1）静电吸引和（2）氨基酸侧链与树脂基质之间的疏水相互作用.洗脱顺序主要与各种离子所带电荷有关，在电荷相同时，与极性、非极性有关。

离子交换层析

阳离子交换树脂-负电荷+++阴离子交换树脂-正电荷---氨基酸离子交换层析阳离子交换树脂-负电荷+++阴离子交换树脂-正电荷---氨基酸+氨基酸PH=3PH=7PH=10氨基酸-PH？离子交换层析阳离子交换树脂-负电荷阴离子交换树脂-正电荷---1.氨基酸+1.PH=32.PH=73.PH=102.氨基酸+3.氨基酸+离子交换层析阳离子交换树脂-负电荷阴离子交换树脂-正电荷---1.氨基酸+1.PH=32.PH=73.PH=102.氨基酸+3.氨基酸+氨基酸（-）PH？离子交换树脂离子交换树脂可以分为阳离子交换树脂（如羧甲基纤维素等）和阴离子交换树脂（如二乙基氨基乙基纤维素等）。

(1)阳离子交换树脂:供交换的是阳离子,树脂带负电荷

(2)阴离子交换树脂:可供交换的是阴离子，树脂带正电荷阴离子交换树脂洗脱顺序+洗脱方法：（1）改变PH值（改变离子电荷）或（2）增加离子浓度（竞争作用）.阴离子树脂：降低PH，则阳离子树脂升高PH

阴离子树脂（+）洗脱顺序：容易带正电荷早洗脱（碱性氨基酸），其次中性aa，最后酸性aa氨基酸的洗脱氨基酸与树脂上解离基团之间的静电引力氨基酸与树脂基质聚苯乙烯之间的疏水作用习题举例（1）在PI=6时，用阳离子交换柱层析分离Lys、His和Leu的氨基酸的洗脱顺序（2）在PI=8时，用阴离子交换柱层析分离Glu、Arg和Val的氨基酸的洗脱顺序阳离子交换树脂洗脱顺序（aa带正电荷）酸性aa中性aa碱性aa阴离子交换树脂洗脱顺序（aa带负电荷）先后先后碱性aa中性aa酸性aa（中国科技大学2002）习题举例

有一种蛋白质水解物,在pH6时,用阳离子交换柱层析分离,第一个被洗脱的氨基酸是()

A.Val(pI5.96)B.Lys(pI9.74)C.Asp(pI2.77)D.Arg(pI10.76)E.Tyr(pI5.66)用强酸型阳离子交换树脂分离下述每对氨基酸，当用pH7.0的缓冲液洗脱时，下述每对中先从柱上洗脱下来的是哪种氨基酸?

①天冬氨酸和赖氨酸；②精氨酸和甲硫氨酸；⑧谷氨酸和缬氨酸;④甘氨酸和亮氨酸；⑤丝氨酸和丙氨酸。习题举例解答：用离子交换树脂分离核苷酸主要是根据它们与树脂上相反电荷的静电结合力的

不同以及核苷酸疏水的碱基环与树脂骨架之间非极性吸附力的差异。本来，用阳离子交换树脂分离这四种核苷酸时，按照它们解离的差异，应该是AMP在CMP之前被洗脱下来。但是，由于嘌岭环比嘧啶环同交换树脂的非极性吸附力大三倍，抵消了它们之间的电荷差异，故出现上面的冼脱顺序。思考：用阳离子交换树脂分离核苷酸时，核苷酸被洗脱的先后顺序是UMP→GMP→CMP→AMP而不是UMP→GMP→AMP→CMP。为什么?

氨基酸的疏水性质的应用pH3.5时各核苷酸所带电荷

阴离子交换树脂柱洗脱顺序（+）-1-0.95-0.46-0.16UMPGMPAMPCMP实际洗脱顺序CMP>AMP>UMP>GMP电荷之间作用力相似，嘌呤疏水引力大（难洗脱）UMPGMPAMPCMP电荷小大大小阴离子交换树脂疏水作用（三）、电泳电泳（electrophoresis）：带电粒子在电场的作用下，向它所带的电荷相反方向泳动的现象称为电泳。氨基酸在pH高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。电泳SeparationofAminoAcidsWithanelectriccurrent,amixtureoflysine,aspartate,andvalineareseparated.

pH<pI,样品带正电荷，样品点向阴极移动

pH>pI,样品带负电荷，样品点向阳极移动

pH=pI,样品不带电荷，样品点不移动电泳SeparationofAminoAcids分离氨基酸混合物常用纸电泳。

有一种蛋白质水解物,在pH=6时,用电泳分离,怎样控制PH值使氨基酸有效分离？点样应该点在什么位置？（1）A.Lys(pI9.74)B.Asp(pI2.77)C.Tyr(pI5.66)（2）A.Val(pI5.96)B.Arg(pI10.76)C.Lys(pI9.74)氨基酸电泳分离时电荷一样为什么移动距离不同？思考题1、有一个某种溶液中含有三种三肽：Tyr-Arg-Ser,

Glu-Met-Phe和Asp-Pro-Lys,α-COOH基团的

pKa为3.8;α-NH3基团的pKa为8.5。在哪种pH（2.0,

6.0或13.0）下，通过电泳分离这三种多肽的效果最好？

答：pH=6.02、有一混合蛋白质溶液，各种蛋白质的pl为4.6；5.0；5.3；6.7；7.3。电泳时欲使其中4种泳向正极，缓冲液的pH应该是：（D）

A．5.0B.4.0C.6.0D.7.0E.8.0

基本氨基酸其他分类方式1、必需氨基酸：借一两本淡色书来2、参与尿素合成的氨基酸：精氨酸、天冬氨酸基本氨基酸其他分类方式4、产生一碳单位：

甘氨酸、丝氨酸、组氨酸、色氨酸，蛋氨酸3.转变成糖或脂肪

生糖氨基酸生酮氨基酸：亮氨酸、赖氨酸生糖兼生酮氨基酸：

苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、异亮氨酸5、糖代谢产物直接转氨基产生的氨基酸：丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸（也可还原产生）基本氨基酸其他分类方式6、血液中转运氨的氨基酸:谷氨酰胺和丙氨酸7、不能直接转氨基的氨基酸：Gly、Lys、Thr、Pro8、蛋白质中的荧光主要来自：酪氨酸和色氨酸9、参与核苷酸合成的氨基酸基本氨基酸其他分类方式10、蛋白质中参与结合金属离子的氨基酸：

半胱氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸羧肽酶A一、蛋白质的概述蛋白质(Protein，pr)

：是一切生物体中普遍存在的，由天然氨基酸按照一定的顺序，通过肽键连接而成的一条或多条肽链构成的生物大分子；其种类繁多，各具有一定的相对分子质量，复杂的分子结构和特定的生物功能；是表达生物遗传性状的一类主要物质。第4章蛋白质的共价结构

P43（一）、蛋白质的元素组成一般蛋白质含氮量平均为16%,即1份氮素相当于6.25份蛋白质,此即蛋白质系数。蛋白质含氮量分析（二）、蛋白质的分类球蛋白（globulins）：不溶于水而溶于稀盐、稀酸和稀碱溶液，能被半饱和硫酸铵所沉淀。普遍存在于生物体内，如血清球蛋白、肌球蛋白和植物种子球蛋白等B根据蛋白质形状的分类2.球状蛋白质、球状和球蛋白？1.根据分子形状的不同，可将蛋白质分为球状蛋白质和纤维状蛋白质两大类，要注意球状蛋白质不等于球蛋白。球蛋白是按溶解度分类的一类蛋白质﹡单体蛋白质：仅含一条多肽链。牛核糖核酸酶：一条多肽链﹡多聚蛋白质：含两条或多条多肽链。胰岛素：两条（两种）多肽链血红蛋白：四条（两种）多肽链

C.按多肽链条数分类胰岛素多聚蛋白质为什么可以多聚？血红蛋白和肌红蛋白谁的疏水氨基酸更多？体积大的球状蛋白质疏水氨基酸比例在增加还是减少？（三）、蛋白质的结构层次蛋白质的结构层次1.一级结构：指蛋白质分子中的氨基酸的排列顺序。2.二级结构：指蛋白质多肽链的主链骨架中的若干肽段的构象，排列。所有蛋白质的主链结构相同，长短不同。3.三级结构；指多肽链在二级结构的基础上，各原子的空间排布，包括侧链基团的取向，是二级结构的基础上范围更广的盘旋和折叠。4.四级结构：是指多条肽链组成的一个蛋白质分子时，各亚单位在寡聚蛋白质中空间排布及亚单位间的相互作用（四）、蛋白质的生物学重要性蛋白质是生物体重要组成成分分布广含量高2.蛋白质具有重要的生物学功能

1）催化生物化学反应（酶）

2）结构成分(结缔组织的胶原蛋白、皮肤的弹性蛋白、膜蛋白)

3）贮藏（卵清蛋白、种子蛋白）

4）物质运输（血红蛋白、脂蛋白、电子传递体）

5）细胞运动（肌肉收缩的肌球蛋白、肌动蛋白）

6）激素功能（胰岛素）

7）防御功能（抗体、血凝蛋白）

8）接受传递信息（受体蛋白、味觉蛋白）

9）调节细胞生长、分化和遗传信息的表达（阻遏蛋白）3.氧化供能二、肽（peptide）和肽键(peptidebond)（一）、肽和肽键的结构和命名

肽是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的无分支线形聚合物。其中的氨基酸单位称氨基酸残基。氨基酸间缩水形成的共价键称肽键肽链中的氨基酸在参加肽键形成时失去了1分子水，已经不是原来完整的分子，称为氨基酸残基。氨基酸残基的平均分子量为：110或120。肽氨基酸借肽键连接的分子叫肽：

1）两个氨基酸组成的肽叫二肽；

2）三个氨基酸组成的肽叫三肽；

3）多个氨基酸组成的肽叫多肽；

4）氨基酸借肽键连成长链，称为肽链，肽链两端有

自由-NH2和-COOH，自由-NH2端称为N-末端（氨基

末端），自由-COOH端称为C-末端（羧基末端）；

5）构成肽链的氨基酸已残缺不全，称为氨基酸残基；

6）肽链中的氨基酸的排列顺序，一般-NH2端开始，由N指

向C，即多肽链有方向性，N端为头，C端为尾。二肽没有双缩尿反应肽的写法肽键的结构特点：

C-N：

0.149nm

肽键：0.132nm

C=N：0.127nm（1）酰胺氮上的孤对电子与相邻羰基之间形成共振杂化体。（2）肽键具有部分双键性质，不能自由旋转。肽键比一般

C-N键短（3）肽键具有平面性，组成肽键的4个原子和2个

Cα几乎处在同一平面内（酰氨平面）。（4）肽键亚氨基在pH014内不解离。（5）肽链中的肽键一般是反式构型，而Pro的肽键可能出现顺、反两种构型．肽键的结构特点肽键的紫外吸收 210～230nm

蛋白质溶液在238nm处的光吸收的强弱,与肽键的多少成正比。相关名词-肽单元肽单元：参与肽键的6个原子被约束于一个平面上，与此相应的-Cα-CO-NH-Cα-则称为肽单元。一个氨基酸相关名词-多肽主链多肽主链：在多肽链中由肽键连接的各氨基酸残基形成的长链骨架为多肽链的主链。或：肽链的骨干是由肽单元重复排列而成长链，称为主链。长链骨架N-C-C-N-C-C-N-C-C1、肽的晶体是离子晶格，溶点高。2、旋光性：一般短肽的旋光度等于其各个氨基酸的旋光度的总和，长肽不等于。3、具有两性解离和等电点：肽的酸碱性质－－决定于末端α-氨基和α-羧基及R基。在长肽或蛋白质中，可解离的基团主要是侧链基团。肽中C端的羧基的pK要比自由氨基酸的pK大.肽中N端的氨基的pK要比自由氨基酸的pK小，酸性强了

R基的解离和氨基酸差不多。（二）、肽的物理和化学性质氨基酸和肽解离比较自由氨基酸的pK要比肽中C端的羧基的pK小.自由氨基酸的pK要比肽中N端的氨基的pK大，-e+++-肽的两性解离和肽的等电点ComparingthepKaValuesofAlanineandPolyalanineAminoacidorpeptidepK-cooHpK2-NH3+Ala2.349.69Ala–Ala3.128.30Ala–Ala–Ala3.398.03Ala–(Ala)n–Ala,n大于43.427.94Thetitrationofdi-,tri-,andlargeroligopeptidesofalaninealsoshowstheionizationofonlytwofunctionalgroups,althoughtheexperimentalpKavaluesaredifferent.ThetrendinpKavaluesissummarizedinthetable.肽的物理和化学性质双缩脲反应是肽和蛋白质特有的反应，游离氨基酸无此反应。该法测定蛋白质含量需肽端完整，不能水解4、双缩脲反应：含有两个或两个以上肽键的化合物与碱性硫酸铜作用，生成蓝紫色的复合物，肽键越多颜色越深，受蛋白质特异性影响小，可用于肽和蛋白质定量测定及测定蛋白质水解程度（两个肽键以上的肽均有该反应，二肽没有）思考：用下列方法测定蛋白质含量，_需要完整的肽键。A.双缩脲反应B.凯氏定氮C.紫外吸收D.茚三酮反应华中农业大学2002年硕士研究生入学考试生物化学试题双缩脲反应思考（判断）：双缩脲反应是肽和蛋白质特有的反应，所以二肽也有双缩脲反应中国科学院2001年招收攻读硕士学位研究生入学考试试卷5、肽也有茚三酮反应双缩脲法测量蛋白质含量具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应。而蛋白质及多肽的肽键能与Cu2+形成紫红色络合物，其最大光吸收在540nm处。其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸的组成无关，该法测定蛋白质的浓度范围适于1~10mg/mL。双缩脲法常用于蛋白质的快速测定。双缩脲法主要针对蛋白质的肽键多少双缩脲法的缺点是灵敏度差、所需样品量大。（三）.天然存在的活性肽在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在，这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽。如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。1.

谷胱甘肽

三肽（Glu-Cys-Gly），广泛存在于生物细胞中，含有自由的巯基，具有很强的还原性，可作为体内重要的还原剂，保护某些蛋白质或酶分子中的巯基免遭氧化，使其处于活性状态。谷胱甘肽解毒作用：与毒物或药物结合，消除其毒性作用；

参与氧化还原反应：作为重要的还原剂，参与体内多种氧化还原反应；

保护巯基酶的活性：使巯基酶的活性基团-

SH维持还原状态；

维持红细胞膜结构的稳定：消除氧化剂对红细胞膜结构的破坏作用。

蚕豆病？2抗生素类多肽含有D-苯丙氨酸、鸟氨酸，4、

α-鹅膏蕈碱主要抑制真核RNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ，对细菌的RNA聚合酶作用极小5肌肽和鹅肌肽肌肽（carnosine）:β-Ala-His鹅肌肽（anserine）:β-Ala-1-Me-His3激素类多肽天然存在的活性肽三、蛋白质一级结构的测定（一）蛋白质一级结构的定义:

蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序，即氨基酸的线性序列。一级结构中包含的共价键主要指肽键和二硫键。在基因编码的蛋白质中，这种序列是由mRNA中的核苷酸序列决定的。

1、直接法（测蛋白质的序列）

2、

间接法（测核酸序列推断氨基酸序列，目前往往采用从待测蛋白质的基因序列反推出蛋白质的一级结构）

一个纯蛋白质，理想方法是从N端直接测至C端，但目前只能测60个N端氨基酸。所以需要将大化小，逐段分析，制成两套肽片段，找出重叠位点，排出肽的前后位置，最后确定蛋白质的完整序列。一级结构测定的方法：蛋白质一级结构测定的策略：直接法样品纯度必须>97%以上；(1)测定蛋白质分子中多肽链的数目(2)拆分蛋白质分子的多肽链(3)断开多肽链内的二硫桥

(4)分析每一多肽链的氨基酸组成(5)鉴定多肽链的N—末端和C—末端残基(6)裂解多肽链成较小的片段。(7)测定各肽段的氨基酸序列。(8)重建完整多肽链的一级结构。(9)确定半胱氨酸残基间形成的S--S交联桥的位置蛋白质一级结构测定的策略：测定蛋白质多肽链种类和数目的方法种类：

SDS数目：N末端氨基酸残基摩尔数/蛋白质摩尔数1、测定蛋白质中多肽链的条数2、多肽链的拆分

由多条多肽链组成的蛋白质，必须先进行拆分。

（1）拆分非共价键，可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基).如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；

（2）拆分二硫键3、断开二硫键；拆分二硫键：几条多肽链通过二硫键交联在一起。可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍变性，应用过甲酸氧化法或过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。氧化法或还原法链间非共价力—盐酸胍；尿素二硫键—过甲氧酸氧化法、巯基还原法断开二硫键还原法烷基化试剂保护巯基乙醇二硫苏糖醇过甲酸氧化法4、多肽链的氨基酸组成分析方法：酸水解辅助以碱水解，再用蛋白质分析仪蛋白质水解↓↓↓氨基酸分析仪酸水解（Trp,Ser,Thr,Tyr,Asn,Gln）碱水解(exc.Trp)5、分析多肽链的N末端和C末端多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸。1.N末端氨基酸的分析方法（1）二硝基氟苯法（DNFB)（2）丹磺酰氯法（3）苯异硫氰法（PITC)（4）氨肽酶法2.C末端测定方法（1）羧肽酶法：（2）肼解法（3）还原法：分析多肽链的N

末端和C末端N端氨基不能被封闭1.DNS-Cl法：丹磺酰氯最常用，黄色荧光，灵敏度极高，DNS-多肽水解后的DNS-氨基酸不需要提取。2.DNFB法：Sanger试剂，DNP-多肽，酸水解，黄色DNP-氨基酸，有机溶剂（乙酸乙酯）抽提分离，纸层析、薄层层析、液相等。3.PITC法：Edman法，逐步切下。无色PTH-氨基酸，有机溶剂抽提，层析。（1）N端分析方法①二硝基氟苯法（DNP法）

Sanger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。Sanger试剂和Sanger应用：鉴定多肽或蛋白质的N-末端氨基酸。Sanger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定

Sanger，确定了胰岛素的一级结构，1958年获Nobel化学奖。1975年建立了快速测定DNA序列的加、减法，1976年又一次获NobelPrize.）N端分析方法②丹磺酰氯法（DNS法）

在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9mol。③苯异硫氰酸(酯)法（PITC法、PTH法、Edman降解法）蛋白质序列分析仪的分析原理！N端分析方法氨肽酶法

从多肽链的N-末端逐个地向里切。根据不同的反应时间测出酶水解所释放的氨基酸种类和数量，按反应时间和残基释放量作动力学曲线。‡亮氨酸氨肽酶：最常用‡氨肽酶M：较常用N端分析方法分析多肽链的N

末端

有些蛋白质的肽链没有游离的氨基端，较多的情况是氨基端因受到乙酰化或谷氨酸残基自身环化为焦谷氨酸残基而被封闭。此时我们可采用相应方法对封闭N-末端进行测定。

甲酰基常以甲酰甲硫氨酸的形式存在于原核体系的初生肽链的端部。乙酰化N-末端环肽甲酰基末端(2).C-末端分析方法1.羧肽酶法，（Pro不能测）

羧肽酶A：除Pro、Arg、Lys外的所有C端a.a

羧肽酶B：只水解Arg、Lys2.还原法,硼氢化锂(LiBH4)

肽-COOHÆ生成肽-CH2OHÆ水解,分离,层析鉴定。此法比较少用。3.肼解法Val—Ser—Gly6、多肽链部分裂解成较小的片段酶解法:胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶等。化学法：溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。酶解法A.胰蛋白酶(trypsin)

专一裂解Lys、Arg的羧基参与形成的肽键。为了减少的作用位点，可用化学修饰将多肽链侧链保护起来，1.2－环己酮封闭Arg，马来酸酐封闭Lys。氮丙啶形成带正电荷点，增加位点。B.糜蛋白酶(Chymotrypsin)

断裂Phe,Trp,Tyr等疏水AA的羧基所形成的肽键。断裂键邻近的基团，碱性：裂解能力↑，酸性：裂解能力↓C.胃蛋白酶(Pepsin)

断裂键两侧的殘基都是疏水性或芳香氨基酸残基。其后和前为Pro时抑制。化学法——溴化氰（BrCN）水解法，选择性切割甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。蛋白质一级结构测定的策略①

电泳法：SDS－PAGE：根据分子量大小分离②

离子交换层析法（DEAE—Cellulose、DEAE—Sephadex）根据肽段的电荷特性分离③

反相HPLC法：根据肽段的极性分离④

凝胶过滤：根据分子大小6、肽段的分离纯化7、测定各短肽段的氨基酸序列方法：蛋白质序列分析仪原理：

1.Edman法

2.DNS-Edman法

3.有色-Edman法质谱法质谱法一般采用高速电子来撞击气态分子，将样品转化为运动的带电气态正离子，加速导入质量分析器，然后按质荷比（m/z）的大小顺序进行收集和记录，测出了离子的准确质量，得到质谱图，根据质谱峰的位置进行定性和结构分析，根据峰的强度进行定量分析质谱分析法基本原理基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱电喷射串联质谱可分析微量的肽链，短肽在第一台质谱仪中经电喷射电离，按荷质比分离，依次在经碰撞池被裂解成离子碎片，在第二台质谱仪中测出各个离子碎片的谱线，推算出短肽的氨基酸序列。在蛋白质组学中应用广泛，但不能区分亮氨酸和异亮氨酸。质谱法测序的突出优点是可以识别翻译后修饰(post-translationsmodification)而得到的特殊氨基酸。8、重建完整多肽链的一级结构不同的方法指的是断裂的专一性不同，即切口彼此是错位的。因此两套肽段正好相互跨过切口而重叠，这种跨过切口而重叠的肽称为重叠肽(overlapingpeptide)。借助重叠肽可以确定肽段在原多肽链中的正确位置，拼凑出整个多肽链的氨基酸顺序。9、二硫键位置的确定-对角线电泳来测点样、滤纸中央↓

PH6.5第一向电流

↓

肽段按大小及电荷分开

↓

滤纸暴露在过甲酸蒸汽中（－S－S－断裂）

↓

含二硫键肽段被氧化成氧化成一对含半胱氨磺酸的肽

↓

滤纸旋转90，PH6.5第二向电流

↓

含半胱氨磺酸的成对肽段负电荷偏离对角线

↓

茚三酮AA顺序分析

↓

确定二硫键的位置二硫键位置的确定-对角线电泳

二硫键位置的确定-对角线电泳来测

2．分离含胡二硫键的肽段可以用（②）

①SDS－PAGE电泳；②对角线电泳；③琼脂糖电泳

中科院上海生化与细胞所生物化学2002年中国计量学院20071、为测定蛋白质中的二硫键位置,常采用对角线电泳法,问点样时样品应点在下列所指的哪个位置滤纸的

①左下角;②右上角;③边缘中间;④中央答()3、对角线电泳。先是用专一性适中的蛋白质水解酶，将蛋白质降解为若干片段。随后进行二维纸电泳，在第一相电泳用氧化剂处理，然后进行第二相电泳。经显色后，在多角线上的肽段均不含有二硫键，而偏离对角线的肽段是形成二硫键的肽段。目前利用质谱技术也可以测定二硫键。厦门大学生命科学学院2005年考研试题10、酰胺基位置的确定

Asp—Asn、Glu—Gln方法：酶解肽链，产生含有单个Asx或Glx的肽，用电泳法确定是Asp还是Asn。举例：Leu-Glx-Pro-Val肽在pH=6.0时，电荷量是Leu+Pro0Val-此肽除Glx外，净电荷为0，可根据此肽的电泳行为确定是Glu或是Gln。

1953年FrederickSanger和他的同事们首次测定了牛胰岛素的氨基酸一级结构，它包含2条肽链、51个氨基酸。由于此项工作，他获得了1958年度诺贝尔奖。

60年代,我国首次人工合成结晶牛胰岛素蛋白质测序举例第一个侧出二、三级结构的蛋白质：肌红蛋白第一个侧出四级结构的蛋白质：血红蛋白第一个被确定氨基酸序列的酶:核酸酶

(Hirs等，1960年)蛋白质测序举例蛋白质测序直接法和间接法比较优点：成本低、周期短，一次可测序列长缺点：二硫键无法确定无法测定其修饰基团未必是蛋白质的最终形式推测出的蛋白质可能比实际蛋白质大或小

？间接法：待测蛋白质做抗原免疫动物得抗体再以后者做抗原免疫动物，沉淀含有待测蛋白质得核糖体，得到待测蛋白质得mRNA，逆转录得cDNA测序蛋白质一级结构的实例用几种酶或试剂把蛋白质水解成大小不