答辩幻灯 程志强课件

应用二维电泳、液相色谱串联质谱技术筛选前列腺癌骨转移相关血清蛋白硕士学位论文答辩导师:李鸣学生:程志强2009年5月26日恩师:李鸣1992德国美茵兹大学医学博士1998-2001美国休士顿MDAnderson肿瘤中心工作学习2001年任美国休士顿Baylor医学院助理教授2003-2007年任北京大学泌尿外科研究所副所长2007.7-现在北京肿瘤医院泌尿外科主任中华医学会泌尿外科分会肿瘤学组副组长兼秘书长，《中国前列腺癌诊断治疗指南》主编

，中国前列腺癌协作组组长程志强简历1991-1996北华大学医学院临床医学本科

预备党员、通过英语CET-4、体育部长…1996-2006吉林油田职工医院住院医师主治医师2006-2007北京大学医学部硕士研究生2007-2009北京大学肿瘤医院泌尿外科硕士研究生《肿瘤防治研究》发表论著一篇前列腺癌流行病学世界范围内第二常见恶性肿瘤明显地理和种族差异:亚洲低,欧美高黑人高我国2002年标化发病率为1.6/10万,发病率逐年升高:上海1973-19751.8/10万1997-19995.5/10万发病率上升的原因疾病危险因素的真正增加(见后)PSA筛查,前列腺穿刺活检及经尿道前列腺电切术(TUR-P)发现临床潜伏前列腺癌前列腺癌的危险因素

RiskFactors尚未确定的危险因素高动物脂肪饮食雄激素受体维生素D受体谷胱甘肽转硫酶M1…前列腺癌的治疗

和目前的难题内分泌治疗手术去势:切除双侧睾丸药物去势:黄体生成素释放激素:LHRH-a抗雄激素药物:氟他胺比卡鲁胺原理:前列腺癌细胞的增殖依赖于雄激素受体的的激活去势治疗：降低血中雄激素水平抗雄激素药物：抑制双氢睾酮与雄激素受体的结合前列腺癌骨转移前列腺癌细胞与骨质微环境之间存在着特异性的相互作用,虽然前列腺癌细胞可以向全身器官组织转移,但骨质局部环境中产生的细胞因子会增加其对骨髓基质细胞的趋向和粘附能力,从而使之更容易形成转移灶。

前列腺癌骨转移肿瘤骨转移可以分为溶骨型和成骨型。前列腺癌骨转移绝大多数表现为成骨型。事实上,在前列腺癌的骨转移病灶中,溶骨性和成骨性过程都是活跃的。从细胞水平来看,转移的前列腺癌细胞首先与破骨细胞反应,产生溶骨现象,为以后的成骨提供了必要的空间、营养物质和钙离子。同时,前列腺癌细胞又与成骨细胞作用产生骨硬化。从组织形态学来看,溶骨性病变有继发的骨形成,而成骨性病变中也观察到溶解现象。只是由于骨塑性过程中成骨性病变占主导地位,而最终导致骨硬化。前列腺癌骨转移前列腺癌经多途径转移,其中35%为血源传播。传统的是经下腔静脉转移到血管丰富的承重骨,如长骨近端、脊椎、骨盆,以及肋骨等红骨髓丰富的部位。另外,椎静脉丛系统具有压力低、容积大,与肋间静脉、肺静脉、腔静脉、门静脉广泛相互交通等特点。有证据表明,某些一过性暂时性腹压增高,会促进前列腺癌细胞通过椎静脉丛向腔静脉内搏动性释放,故可形成脊椎和其他内脏转移。前列腺癌骨转移前列腺癌是欧美国家最为常见的泌尿系恶性肿瘤,在我国发病率有逐年升高的趋势,且发现时多已达进展期。远处转移是前列腺癌患者最主要的死亡原因,超过80%的患者会发生骨转移，并可以引发许多并发症,如疼痛、病理性骨折、高钙血症、脊髓压迫及其他神经压迫综合征等，这些骨转移相关事件既影响前列腺癌患者的生活质量，又加速了前列腺癌患者的死亡。本课题的立论依据

和课题设计缩写

2-DE

：two-dimensionalgelelectrophoresis

二维电泳CapLC

：capillaryliquidchromatography毛细管液相色谱MS/MS串联质谱立论依据2-DE技术半定量分析不同的蛋白质组,即对不同状态样品所表达蛋白质的动态差异分析,如正常和恶化细胞、细胞对药物的反应、生物体不同的特殊发展阶段等。而应用质谱(massspectrometry,MS)分析可进行蛋白质鉴定和序列测定，样品分子离子化后，根据不同离子之间的质荷比的差异来分离并确定不同蛋白质或多肽的相对质量得到肽质量指纹图（peptide-massfingerprinting，PMF）结合经色谱、串联质谱联机测定得到的肽序列标签（peptidesequencetagging，PST）查询蛋白质数据库确定蛋白质。实验样品的选择本实验所有样本均取自北京大学第一医院泌尿外科研究所2006年2月至2007年8月间住院患者。其中前列腺癌骨转移患者12例，无骨转移患者15例，年龄54~81岁，平均年龄70.2±7.6岁。所有患者均有前列腺穿刺活检诊断证据，骨转移患者经MRI和同位素骨扫描诊断。患者入选标准为无心脑血管疾病、糖尿病、高血脂、高血压、严重肝肾疾病、甲状腺疾病及其他良、恶性肿瘤。27例患者均为初诊。所有患者均在治疗前采取清晨空腹静脉血，经促凝、离心、分离血清、分装、-80°C冰箱保存备用。

国内相关研究情况利用双向凝胶电泳和质谱技术进行前列腺癌差异蛋白质组学研究方法培养前列腺癌雄激素依赖型(LNCaP)和非依赖型(DU145)细胞系,分别提取两种细胞系的总蛋白,进行等电点聚焦和SDS2聚丙烯酰胺凝胶电泳,对所得胶图利用ImageMaster4.01软件进行分析,选取差异点进行质谱分析,对分析结果进行数据库检索。结论在前列腺癌激素依赖型和激素非依赖型细胞系中存在差异表达蛋白质,并可以利用双向凝胶电泳技术进行分离,为进一步研究前列腺癌的蛋白质组学和发病机制提供了线索。

山西医科大学学报2008年4月。

国外相关研究情况SerumLevelsofanIsoformofApolipoproteinA-IIasaPotentialMarkerforProstateCancerProstatecancerandbenignprostatehyperplasiaserum

gelelectrophoresis

liquidchromatography,

tandemmassspectroscopy

immunoassayResultsApoA-IIisspecificallyoverexpressedinserumfromindividualswithprostatecancer.ApoA-IIwasalsooverexpressedintheserumofindividualswithprostatecancerwhohavenormalprostate-specificantigen(0-4.0ng/mL).DepartmentofPathology,UniversityofAlabamaatBirmingham,Alabama.ClinicalCancerResearch.February1,2005.国外相关研究情况IdentificationofSerumAmyloidAasaBiomarkertoDistinguishProstateCancerPatientswithBoneLesions.serafromprostatecancerpatients(n=

38)withandwithoutbonemetastases.two-dimensionalgelelectrophoresisSELDI-TOFMSELISA.Results:TheclusterofuniqueproteinsintheseraofpatientswithbonemetastaseswasidentifiedasisoformsofserumamyloidA.Conclusions:SELDI-TOFMSproteinprofilingincombinationwithotherproteomicapproachesmayprovidediagnostictoolswithpotentialclinicalapplicationsandserveastoolstoaidinthediscoveryofbiomarkersassociatedwithvariousdiseases.

BritishColumbiaCancerAgency,Vancouver,BritishColumbia,Canada.ClinicalChemistry2005.实验研究二维电泳分别取适量两组混合血清，用Bradford法进行蛋白定量,再用水化液调整到1μg/μl后上样，蛋白质上样量1mg。先做预实验经PDQUEST2-DE软件分析发现胶图分辨率可以接受，遂未做血清高丰度蛋白去除处理。操作严格按照Bio-Rad公司双向电泳实验操作手册进行。采用IPG预制胶条17cmpH值3-10。开始电泳，梯度升压,等电聚焦总伏小时为100kVh。平衡后胶条转移至12.5%十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)上进行第2相电泳。16℃恒温,采用恒定功率电泳,开始时2.5W/gel,1小时;再用15W/gel至溴酚蓝到达凝胶的底部边缘。每组实验重复三次。毛细管液相色谱-电喷雾离子源-串联质谱（CapLC-ESI-MS/MS）全自动分析

将经二维电泳分离考马斯蓝染色PDQUEST2-DE软件确定的差异蛋白质斑点用刀片切下，切成1平方厘米的胶块，置于Eppendorf管中，用100微升50%乙晴-100mmol/l碳酸氢铵洗2~3次，每次20分钟，至胶粒完全脱色。脱色后的胶粒置于真空干燥器(SpeedVacSavantInstrumentsUSA)中干燥20分钟，加入5~10微升10mg/l的胰蛋白酶液（含25mmol/l碳酸氢铵溶液，PH8.0）,置4摄氏度冰箱防治40分钟，补加10微升25mmol/l碳酸氢铵缓冲液，37摄氏度温育过夜。50~100微升50%三氟乙酸40摄氏度提取酶切肽段，一小时一次。用相同体积的50%丙烯晴-2.5%三氟乙酸溶液于30摄氏度提取，一小时一次。50微升丙烯晴超声提取一次。合并3次提取液，用真空干燥器(SpeedVacSavantInstrumentsUSA)进行干燥。用3~5微升0.5%的三氟乙酸溶液溶解干燥后的蛋白样品，取1.5ml样品置于CapLC-ESI-MS/MS全自动分析仪的自动进样管中脱盐，脱盐后的样品进入C18毛细管柱进行肽段分离,分离后的肽段直接进入离子源,对于每一个强度超过阈值的肽段(一般为主峰强度的10%)都自动进行MS/MS测定。测定后的数据经ProteinLynx2.0(Waters)软件处理，通过Mascot()查询NCBI数据库进行蛋白质鉴定。搜索参数设置为：数据库为NCBInr,酶为胰蛋白酶,允许漏切位点为2，母离子误差范围±1.2Dalton,碎片离子±0.5Dalton。酶联免疫吸附试验ELISA分析

用双抗体夹心酶标免疫分析法测定样本血清中ApoA-I的含量，严格按瑞典MabtechAB公司HumanApoA-IELISAKit说明书进行。用2μg/ml的鼠抗人ApoA-I单克隆抗体包被微孔板，制成固相抗体，再往包被单抗的微孔中依次加入ApoA-I抗原、生物素化的抗人ApoA-I抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物四甲基联苯胺（TMB）显色。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），同时用试剂盒中提供的标准品制作标准曲线，根据样品的OD值用标准曲线计算样品浓度。统计方法采用SPSS10.0软件两组均数之间的比较用成组设计资料的t检验多组均数之间的比较用单因素方差分析。实验结果双向电泳二维电泳共得到6块胶(G1,G2,G3,G4,G5,G6),G1~3为骨转移组，G4~6为非骨转移组胶图。利用虚拟重建技术分别以蛋白质点较多的G1和G4胶为参考胶,进行虚拟重建,得到两块重建胶图,利用统计学分析软件SPSS10.0,通过χ2分析对两组凝胶图像的蛋白质点进行组内和组间差异性发现,两组之间χ2=3.168,P=0.046<0.05，差异具有统计学意义,说明两块胶图分辨率好，可以用来比较两组间差异表达的蛋白质。经PDQUEST2-DE软件分析,将3倍差异表达定为具有显著性标准,共检测出4个差异点，其中第4号蛋白质点在无骨转移组高表达，第1、2和3号在骨转移组高表达。双向电泳

前列腺癌骨转移组与非骨转移组患者血清蛋白二维电泳图及部分差异点

The2-Delectrophoretogramandpartsofdisparatepointsoftheserumofpatientofprostatecancerwithandwithoutosseousmetastasis

CapLC-ESI-MS/MS分析结果

差异蛋白点经CapLC-ESI-MS/MS分析后利用Mascot查询NCBI数据库，4个差异蛋白点共鉴定得到3种差异蛋白质（蛋白2和蛋白3为同一种蛋白）。其中第1号点为CK10、第2号点和第3号点同为SAA、第4号点为ApoA-I。这些蛋白中SAA和CK10在骨转移患者中相对高表达，而ApoA-I在骨转移患者相对低表达。CapLC-ESI-MS/MS分析结果前列腺癌骨转移组与非骨转移组患者血清中差异表达的蛋白质的鉴定结果Theoutcomesofidentificationofthedifferentialexpressionproteinsoftheserumofpatientofprostatecancerwithandwithoutosseousmetastasis

ELISA结果

ELISA测定所有27例样本后经统计分析发现ApoA-I在这两组患者之间的表达有差异（P<0.001）,有骨转移的患者血清中ApoA-I的浓度低于无骨转移的前列腺癌患者。有骨转移前列腺癌患者血清中ApoA-I的浓度为324.3±6.9ng/ml;无骨转移前列腺癌患者血清中ApoA-I的浓度为343.6±6.6ng/ml。ELISA结果ELISA测定的ApoA-I在前列腺癌骨转移和非骨转移组患者血清中浓度的统计分析ThestatisticalanalysisofthedensityoftheApoA-Iinthepatientsofprostatecancerwithandwithoutosseousmetastasis研究结论本实验利用二维凝胶电泳及串联质谱技术鉴定出了在前列腺癌有骨转移患者和前列腺癌无骨转移患者血清中表达量有差异的3个蛋白，这3个蛋白质分别为：ApoA-I、SAA及CK10，其中SAA和CK10在骨转移患者组相对高表达，而ApoA1在骨转移患者组相对低表达。ELISA实验证实了ApoA-I在前列腺癌无骨转移患者血清中含量升高。载脂蛋白A-I、SAA和CK10与前列腺癌骨转移相关,可能作为前列腺癌骨转移的诊断或预测标志物。

讨论ApoA-I是高密度脂蛋白(High-densitylipoprotein,HDL)的主要蛋白质组分，是一种急性时相反应蛋白,具有结合磷脂、多种血浆因子及细胞膜受体、激活卵磷脂-胆固醇酰基转移酶(Lecithin-cholesterolacyltransferase,LCAT)以及抑制炎症细胞因子释放[1]和延缓动脉粥样硬化（artherosclerosis;AS）发生发展的作用。2008年刘桂芝等人报道ApoA-I在人I期肺癌组织及正常癌旁组织中具有差异表达。国外关于ApoA-I与前列腺癌相关性的报道最近的为2004年Zhang等人的研究，结果显示前列腺癌患者血清载脂蛋白A-I浓度较正常对照者显著降低。2005年Malik等人还报道HDL的另一个载脂蛋白成分载脂蛋白A-II（ApoA-II）在前列腺癌患者血清中浓度较正常对照者显著升高。讨论

SAA也是一