常见NGS方案实验流程及常见问题解析-讲义课件

常见NGS方案实验流程

及问题解析常见NGS方案实验流程

及问题解析概要常见NGS方案实验原理及流程介绍常见问题解析Hiseq测序仪相关知识及指标概要常见NGS方案实验原理及流程介绍2概要常见NGS方案实验原理及流程介绍常见问题解析Hiseq测序仪相关知识及指标概要常见NGS方案实验原理及流程介绍3基因组学研究基因组重测序未知基因组测序单细胞基因组测序表观遗传学研究全基因组甲基化测序MeDIP-Seq简化甲基化测序免疫组学研究ChIP-Seq靶向区域研究全外显子组测序靶向捕获测序扩增子测序转录组学研究mRNA-Seq全转录组测序单细胞转录组组测序转录表达调控研究sRNA-Seq转录因子研究RIP-SeqDNA测序DNA文库cDNA测序基因组学研究表观遗传学研究免疫组学研究靶向区域研究转录组学研4NGS基本流程STEP1样本前处理STEP2文库构建STEP3上机测序STEP4生物信息分析NGS基本流程STEP1样本前处理STEP2文库构建STEP5样本前处理样本前处理都做些什么？核酸提取（DNA/RNA)样本类型有哪些？人，动物的血液及器官组织等。植物（根茎叶，胚芽，种子等）。微生物（细菌，真菌）。样本前处理样本前处理都做些什么？6DNA提取DNA提取的基本原理DNA溶于水，在钠盐比在水中的溶解度较大。但不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般有机溶剂。萃取沉淀DNA提取DNA提取的基本原理萃取7DNA在生物体中的存在形式DNA在细胞中常以核酸—蛋白复合体（核蛋白）形式存在。DNA在生物体中的存在形式DNA在细胞中常以核酸—蛋白复合体8DNA提取基本流程细胞破碎杂质去除沉淀DNA溶解DNADNA提取基本流程细胞破碎杂质去除沉淀DNA溶解DNA9DNA提取总原则保证核酸一级结构的完整性；排除其它分子的污染。DNA提取总原则10DNA提取方法概述人，动物组织（SDS法）人，动物全血，体液等（离心柱法）植物组织提取（CTAB法）质粒DNA（碱裂解法/离心柱法）线粒体/叶绿体DNA（SDS差速离心法）DNA提取方法概述人，动物组织（SDS法）11DNA提取方法概述人，动物组织（SDS法）人，动物全血，体液等（离心柱法）植物组织提取（CTAB法）质粒DNA（碱裂解法/离心柱法）线粒体/叶绿体DNA（SDS差速离心法）DNA提取方法概述人，动物组织（SDS法）12LysisBuffer样本破碎细胞裂解56℃离心取上清25:24:1酚氯仿异戊醇LysisBuffer离心取上清24:1氯仿异戊醇离心取上清乙醇异丙醇70%乙醇离心离心溶解DNALysisBuffer样本细胞56℃离心取上清25:24:13LysisBuffer（裂解缓冲液）组分Tris-HCl(pH8.0)EDTA(pH8.0)SDSProteinaseK终浓度100mM50mM1%(w/v)加样本前加入200ug/ml加样本前加入Tris-HCl(pH8.0)：提供碱性反应条件，防止DNA酸解。EDTA(pH8.0)：大分子螯合二价阳离子，抑制DNase活性。SDS：去垢剂，破坏细胞膜，解离核蛋白，使蛋白质变性。ProteinaseK：广谱蛋白酶，在SDS，EDTA存在下活性很高，高效催化蛋白质降解成多肽或氨基酸，释放DNA。LysisBuffer（裂解缓冲液）组分Tris-HClE14样本破碎尽量选取新鲜的组织样本，若是冷冻样本，避免反复冻融。研磨的整个过程必须保持低温。佩带棉手套后必须佩带一层PE手套，防止液氮冻伤！样本破碎尽量选取新鲜的组织样本，若是冷冻样本，避免反复冻融。15细胞裂解裂解需充分材料适量，过多的材料会导致裂解不充分，从而影响后续DNA得率低，质量差。消化过程中，定时轻轻震荡。温度55℃-60℃都可以。必要时，可消化过夜。细胞裂解裂解需充分16去除蛋白质酚:氯仿:异戊醇（25:24:1V/V）溶液酚：（被水或Tris-HCl8.0饱和的酚）强烈的蛋白质变性剂，在初步纯化时，可有效的使蛋白质变性从而去除。异戊醇：消泡剂，帮助有机分相。去除蛋白质酚:氯仿:异戊醇（25:24:1V/V）溶液17去除其他有机杂质氯仿：异戊醇（24:1V/V）氯仿：1.高效蛋白质变性剂，具有高效溶脂性，可以有效去除脂类。2.本步骤中的氯仿可以萃取微量溶解在水相中的酚。异戊醇：消泡剂，帮助有机分相。去除其他有机杂质氯仿：异戊醇（24:1V/V）18DNA沉淀完整的基因组DNA（gDNA）片段大，可以直接使用2-3倍体积乙醇或0.6-1倍体积异丙醇常温加入并颠倒数次，即可看见成团白色沉淀。降解或片段偏小的DNA，可用预冷的乙醇或异丙醇进行沉淀，必要时可放置-20℃沉淀过夜。DNA沉淀完整的基因组DNA（gDNA）片段大，可以直接使用19盐离子去除70%乙醇DNA不溶于乙醇，盐离子溶解于水。盐离子去除70%乙醇20DNA干燥本步骤必须进行！乙醇残留会抑制PCR反应，酶反应等等。干燥时间一般控制在2-5分钟。不能过度干燥，否则沉淀很难溶解！DNA干燥本步骤必须进行！21DNA溶解长期保存DNA，建议用TE溶解，EDTA可抑制DNase活性。若需要立刻进行建库反应，可用水或Tris-HCl（pH8.0）溶解。如果过度干燥导致沉淀溶解困难，可放置4℃轻度震荡过夜溶解。DNA溶解长期保存DNA，建议用TE溶解，EDTA可抑制DN22DNA质检质检内容：浓度、纯度、完整性质检所用方法：Qubit2.0（荧光定量双链DNA技术）

Nanodrop分光光度技术（OD）DNA水平凝胶电泳DNA质检23浓度质检NanoDrop也可以测浓度，为什么一定要用Qubit？NanoDrop基于核酸紫外吸收原理，若有单链DNA，RNA或部分蛋白，脂类也会影响紫外吸收，导致定量偏高。Qubit使用的荧光染料可以特异结合双链DNA，提高定量准确性。DNA纯度越高，NanoDrop定量结果与Qubit定量结果的差异就越小。Qubit与PicoGreen有什么区别？都使用荧光染料定量双链DNA，从使用原理上没有根本性区别。PicoGreen可实现自动化，使用酶标仪进行定量。两者的定量范围相同，但Picogreen在使用低浓度标准曲线的状态下，对极微量的样本定量较为准确。浓度质检24纯度质检NanoDropOD260/OD280：核酸与蛋白的吸收比值OD260/OD230：核酸与糖的吸收比值纯度质检NanoDrop25完整度检测琼脂糖水平凝胶电泳RNA污染完整度检测琼脂糖水平凝胶电泳RNA污染26DNA质检标准浓度c≥100ng/ul总量m

≥2ugOD260/OD280：

1.8-2.0OD260/OD230＞2.0电泳图DNA质检标准浓度c≥100ng/ul电泳图27文库构建为什么要构建文库？基因组必须要经过均一化处理之后，才能被测序仪识别。文库可以告知测序仪从哪个碱基开始识别。必须通过文库进行信号放大。文库构建为什么要构建文库？28文库构建的总原则不能有其他外来物种污染。不能有接头二聚体。保证基因组覆盖完整度。扩增偏好尽量低。单个项目必须保证统一试剂，统一操作！文库构建的总原则不能有其他外来物种污染。29基础文库构建流程STEP1DNA片段化STEP2末端修复加dATPSTEP3连接测序接头STEP4PCR扩增基础文库构建流程STEP1DNA片段化STEP2末端修复加d30DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增打断方法打断范围特点及应用CovarisSystem(AFA)100bp-500bp应用广泛，DNA测序主流打断方法Nebulizer400bp-800bp600bp以上文库构建HydroShear/g-TubeHydroShear2kb以上g-Tube2kb-20kb大片段文库构建Tn5转座酶100bp-8kb自动化文库构建限制性内切酶根据具体情况简化类文库DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增打断方法31DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增32DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增33DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增DNA纯化目的：纯化目的核酸片段，清除影响后续实验的分子污染，保证核酸纯度。纯化方法：1、传统的酚/氯仿抽提优点：适用性强，尤其可以纯化大片段。缺点：酚、氯仿都是对人体有害的物质；耗时长；对操作要求高2、借助某些介质吸附柱离心法：纯度达到80%以上；方便、快捷。磁珠：磁珠表面包被、修饰，捕获特定的DNA片段，分离不用离心，容易集成到生物芯片上，实现样品处理自动化和微型化。3、凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳胶回收、PAGE凝胶电泳等。在电泳后需要切胶回收，应用方法一或方法二。DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增DNA纯34DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增DNA纯化目的：纯化目的核酸片段，清除影响后续实验的分子污染，保证核酸纯度。纯化方法：1、传统的酚/氯仿抽提优点：适用性强，尤其可以纯化大片段。缺点：酚、氯仿都是对人体有害的物质；耗时长；对操作要求高2、借助某些介质：纯度达到80%以上；方便、快捷。磁珠：磁珠表面包被、修饰，捕获特定的DNA片段，分离不用离心，容易集成到生物芯片上，实现样品处理自动化和微型化。3、凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳胶回收、PAGE凝胶电泳等。在电泳后需要切胶回收，应用方法一或方法二。吸附柱离心法DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增DNA纯35DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增吸附柱离心法原理吸附膜主要成分硅胶、纤维，又称硅胶膜、硅胶柱。硅胶是一种多孔性物质，分子中具有硅氧烷的交链结构，而硅氧烷分子含有硅醇基，其含量与其核酸的结合能力有关。在高盐、低PH值条件下，硅胶表面上的硅醇基释放出氢离子，通过高盐溶液中的阳离子与DNA的磷酸基团结合，DNA被吸附在硅胶膜上；相反在低盐、高PH值的条件下就会释放出DNA。纯化三原则：•不能混淆样本•不能污染样本、试剂•省时、省物DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增吸附柱离36DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增不要忘记加乙醇！DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增不要忘记37DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增纯化步骤片段化DNA实验准备结合洗涤空转环吸及晾干洗脱10min50minDNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增纯化步骤38实验准备清理桌面准备试剂及耗材离心管准备及标注：取吸附柱和离心管需用镊子。标注原则：名称要与待纯化样本完全相同，并且纯化后需标注“已纯化”类似字样，以便区分。标注要求：管盖及管壁均标注，且写在磨砂处。实验准备清理桌面39样本结合操作方法：加入5倍体积结合液PB混匀，转入吸附柱中，静置1min操作要求：分别转移样品或者悬空滴加PB尽量一个样本使用1个枪头多次转移时，注意样本间交叉污染切记静置1min！

样本结合操作方法：40过柱及弃废液8000rpm，30sec倒废液：倒前准备吸水纸；切勿伸入废液瓶；沾液时不同样品管切勿使用同一位置。离心力不可过大！×√过柱及弃废液8000rpm，30sec倒废液：倒前准备吸水纸41洗涤操作方法：加入740mlPW溶液8000rpm，30sec倒废液（要求同前）操作要求：

悬空滴加尽量只使用1个枪头枪头一旦触碰样本，立刻弃掉，严禁污染试剂！×√洗涤操作方法：操作要求：枪头一旦触碰样本，立刻弃掉，严禁污染42空转、环吸及晾干操作方法：12000rpm，空转3min环吸后晾干3min操作要求：1.环吸方法：用小枪头对准管壁的余液，旋转枪头吸干余液。2.不可过度晾干！空转、环吸及晾干操作方法：43洗脱操作方法：加入

EB（ElutionBuffer）静置5min（55℃孵育可提高回收率）

12000rpm，2min操作要求：EB加在膜中央，加入后，环、壁上均无液体在弃管前做最后核对，以免串样洗脱操作方法：44为什么要进行末端修复？随机打断后的DNA一般都会产生不规则的末端，无法直接进行测序接头连接，因此需要进行末端修复。为什么要加dATP？为了提高连接效率，所以在测序接头的3’端加1个dTTP，与Insert的dATP互补。DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增为什么要进行末端修复？DNA片段化末端修复加dATP连接测序45DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增基因组DNA打断平端5’端突出3’端突出5’端突出3’端突出DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增基因组D46DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增基因组DNA打断平端5’端突出3’端突出5’端突出3’端突出T4DNA聚合酶T4DNA聚合酶DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增基因组D47DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增已补平DNADNA磷酸化激酶PPAATaq聚合酶磷酸化的目的填补连接缺口，提高连接效率本步骤温控程序25℃30min72℃20minPPDNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增已补平D48DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增Illumina接头Rd1SeqPrimerP5Rd2SeqPrimerIndexP7Y型接头的目的

减少接头自连的可能性！TPDNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增Illu49DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增T4DNA连接酶TPPT连接温控条件22℃1hr连接反应需注意：反应时间不可过长。测序接头要足量。DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增T4D50DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增连接反应后必须纯化的理由去除接头二聚体（128bp）筛选合适的片段大小纯化方法可选电泳+切胶筛选+胶回收2.磁珠纯化并筛选大小DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增连接反应51DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增电泳2%琼脂糖凝胶，100V1.5h同时选择多个片段大小胶回收（Qiagen离心柱法）DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增电泳52DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增电泳的优点1.成本低。2.可同时筛选多个大小。3.筛选范围可控，灵敏。电泳的缺点1.不可自动化。2.小分子在分子迁移过程中易残留。3.DNA紫外灯下暴露易发生损伤。4.操作时间长。DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增电泳的优53DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增磁珠AmpureXPBeads(BeckmanCoulter）DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增磁珠A54DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增磁珠两步结合法筛选DNA片段大小DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增磁珠两步55DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增磁珠的优点1.可自动化，可重复性高。2.操作时间短。3.回收率高。4.可以高效去除小片段。磁珠的缺点1.成本高。2.筛选范围偏宽，不适合片段要求窄的文库构建。3.很难同时筛选多个大小。DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增磁珠的优56DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增PCR扩增P5P5P7P795℃DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增PCR扩57DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增PCR扩增P5P5P7P795℃P5P7P5P7DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增PCR扩58DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增P5P5P7P765℃P5primerP7primerDNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增P5P559DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增P5P5P7P755℃P5primerP7primer72℃DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增P5P560DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增P5P5P7P755℃P5primerP7primer72℃P5P5P7P7Rd1SPRd1SPRd2SPIndexRd2SPIndexDNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增P5P561DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增必须严格控制PCR循环数！过度PCR只会带来差的测序数据！如果文库浓度不够，是不是可以多做几个PCR循环？DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增必须严格62DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增63文库质检一个好的文库应该符合哪些标准？完全没有接头二聚体和引物二聚体。峰型呈正态分布，并在期望范围内。浓度满足上机需要即可，没有特别要求。不可出现过度PCR的大片段。文库质检一个好的文库应该符合哪些标准？64文库质检常见文库2100质检图文库质检常见文库2100质检图65质量差的文库引物二聚体接头二聚体文库过度PCR只占比50%！质量差的文库引物二聚体接头二聚体文库过度PCR只占比50%！66基因组学研究全基因组重测序（WGRS）未知基因组测序（DeNovo）单细胞基因组测序（SingleCell）基因组学研究全基因组重测序（WGRS）67基因组学研究全基因组重测序（WGRS）未知基因组测序（DeNovo）单细胞基因组测序（SingleCell）研究对象：有参考基因组的物种。研究方法：建库：最基本的DNA文库构建方法。测序方案：个体测序一般30X，种群测序一般6X基因组学研究全基因组重测序（WGRS）研究对象：68基因组学研究全基因组重测序（WGRS）未知基因组测序（DeNovo）单细胞基因组测序（SingleCell）研究对象：无参考基因组的物种，物种的种群最好不要过大。研究方法：建库：基本DNA文库，长片段（Mate-Pair)文库，必要时需要构建Fosmid或BAC文库。测序方案：按照文库长度递增。基因组学研究全基因组重测序（WGRS）研究对象：69DeNovo大致流程DeNovo大致流程70基因组学研究全基因组重测序（WGRS）未知基因组测序（DeNovo）单细胞基因组测序（SingleCell）研究对象：主要是人的1个或者几个细胞或者极少量DNA研究方法：建库：单细胞扩增（MALBAC）+基本DNA文库测序方案：全基因组测序30X基因组学研究全基因组重测序（WGRS）研究对象：71为何选择MALBAC？检验方法：采用9对持家基因对扩增产物进行qPCRMALBAC与MDA各做3个生物学重复为何选择MALBAC？检验方法：72靶向区域研究全外显子组测序靶向捕获测序扩增子测序靶向区域研究全外显子组测序73靶向区域研究全外显子组测序（WholeExomeSequencing）靶向捕获测序扩增子测序研究对象：主要是人，Roche芯片现有一些特殊物种。研究方法：建库：基本DNA文库+外显子杂交芯片捕获测序方案：100X靶向区域研究全外显子组测序研究对象：74杂交平台探针携带生物素标记。捕获富集的片段用亲和链霉素磁珠进行筛选。RocheV3.064MbAgilentV554Mb杂交平台探针携带生物素标记。75外显子基本研究策略NatureGenetics，2009外显子基本研究策略NatureGenetics，200976靶向区域研究全外显子组测序靶向捕获测序（TargetSequencing）扩增子测序研究对象：主要是人，捕获用的探针是根据自身需要订制的。研究方法：建库：基本DNA文库+订制探针杂交芯片捕获测序方案：200X以上比外显子测序所需数据量更少，大幅提高测序深度，降低测序成本！靶向区域研究全外显子组测序研究对象：比外显子测序所需数据量更77靶向区域研究全外显子组测序靶向捕获测序扩增子测序（Amplicon）研究对象：主要是人，使用扩增特异性引物扩增目的片段。研究方法：建库：扩增目的区域+DNA建库测序方案：200X以上通量较小，适合几个基因或较少位点的研究。PCR容易引入人为错配，增加分析噪音。靶向区域研究全外显子组测序研究对象：通量较小，适合几个基因或78表观遗传学研究全基因组甲基化测序（BS-Seq）MeDIP-Seq简化甲基化测序（RRBS）表观遗传学研究全基因组甲基化测序（BS-Seq）79表观遗传学研究全基因组甲基化测序（BS-Seq）MeDIP-Seq简化甲基化测序（RRBS）研究对象：主要是人，人源细胞等。研究方法：建库：DNA建库+重亚硫酸盐处理测序方案：30X以上表观遗传学研究全基因组甲基化测序（BS-Seq）研80表观遗传学研究全基因组甲基化测序（BS-Seq）MeDIP-Seq简化甲基化测序（RRBS）研究对象：主要是人，人源细胞等。研究方法：建库：DNA建库+5mC抗体包被磁珠处理测序方案：50X以上表观遗传学研究全基因组甲基化测序（BS-Seq）研究对象：81表观遗传学研究全基因组甲基化测序（BS-Seq）MeDIP-Seq简化甲基化测序（RRBS）研究对象：主要是人，小鼠，大鼠。研究方法：建库：MspI酶切+DNA建库+重亚硫酸盐处理测序方案：50X以上表观遗传学研究全基因组甲基化测序（BS-Seq）研究对象：82免疫组学研究ChIP-Seq（染色质免疫共沉淀测序）

研究对象：主要是人，人源细胞等。研究方法：建库：染色质免疫共沉淀+DNA建库测序方案：50X以上免疫组学研究ChIP-Seq（染色质免疫共沉淀测序）

研究对83转录组学研究mRNA-Seq全转录组测序单细胞转录组组测序转录组学研究mRNA-Seq84转录组学研究mRNA-Seq全转录组测序单细胞转录组组测序研究对象：所有真核生物，没有特别限制的物种。研究方法：建库：mRNA富集+反转录+DNA建库测序方案：100X以上转录组学研究mRNA-Seq研究对象：85转录组学研究mRNA-Seq全转录组测序（去除rRNA，包括原核生物）研究对象：原核生物，人源微生物，人，小鼠，大鼠，植物。研究方法：建库：去除rRNA+反转录+DNA建库测序方案：100X以上转录组学研究mRNA-Seq研究对象：86转录组测序RiboMinus™/Ribo-zeroLifeTech/EpicentreRibo-ZeroORRiboMinus?WO2011/019993PCT/US2010/045437全转录组测序√转录组测序RiboMinus™/Ribo-zeroRibo87转录组学研究mRNA-Seq全转录组测序单细胞转录组组测序研究对象：主要是人，人源细胞。研究方法：建库：SMART技术+DNA建库测序方案：100X以上转录组学研究mRNA-Seq研究对象：88转录表达调控研究sRNA-Seq研究对象：主要为人，小鼠，大鼠。研究方法：建库：小RNA建库技术测序方案：100X以上转录表达调控研究sRNA-Seq研究对象：89转录因子研究RIP-Seq（RNA免疫共沉淀测序）研究对象：主要为人源细胞。研究方法：建库：RIP+RNA反转录+DNA建库测序方案：100X以上转录因子研究RIP-Seq（RNA免疫共沉淀测序）研究对象：90HaveABreak!HaveABreak!91概要常见NGS方案实验原理及流程介绍常见问题解析Hiseq测序仪相关知识及指标概要常见NGS方案实验原理及流程介绍92DNA提取中的常见问题问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。原因1.DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质2.DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应3.DNA中残留有金属离子

解决方案1.重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质2.重新沉淀DNA，让酒精充分挥发3.增加70％乙醇洗涤的次数（2-3次）

DNA提取中的常见问题问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和93DNA提取中的常见问题问题二：DNA降解。原因1.材料不新鲜或反复冻融2.未很好抑制内源核酸酶的活性3.提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断4.外源核酸酶污染

解决方案1.尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融2.液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液3.细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔4.所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌

DNA提取中的常见问题问题二：DNA降解。原因1.材料不新94问题三：DNA量太少DNA提取中的常见问题原因1.实验材料不佳或量少2.破壁或裂解不充分3.沉淀不完全4.洗涤时DNA丢失

解决方案1.尽量选用新鲜（幼嫩）的材料2.动植物要匀浆研磨充分；G＋菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁3.裂解时，时间延长，可过夜4.低温沉淀，延长沉淀时间5.加辅助物，促进沉淀6.洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒DNA提取遇到的问题，大多数都来自于裂解不完全！问题三：DNA量太少DNA提取中的常见问题原因1.实验材料不95文库构建的常见问题DNA片段化问题DNA量过大DNA质量差溶解buffer粘稠度过高Covaris使用不当原因解决每次打断不超过10ug严格执行DNA质检标准使用水或TE溶解DNA循环水位应在8以上循环水温度应在4-8℃开启机器后，需排气30min以上文库构建的常见问题DNA片段化问题DNA量过大原因解决每次打96问题一：打断DNA之后纯化产物浓度过低文库构建的常见问题原因DNA初始定量出错使用Nanodrop进行DNA初始定量。纯化步骤中操作错误。解决方案1.使用Qubit定量样本前，同一项目样本必须重做标准品。2.浓度过高的样本，需要稀释后定量。3.检查Qubit标准品的检测值是否在正常范围。4.初始DNA定量必须使用荧光定量方法(Qubit/Picogreen/qPCR)5.PW液在使用前没有加乙醇。6.洗涤液和结合液混淆。问题一：打断DNA之后纯化产物浓度过低文库构建的常见问题原因97问题二：连接测序接头后纯化无产物文库构建的常见问题原因磁珠使用不当。切胶纯化时，操作失误。解决方案1.磁珠使用前必须放置在室温下预热半小时以上。2.80%乙醇必须新鲜配置。3.磁珠洗脱液一定要使用EB或者RSB，不可用水。4.胶块没有完全溶解。5.PW液没有加乙醇就使用。6.PW和PB混淆。7.磁珠干燥时间过长。问题二：连接测序接头后纯化无产物文库构建的常见问题原因磁珠使98问题三：构建出的文库有接头二聚体。文库构建的常见问题原因连接反应时间过长。连接反应用的接头量过大。连接反应时DNA量已经很少。跑胶进行片段筛选前没有用磁珠纯化。磁珠纯化比例错误。解决方案1.连接反应时间必须严格控制。2.连接反应必须终止，可以采用热终止或EDTA。3.接头量必须严格控制，如果DNA量过少，必须减少接头用量。4.跑胶前必须先用磁珠1:1进行纯化。5.磁珠纯化比例为DNA：磁珠=1:1或者可以适当减少磁珠用量，切勿增大！问题三：构建出的文库有接头二聚体。文库构建的常见问题原因连接99文库构建的常见问题打断的DNA300bp文库740bp问题四：连接产生了嵌合体(crossmapping)根本原因：连接导致！连接温度过高。连接反应时间过长。接头过少。某些AT极端偏好的物种。解决方法：严格控制连接反应时间和温度。定期检查接头浓度，接头一定要足量。打断DNA后增加筛选大小步骤。采取一些有针对性的建库手段。文库构建的常见问题打断的DNA300bp文库740bp问题四100问题四：文库后不正常的大片段？文库构建的常见问题原因：连接反应时间过长。PCR循环过多！磁珠筛选时操作不当。解决方法：严格控制连接反应时间和温度。PCR循环一定要严格遵守操作规则。磁力架磁力不足，磁珠容易掉落。反应产物过多，磁珠偏少。问题四：文库后不正常的大片段？文库构建的常见问题原因：解决方101一些较差的文库示例操作不当是导致文库构建失败最根本的原因！一些较差的文库示例操作不当是导致文库构建失败最根本的原因！102概要常见NGS方案实验原理及流程介绍常见问题解析Hiseq测序仪相关知识及指标概要常见NGS方案实验原理及流程介绍103Solexa测序原理Solexa测序原理104准备DNA片段两端接上adapters将DNA片段通过adapter锚定在芯片上循环扩增DNA片段成“DNA簇”20micronsSequenceCluster形成准备DNA片段两端接上adapters将DNA片段通过ad105可逆终止反应

ReversibleTerminatorChemistry

OPPPHNNOO荧光基团3’保护基团Nextcycle掺入检测去保护基团去荧光基团ODNAHNNOO3’O5’游离3‘末端XOH4种标记过的核苷酸测序可逆终止反应

ReversibleTerminatorC106Sequencing-by-Synthesis(SBS)

5’GTCAGTCAGTCAGT3’5’CAGTCATCACCTAGCGTA

掺入一个碱基Cycle1: 加入反应体系

移除其他未掺入的核苷酸

信号检测Cycle2-n:加入反应体系，循环cycle11、每轮测序反应加入四种带有荧光标记的dNTP，末端带有可以被去除的保护基团2、每轮反应只能整合一个核苷酸，仪器读取相应的荧光信号3、信号读取结束，用化学方法去除阻断基团和荧光基团，进行下一轮测序反应测序Sequencing-by-Synthesis(SBS)

107123789456TTTTTTT

G

T…T

G

C

T

A

C

G

A

T…根据每个DNA簇每轮反应读取的荧光信号序列，转换成相应的DNA序列通过荧光信号分析核苷酸序列测序123789456TTTTTTTGT…T108测序种类Single-ReadSequencing(SR)测序种类Single-ReadSequencing(SR)109测序种类Single-ReadSequencing(SR)测序种类Single-ReadSequencing(SR)110测序种类Single-ReadSequencing(SR)Paired-EndSequencing(PE)测序种类Single-ReadSequencing(SR)111测序种类Single-ReadSequencing(SR)Paired-EndSequencing(PE)测序种类Single-ReadSequencing(SR)112测序种类Single-ReadSequencing(SR)Paired-EndSequencing(PE)IndexSequencing(PE)测序种类Single-ReadSequencing(SR)113测序种类Single-ReadSequencing(SR)Paired-EndSequencing(PE)IndexSequencing(PE)测序种类Single-ReadSequencing(SR)114测序种类Single-ReadSequencing(SR)Paired-EndSequencing(PE)IndexSequencing(PE)√测序种类Single-ReadSequencing(SR)115Hiseq2500Hiseq25001161个flowcell8个lane2个flowcell1个flowcell2个flowcell117Hiseq2500的关键系统光路系统(OpticalSystem)流路系统(FluidicsSystem)温控系统(TemperatureControlSystem)Hiseq2500的关键系统光路系统(OpticalSys118光路系统红色激光：A，C绿色激光：G，T其中G碱基信号最弱光路系统红色激光：A，C119常见的光路问题Autotilt正常异常常见的光路问题Autotilt正常异常120Focus常见的光路问题正常异常Focus常见的光路问题正常异常121流路系统流路系统122常见的流路问题气泡异常常见的流路问题气泡异常123温控系统Flowcell温控Hiseq冷却系统试剂温控温控系统Flowcell温控Hiseq冷却系统试剂温控124常见的温控问题常见的温控问题125如何监控1个run？SAV（SequencingAnalysisViewer)如何监控1个run？SAV（SequencingAnaly126SAV所需文件InterOp（文件夹）RunInfo.xmlrunParameters.xmlSAV所需文件InterOp（文件夹）127常见NGS方案实验流程及常见问题解析-讲义课件128常见NGS方案实验流程及常见问题解析-讲义课件129常见NGS方案实验流程及常见问题解析-讲义课件130测序质量差常见因素汇总文库质量差！测序信号低激光器问题滤光片偏移前4个碱基不均匀测序噪音高流路脏温控问题测序质量差常见因素汇总文库质量差！测序信号低激光器问题滤光片131QuestionQuestion132常见NGS方案实验流程

及问题解析常见NGS方案实验流程

及问题解析概要常见NGS方案实验原理及流程介绍常见问题解析Hiseq测序仪相关知识及指标概要常见NGS方案实验原理及流程介绍134概要常见NGS方案实验原理及流程介绍常见问题解析Hiseq测序仪相关知识及指标概要常见NGS方案实验原理及流程介绍135基因组学研究基因组重测序未知基因组测序单细胞基因组测序表观遗传学研究全基因组甲基化测序MeDIP-Seq简化甲基化测序免疫组学研究ChIP-Seq靶向区域研究全外显子组测序靶向捕获测序扩增子测序转录组学研究mRNA-Seq全转录组测序单细胞转录组组测序转录表达调控研究sRNA-Seq转录因子研究RIP-SeqDNA测序DNA文库cDNA测序基因组学研究表观遗传学研究免疫组学研究靶向区域研究转录组学研136NGS基本流程STEP1样本前处理STEP2文库构建STEP3上机测序STEP4生物信息分析NGS基本流程STEP1样本前处理STEP2文库构建STEP137样本前处理样本前处理都做些什么？核酸提取（DNA/RNA)样本类型有哪些？人，动物的血液及器官组织等。植物（根茎叶，胚芽，种子等）。微生物（细菌，真菌）。样本前处理样本前处理都做些什么？138DNA提取DNA提取的基本原理DNA溶于水，在钠盐比在水中的溶解度较大。但不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般有机溶剂。萃取沉淀DNA提取DNA提取的基本原理萃取139DNA在生物体中的存在形式DNA在细胞中常以核酸—蛋白复合体（核蛋白）形式存在。DNA在生物体中的存在形式DNA在细胞中常以核酸—蛋白复合体140DNA提取基本流程细胞破碎杂质去除沉淀DNA溶解DNADNA提取基本流程细胞破碎杂质去除沉淀DNA溶解DNA141DNA提取总原则保证核酸一级结构的完整性；排除其它分子的污染。DNA提取总原则142DNA提取方法概述人，动物组织（SDS法）人，动物全血，体液等（离心柱法）植物组织提取（CTAB法）质粒DNA（碱裂解法/离心柱法）线粒体/叶绿体DNA（SDS差速离心法）DNA提取方法概述人，动物组织（SDS法）143DNA提取方法概述人，动物组织（SDS法）人，动物全血，体液等（离心柱法）植物组织提取（CTAB法）质粒DNA（碱裂解法/离心柱法）线粒体/叶绿体DNA（SDS差速离心法）DNA提取方法概述人，动物组织（SDS法）144LysisBuffer样本破碎细胞裂解56℃离心取上清25:24:1酚氯仿异戊醇LysisBuffer离心取上清24:1氯仿异戊醇离心取上清乙醇异丙醇70%乙醇离心离心溶解DNALysisBuffer样本细胞56℃离心取上清25:24:145LysisBuffer（裂解缓冲液）组分Tris-HCl(pH8.0)EDTA(pH8.0)SDSProteinaseK终浓度100mM50mM1%(w/v)加样本前加入200ug/ml加样本前加入Tris-HCl(pH8.0)：提供碱性反应条件，防止DNA酸解。EDTA(pH8.0)：大分子螯合二价阳离子，抑制DNase活性。SDS：去垢剂，破坏细胞膜，解离核蛋白，使蛋白质变性。ProteinaseK：广谱蛋白酶，在SDS，EDTA存在下活性很高，高效催化蛋白质降解成多肽或氨基酸，释放DNA。LysisBuffer（裂解缓冲液）组分Tris-HClE146样本破碎尽量选取新鲜的组织样本，若是冷冻样本，避免反复冻融。研磨的整个过程必须保持低温。佩带棉手套后必须佩带一层PE手套，防止液氮冻伤！样本破碎尽量选取新鲜的组织样本，若是冷冻样本，避免反复冻融。147细胞裂解裂解需充分材料适量，过多的材料会导致裂解不充分，从而影响后续DNA得率低，质量差。消化过程中，定时轻轻震荡。温度55℃-60℃都可以。必要时，可消化过夜。细胞裂解裂解需充分148去除蛋白质酚:氯仿:异戊醇（25:24:1V/V）溶液酚：（被水或Tris-HCl8.0饱和的酚）强烈的蛋白质变性剂，在初步纯化时，可有效的使蛋白质变性从而去除。异戊醇：消泡剂，帮助有机分相。去除蛋白质酚:氯仿:异戊醇（25:24:1V/V）溶液149去除其他有机杂质氯仿：异戊醇（24:1V/V）氯仿：1.高效蛋白质变性剂，具有高效溶脂性，可以有效去除脂类。2.本步骤中的氯仿可以萃取微量溶解在水相中的酚。异戊醇：消泡剂，帮助有机分相。去除其他有机杂质氯仿：异戊醇（24:1V/V）150DNA沉淀完整的基因组DNA（gDNA）片段大，可以直接使用2-3倍体积乙醇或0.6-1倍体积异丙醇常温加入并颠倒数次，即可看见成团白色沉淀。降解或片段偏小的DNA，可用预冷的乙醇或异丙醇进行沉淀，必要时可放置-20℃沉淀过夜。DNA沉淀完整的基因组DNA（gDNA）片段大，可以直接使用151盐离子去除70%乙醇DNA不溶于乙醇，盐离子溶解于水。盐离子去除70%乙醇152DNA干燥本步骤必须进行！乙醇残留会抑制PCR反应，酶反应等等。干燥时间一般控制在2-5分钟。不能过度干燥，否则沉淀很难溶解！DNA干燥本步骤必须进行！153DNA溶解长期保存DNA，建议用TE溶解，EDTA可抑制DNase活性。若需要立刻进行建库反应，可用水或Tris-HCl（pH8.0）溶解。如果过度干燥导致沉淀溶解困难，可放置4℃轻度震荡过夜溶解。DNA溶解长期保存DNA，建议用TE溶解，EDTA可抑制DN154DNA质检质检内容：浓度、纯度、完整性质检所用方法：Qubit2.0（荧光定量双链DNA技术）

Nanodrop分光光度技术（OD）DNA水平凝胶电泳DNA质检155浓度质检NanoDrop也可以测浓度，为什么一定要用Qubit？NanoDrop基于核酸紫外吸收原理，若有单链DNA，RNA或部分蛋白，脂类也会影响紫外吸收，导致定量偏高。Qubit使用的荧光染料可以特异结合双链DNA，提高定量准确性。DNA纯度越高，NanoDrop定量结果与Qubit定量结果的差异就越小。Qubit与PicoGreen有什么区别？都使用荧光染料定量双链DNA，从使用原理上没有根本性区别。PicoGreen可实现自动化，使用酶标仪进行定量。两者的定量范围相同，但Picogreen在使用低浓度标准曲线的状态下，对极微量的样本定量较为准确。浓度质检156纯度质检NanoDropOD260/OD280：核酸与蛋白的吸收比值OD260/OD230：核酸与糖的吸收比值纯度质检NanoDrop157完整度检测琼脂糖水平凝胶电泳RNA污染完整度检测琼脂糖水平凝胶电泳RNA污染158DNA质检标准浓度c≥100ng/ul总量m

≥2ugOD260/OD280：

1.8-2.0OD260/OD230＞2.0电泳图DNA质检标准浓度c≥100ng/ul电泳图159文库构建为什么要构建文库？基因组必须要经过均一化处理之后，才能被测序仪识别。文库可以告知测序仪从哪个碱基开始识别。必须通过文库进行信号放大。文库构建为什么要构建文库？160文库构建的总原则不能有其他外来物种污染。不能有接头二聚体。保证基因组覆盖完整度。扩增偏好尽量低。单个项目必须保证统一试剂，统一操作！文库构建的总原则不能有其他外来物种污染。161基础文库构建流程STEP1DNA片段化STEP2末端修复加dATPSTEP3连接测序接头STEP4PCR扩增基础文库构建流程STEP1DNA片段化STEP2末端修复加d162DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增打断方法打断范围特点及应用CovarisSystem(AFA)100bp-500bp应用广泛，DNA测序主流打断方法Nebulizer400bp-800bp600bp以上文库构建HydroShear/g-TubeHydroShear2kb以上g-Tube2kb-20kb大片段文库构建Tn5转座酶100bp-8kb自动化文库构建限制性内切酶根据具体情况简化类文库DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增打断方法163DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增164DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增165DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增DNA纯化目的：纯化目的核酸片段，清除影响后续实验的分子污染，保证核酸纯度。纯化方法：1、传统的酚/氯仿抽提优点：适用性强，尤其可以纯化大片段。缺点：酚、氯仿都是对人体有害的物质；耗时长；对操作要求高2、借助某些介质吸附柱离心法：纯度达到80%以上；方便、快捷。磁珠：磁珠表面包被、修饰，捕获特定的DNA片段，分离不用离心，容易集成到生物芯片上，实现样品处理自动化和微型化。3、凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳胶回收、PAGE凝胶电泳等。在电泳后需要切胶回收，应用方法一或方法二。DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增DNA纯166DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增DNA纯化目的：纯化目的核酸片段，清除影响后续实验的分子污染，保证核酸纯度。纯化方法：1、传统的酚/氯仿抽提优点：适用性强，尤其可以纯化大片段。缺点：酚、氯仿都是对人体有害的物质；耗时长；对操作要求高2、借助某些介质：纯度达到80%以上；方便、快捷。磁珠：磁珠表面包被、修饰，捕获特定的DNA片段，分离不用离心，容易集成到生物芯片上，实现样品处理自动化和微型化。3、凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳胶回收、PAGE凝胶电泳等。在电泳后需要切胶回收，应用方法一或方法二。吸附柱离心法DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增DNA纯167DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增吸附柱离心法原理吸附膜主要成分硅胶、纤维，又称硅胶膜、硅胶柱。硅胶是一种多孔性物质，分子中具有硅氧烷的交链结构，而硅氧烷分子含有硅醇基，其含量与其核酸的结合能力有关。在高盐、低PH值条件下，硅胶表面上的硅醇基释放出氢离子，通过高盐溶液中的阳离子与DNA的磷酸基团结合，DNA被吸附在硅胶膜上；相反在低盐、高PH值的条件下就会释放出DNA。纯化三原则：•不能混淆样本•不能污染样本、试剂•省时、省物DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增吸附柱离168DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增不要忘记加乙醇！DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增不要忘记169DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增纯化步骤片段化DNA实验准备结合洗涤空转环吸及晾干洗脱10min50minDNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增纯化步骤170实验准备清理桌面准备试剂及耗材离心管准备及标注：取吸附柱和离心管需用镊子。标注原则：名称要与待纯化样本完全相同，并且纯化后需标注“已纯化”类似字样，以便区分。标注要求：管盖及管壁均标注，且写在磨砂处。实验准备清理桌面171样本结合操作方法：加入5倍体积结合液PB混匀，转入吸附柱中，静置1min操作要求：分别转移样品或者悬空滴加PB尽量一个样本使用1个枪头多次转移时，注意样本间交叉污染切记静置1min！

样本结合操作方法：172过柱及弃废液8000rpm，30sec倒废液：倒前准备吸水纸；切勿伸入废液瓶；沾液时不同样品管切勿使用同一位置。离心力不可过大！×√过柱及弃废液8000rpm，30sec倒废液：倒前准备吸水纸173洗涤操作方法：加入740mlPW溶液8000rpm，30sec倒废液（要求同前）操作要求：

悬空滴加尽量只使用1个枪头枪头一旦触碰样本，立刻弃掉，严禁污染试剂！×√洗涤操作方法：操作要求：枪头一旦触碰样本，立刻弃掉，严禁污染174空转、环吸及晾干操作方法：12000rpm，空转3min环吸后晾干3min操作要求：1.环吸方法：用小枪头对准管壁的余液，旋转枪头吸干余液。2.不可过度晾干！空转、环吸及晾干操作方法：175洗脱操作方法：加入

EB（ElutionBuffer）静置5min（55℃孵育可提高回收率）

12000rpm，2min操作要求：EB加在膜中央，加入后，环、壁上均无液体在弃管前做最后核对，以免串样洗脱操作方法：176为什么要进行末端修复？随机打断后的DNA一般都会产生不规则的末端，无法直接进行测序接头连接，因此需要进行末端修复。为什么要加dATP？为了提高连接效率，所以在测序接头的3’端加1个dTTP，与Insert的dATP互补。DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增为什么要进行末端修复？DNA片段化末端修复加dATP连接测序177DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增基因组DNA打断平端5’端突出3’端突出5’端突出3’端突出DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增基因组D178DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增基因组DNA打断平端5’端突出3’端突出5’端突出3’端突出T4DNA聚合酶T4DNA聚合酶DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增基因组D179DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增已补平DNADNA磷酸化激酶PPAATaq聚合酶磷酸化的目的填补连接缺口，提高连接效率本步骤温控程序25℃30min72℃20minPPDNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增已补平D180DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增Illumina接头Rd1SeqPrimerP5Rd2SeqPrimerIndexP7Y型接头的目的

减少接头自连的可能性！TPDNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增Illu181DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增T4DNA连接酶TPPT连接温控条件22℃1hr连接反应需注意：反应时间不可过长。测序接头要足量。DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增T4D182DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增连接反应后必须纯化的理由去除接头二聚体（128bp）筛选合适的片段大小纯化方法可选电泳+切胶筛选+胶回收2.磁珠纯化并筛选大小DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增连接反应183DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增电泳2%琼脂糖凝胶，100V1.5h同时选择多个片段大小胶回收（Qiagen离心柱法）DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增电泳184DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增电泳的优点1.成本低。2.可同时筛选多个大小。3.筛选范围可控，灵敏。电泳的缺点1.不可自动化。2.小分子在分子迁移过程中易残留。3.DNA紫外灯下暴露易发生损伤。4.操作时间长。DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增电泳的优185DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增磁珠AmpureXPBeads(BeckmanCoulter）DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增磁珠A186DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增磁珠两步结合法筛选DNA片段大小DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增磁珠两步187DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增磁珠的优点1.可自动化，可重复性高。2.操作时间短。3.回收率高。4.可以高效去除小片段。磁珠的缺点1.成本高。2.筛选范围偏宽，不适合片段要求窄的文库构建。3.很难同时筛选多个大小。DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增磁珠的优188DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增PCR扩增P5P5P7P795℃DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增PCR扩189DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增PCR扩增P5P5P7P795℃P5P7P5P7DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增PCR扩190DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增P5P5P7P765℃P5primerP7primerDNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增P5P5191DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增P5P5P7P755℃P5primerP7primer72℃DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增P5P5192DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增P5P5P7P755℃P5primerP7primer72℃P5P5P7P7Rd1SPRd1SPRd2SPIndexRd2SPIndexDNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增P5P5193DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增必须严格控制PCR循环数！过度PCR只会带来差的测序数据！如果文库浓度不够，是不是可以多做几个PCR循环？DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增必须严格194DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增DNA片段化末端修复加dATP连接测序接头PCR扩增195文库质检一个好的文库应该符合哪些标准？完全没有接头二聚体和引物二聚体。峰型呈正态分布，并在期望范围内。浓度满足上机需要即可，没有特别要求。不可出现过度PCR的大片段。文库质检一个好的文库应该符合哪些标准？196文库质检常见文库2100质检图文库质检常见文库2100质检图197质量差的文库引物二聚体接头二聚体文库过度PCR只占比50%！质量差的文库引物二聚体接头二聚体文库过度PCR只占比50%！198基因组学研究全基因组重测序（WGRS）未知基因组测序（DeNovo）单细胞基因组测序（SingleCell）基因组学研究全基因组重测序（WGRS）199基因组学研究全基因组重测序（WGRS）未知基因组测序（DeNovo）单细胞基因组测序（SingleCell）研究对象：有参考基因组的物种。研究方法：建库：最基本的DNA文库构建方法。测序方案：个体测序一般30X，种群测序一般6X基因组学研究全基因组重测序（WGRS）研究对象：200基因组学研究全基因组重测序（WGRS）未知基因组测序（DeNovo）单细胞基因组测序（SingleCell）研究对象：无参考基因组的物种，物种的种群最好不要过大。研究方法：建库：基本DNA文库，长片段（Mate-Pair)文库，必要时需要构建Fosmid或BAC文库。测序方案：按照文库长度递增。基因组学研究全基因组重测序（WGRS）研究对象：201DeNovo大致流程DeNovo大致流程202基因组学研究全基因组重测序（WGRS）未知基因组测序（DeNovo）单细胞基因组测序（SingleCell）研究对象：主要是人的1个或者几个细胞或者极少量DNA研究方法：建库：单细胞扩增（MALBAC）+基本DNA文库测序方案：全基因组测序30X基因组学研究全基因组重测序（WGRS）研究对象：203为何选择MALBAC？检验方法：采用9对持家基因对扩增产物进行qPCRMALBAC与MDA各做3个生物学重复为何选择MALBAC？检验方法：204靶向区域研究全外显子组测序靶向捕获测序扩增子测序靶向区域研究全外显子组测序205靶向区域研究全外显子组测序（WholeExomeSequencing）靶向捕获测序扩增子测序研究对象：主要是人，Roche芯片现有一些特殊物种。研究方法：建库：基本DNA文库+外显子杂交芯片捕获测序方案：100X靶向区域研究全外显子组测序研究对象：206杂交平台探针携带生物素标记。捕获富集的片段用亲和链霉素磁珠进行筛选。RocheV3.064MbAgilentV554Mb杂交平台探针携带生物素标记。207外显子基本研究策略NatureGenetics，2009外显子基本研究策略NatureGenetics，2009208靶向区域研究全外显子组测序靶向捕获测序（TargetSequencing）扩增子测序研究对象：主要是人，捕获用的探针是根据自身需要订制的。研究方法：建库：基本DNA文库+订制探针杂交芯片捕获测序方案：200X以上比外显子测序所需数据量更少，大幅提高测序深度，降低测序成本！靶向区域研究全外显子组测序研究对象：比外显子测序所需数据量更209靶向区域研究全外显子组测序靶向捕获测序扩增子测序（Amplicon）研究对象：主要是人，使用扩增特异性引物扩增目的片段。研究方法：建库：扩增目的区域+DNA建库测序方案：200X以上通量较小，适合几个基因或较少位点的研究。PCR容易引入人为错配，增加分析噪音。靶向区域研究全外显子组测序研究对象：通量较小，适合几个基因或210表观遗传学研究全基因组甲基化测序（BS-Seq）MeDIP-Seq简化甲基化测序（RRBS）表观遗传学研究全基因组甲基化测序（BS-Seq）211表观遗传学研究全基因组甲基化测序（BS-Seq）MeDIP-Seq简化甲基化测序（RRBS）研究对象：主要是人，人源细胞等。研究方法：建库：DNA建库+重亚硫酸盐处理测序方案：30X以上表观遗传学研究全基因组甲基化测序（BS-Seq）研212表观遗传学研究全基因组甲基化测序（BS-Seq）MeDIP-Seq简化甲基化测序（RRBS）研究对象：主要是人，人源细胞等。研究方法：建库：DNA建库+5mC抗体包被磁珠处理测序方案：50X以上表观遗传学研究全基因组甲基化测序（BS-Seq）研究对象：213表观遗传学研究全基因组甲基化测序（BS-Seq）MeDIP-Seq简化甲基化测序（RRBS）研究对象：主要是人，小鼠，大鼠。研究方