第二章微生物药物生物合成与调控第一节(发酵工艺学夏焕章第三)3

学习目标熟悉微生物次级代谢产物的特点和次级代谢产物生物合成的控制。掌握微生物次级代谢产物的生物合成过程及其调节机制。了解微生物药物的生物合成及其调节机制的指导意义。第一页，共二十五页。前言各种代谢反应和代谢途径错综复杂：

代谢网络（metabolicnetwork）

多代谢作用（pleometabolism）

代谢栅栏（metabolicgrid）生物合成既涉及初级代谢又涉及次级代谢微生物药物（这里指微生物次级代谢产物）的合成是在微生物体内酶催化下将小分子物质逐步合成分子量较大产物的生化反应过程。第二页，共二十五页。生物合成过程中，严格地受到微生物细胞内存在的代谢调节，以及外界环境条件的调节。人们利用已知或可能存在的生物合成途径及其代谢调控理论，已成功地解决了微生物药物生产过程中菌种产量、发酵工艺、产品质量等关键问题。微生物药物的生物合成及其调控理论在微生物药物的生产中起着非常重要的指导作用。第三页，共二十五页。学习内容第一节微生物代谢调节（3学时）第二节次级代谢与次级代谢产物（1学时）第三节次级代谢产物的生物合成（2学时）第四节次级代谢产物生物合成的调节与控制（2学时）第四页，共二十五页。第一节微生物代谢调节微生物体内存在着严密、精确、灵敏的代谢调节体系。这种自我调节作用使细胞经济有效地利用营养物质与能量，合理地进行各种代谢活动，以适应微生物自身的正常生长繁殖和外界环境的变化，达到微生物代谢活动和外界环境高度统一。微生物代谢调节机制复杂，具有多系统、多层次特点，但主要通过控制酶来实现，即酶合成的调节（诱导和阻遏）和酶活性的调节（激活或抑制）。研究微生物代谢调节的实际意义在于打破微生物原有的代谢调控系统，过量积累目标产物，提高生产效率。第五页，共二十五页。本节学习内容一、代谢调节的部位二、酶活性调节三、酶合成调节四、代谢调控

第六页，共二十五页。四、代谢调控

掌握微生物代谢调节、调节方式及其调节的分子机制，就可以人为地对微生物代谢过程、代谢途径、代谢产物等方面进行调节控制。如提供较多的底物、诱导物、前体物、降低终产物浓度或移走终产物、阻断支路途径来到达目标产物的过量合成。微生物代谢调节控制方法主要有以下4个方面。第七页，共二十五页。

产能代谢控制：能荷调节

细胞渗透性调控菌种遗传特性改变发酵工艺条件的控制营养缺陷型渗漏缺陷型解除反馈调节突变株解除分解代谢产物阻遏突变株组成型突变株各种抗性突变株增加有关基因数量的工程菌株控制培养基成分控制发酵条件添加前体添加诱导剂发酵与分离过程耦合第八页，共二十五页。

能荷（energycharge）即衡量细胞（或线粒体）能量状态的参数。它

是产生或者利用ATP代谢途径的主要调节因素。（一）产能代谢控制：能荷调节能荷=（[ATP]+0.5[ADP]）/（[ATP]+[ADP]+[AMP]）

能荷调节也称腺苷酸调节，系指细胞通过改变ATP、ADP、AMP三者

（它们所含能荷依次递减）比例来调节其代谢活动。

能荷数值在0-1之间：

全部为AMP时，能荷值为0；

全部为ATP时，能荷值为1；

全部为ADP时，能荷值为0.5。第九页，共二十五页。ATP合成的酶系统：磷酸果糖激酶（PFK）

异柠檬酸脱氢酶（ID）

柠檬酸合成酶等ATP消耗的酶系统：柠檬酸裂解酶

磷酸核糖焦磷酸合成酶等

能荷即可调节形成ATP的分解代谢酶类的活性，也可调节利用ATP的生物

合成酶类的活性。ID、PFK等分解酶类受高能荷的抑制；

丙酮酸羧化酶、乙酰CoA羧化酶、AK等高能荷下被活化。第十页，共二十五页。图2-32受能荷调节的酶系反应速度0.85曲线R代表ATP合成的酶系统能荷RU曲线U代表ATP消耗的酶系统1.0

能荷即可调节形成ATP的分解代谢酶类的活性，也可调节利用ATP的生物合成酶类的活性。

当能荷在0.75以上时，ATP合成酶系受到抑制，合成ATP的酶系活性迅速下降，而消耗ATP的酶系活性急速上升。呈抑制与活化的中间状态的能荷大约是0.85，此时两种酶系到达平衡。第十一页，共二十五页。

将ATP视为糖分解代谢的终产物，当ATP过量时对糖的分解代谢途径具

有反馈抑制作用，而当ATP分解为ADP和AMP时上述反馈抑制被解除。

巴斯德效应（Pasteureffect）是能荷调节的一个好的实例。

巴斯德在研究酵母的酒精发酵时发现，在通氧的情况下，由于进行呼吸

作用，酒精产量大大下降，糖的消耗速度也减慢，这种有氧呼吸抑制发

酵的作用被后人称之为巴斯德效应。第十二页，共二十五页。

细胞渗透性调控可分为细胞膜调控与细胞壁调控两类。（二）细胞渗透性调控

通过改变细胞渗透性，可使细胞内代谢产物迅速渗透到细胞

外，消除反馈控制，方便产物分离，有利于提高发酵产量。

增加细胞壁或细胞膜的通透性，对某些胞外酶的分泌也有一

定的作用，如在里氏木霉发酵过程中加入吐温80（Tween80），可以提高纤维素酶的产量。第十三页，共二十五页。1.限制培养基中生物素浓度在1～5mg/L，这样可以控制细胞

膜中脂质的合成，从而控制代谢物产量。如谷氨酸发酵。提高细胞渗透性的几种方法2.通过诱变育种的方法，筛选细胞透性突变株。

如生物素营养缺陷型、油酸营养缺陷型、甘油营养缺陷型等。3.添加表面活性剂或脂溶剂如棕榈酸（C18）、十七烷酸

（C17）、硬脂酸（C16）、吐温80等，将脂类从细胞壁中溶

解出来，使细胞壁疏松，通透性增加。第十四页，共二十五页。4.添加作用于细胞膜和细胞壁的物质。如缬氨霉素和短杆菌肽（影响细胞膜）；

青霉素、头孢菌素、D-环丝氨酸、磷霉素（影响细胞壁）。5.控制Mn2+、Zn2+的浓度，干扰细胞膜或细胞壁的形成。曾获得细胞膜透性改变的青霉素高产菌株，摄取无机硫酸盐

的能力要比低产菌株增加2～3倍。举例第十五页，共二十五页。

谷氨酸发酵加入青霉素：阻碍了细胞壁的完全合成，在细胞内渗透压比环境渗透压高得多的情况下，没有完全合成的细胞壁无法使细胞保持原来的体积，细胞膨胀伸长，表面积增大，从而使膜脂质双分子层的分子密度下降，增加了膜对某些化学物质的通透性。加入青霉素可促进谷氨酸分泌胞外，降低胞内谷氨酸浓度，

解除谷氨酸引起的反馈调节，导致谷氨酸高产。举例第十六页，共二十五页。通过诱变剂处理、细胞融合及基因操作技术使菌种遗传物质发生改变，获得各种突变株，从根本上打破微生物原有的代谢调节机制，积累目标产物，为生产提供高产高质量菌种。（三）菌种遗传特性改变营养缺陷型渗漏缺陷型解除反馈调节突变株解除分解代谢产物阻遏突变株组成型突变株各种抗性突变株增加有关基因数量的工程菌株遗传特性改变的菌株：第十七页，共二十五页。举例

棒杆菌素（carynecin）是氯霉素的类似物，抗氯霉素的解烃棒杆菌（C.hydrocarbaclastus）突变体比亲本产生的棒杆菌素要高出3倍。

衣霉素抑制细胞膜糖蛋白的合成，可改变细胞的分泌能力，有助于胞内物质分泌到胞外。筛选枯草芽孢杆菌的衣霉素抗性突变株，使α-淀粉酶的产量比亲本提高了5倍。在大肠埃希菌中引入一个携带β-半乳糖苷酶的质粒后，可以增加3倍的β-半乳糖苷酶产量。第十八页，共二十五页。Ganeana等将与淀粉酶产量有关的调节基因，通过逐步转化的方法，组入到同一菌株的染色体上，从而构建得到一个高产菌株N2T26，30℃培养72h，α-淀粉酶产量高达25000U/mL，比原始菌株提高2000倍。举例第十九页，共二十五页。（四）发酵工艺条件的控制

控制培养基成分

控制发酵条件

添加前体

添加诱导剂

发酵与分离过程耦合第二十页，共二十五页。发酵工艺条件的控制——控制培养基成分

避免和减少使用易引起分解代谢产物阻遏的营养成分如葡萄糖，硫酸铵等。

适量的速效和迟效碳源、氮源的配比。

采取补料工艺。

根据菌种遗传背景控制某种物质加入的浓度。如生物素、氨基酸、表面活性剂、抗生素、结构类似物等。第二十一页，共二十五页。发酵工艺条件的控制——控制培养基成分

采用葡萄糖和乳糖为混合碳源

生长停止后限量流加葡萄糖青霉素发酵糖的缓慢利用是青霉素合成的关键因素。举例第二十二页，共二十五页。发酵工艺条件的控制——控制发酵条件

同一种微生物在同样的培养基中进行培养时，只要控制不同的发酵条件（pH、温度、溶解氧等），就可能获得不同的代谢产物。

控制不同的发酵条件，实际上是影响微生物自身的代谢调节系统而改变其代谢方向，使之按人们所需要的方向进行，进而达到获得高浓度积累所需要产物的目标。30℃以下合成金霉素增多；35℃时只产生四环素。金霉素链霉菌：第二十三页，共二十五页。举例谷氨酸发酵控制通气：乳酸或琥珀酸谷氨酸适量不足NH4+：α-酮戊二酸谷氨酸适量不足谷氨酰胺适量过量pH：谷氨酰胺