单基因病诊断课件

遗传病的诊断(DiagnosisofHereditaryDisease)可以分为产前诊断、症状前诊断和现症病人诊断三种类型。遗传病的诊断是开展遗传咨询和防治工作的基础。第1页/共57页遗传病的诊断(DiagnosisofHeredita1遗传病的诊断方法普遍性诊断原则是指与一般疾病相同的诊断方法，即通过对病史、症状、体症、实验室检查和其他诊断技术所获得的资料进行归纳分析，同时排除拟诊疾病，然后确立诊断。遗传学的特殊诊断主要是指染色体检查、性染色质检查、特异性酶和蛋白质以及代谢中间产物的生化分析、DNA\RNA以及家系分析、皮肤纹理分析、携带者的检出等等。第2页/共57页遗传病的诊断方法普遍性诊断原则是指与一般疾病相同的诊断2一病史、家族史和体症

1.病史由于遗传病多有家族聚集现象，所以病史的采集的准确性非常重要。除关注一般病史外，主要着重于患者的家族史、婚姻史和生育史。第3页/共57页一病史、家族史和体症

1.病史由于遗传病多有家族3(1)家族史

2.家族史采集家族史时应该特别注意因患者或代述人由于文化程度、记忆能力、思维能力、判断能力以及精神状态而使症状、体症的描述不够准确、全面，或者因为患者、代述人提供假材料等都会影响家族史的准确性。着重了解结婚年龄、次数、配偶健康状况以及是否近亲结婚等。第4页/共57页(1)家族史2.43.生育史着重了解生育年龄、子女数目、健康状况、有无流产、死产、早产史等。如有新生儿死亡或患儿，则除询问父母及家庭成员上述情况外，还应该了解患儿有无产伤、窒息，妊娠早期母体有无患病毒性疾病和接触过致畸因素，如服用过致畸药物或接触过电离辐射或有害化学物质等。第5页/共57页3.生育史着重了解生育年龄、子女数目、健康状况、有无54.症状和体症遗传病除和其他疾病有相同的体症之外，往往有其本身的特异性症候群，为诊断提供初步的线索。苯丙酮尿症：智力发育不全，特殊腐臭尿液半乳糖血症：智力发育不全伴有白内障，肝硬化。第6页/共57页4.症状和体症遗传病除和其他疾病有相同的体症之外，往往有6由于大多数遗传病在婴儿和儿童时期即可有体症和症状出现，故除观察外貌特征外，还应该注意身体发育情况：诸如体重增长速度，智力增进、性器官以及第二性症发育、肌肉的张力、婴儿啼哭的声音等情况。由于有遗传异质性，若欲作出病因诊断，单凭体症、症状资料是非常困难的，一定要进行必要的实验室检查。诊断中应该注意的问题第7页/共57页由于大多数遗传病在婴儿和儿童时期即可有体症和症状出现，故除观7二、系谱分析系谱(Pedigree)：将患者家族的所有成员及其发病情况按照一定格式排绘制成的图解，就成为系谱。系谱分析(PedigreeAnalysis)：对某种性状或者疾病的多个系谱进行综合研究，从而得出这种性状或者疾病的遗传方式，称之为系谱分析。第8页/共57页二、系谱分析系谱(Pedigree)：将患者家族的所8ⅠⅡⅣⅢ一例并指症的系谱第9页/共57页ⅠⅡⅣⅢ一例并指症的系谱第9页/共57页9一例多指（趾）的系谱ⅠⅡⅢ12

2341567123456第10页/共57页一例多指（趾）的系谱ⅠⅡⅢ122341567123456第10一例β-地中海贫血的系谱12ⅠⅡⅢ213456789812345679101112设：贫血基因—0

正常基因—A

A

0A0A0AA重型贫血轻型贫血00A0

第11页/共57页一例β-地中海贫血的系谱12ⅠⅡⅢ21345678981231112ⅠⅡⅢ11７８3764510912412813２1Ⅳ634215356９101112131415一例白化病的系谱第12页/共57页12ⅠⅡⅢ11７８3764510912412813２1Ⅳ6312一例甲型血友病的系谱ⅠⅡⅢ212345678910111234567891第13页/共57页一例甲型血友病的系谱ⅠⅡⅢ212132一例抗维生素D性佝偻病的系谱ⅠⅡⅢ12345678910111234567891设：致病基因—XA

正常基因—XaXAXaXaYXAYXAXaXAY第14页/共57页2一例抗维生素D性佝偻病的系谱ⅠⅡⅢ1214进行系谱分析应注意的问题系谱的系统性、完整性、可靠性。去伪存真。分析显性遗传病时应注意延迟显性、不规则显性、外显不全等。分析性连锁遗传病时应注意与从性和限性遗传相区别。要注意显隐性的相对性。因为同一种遗传病采用不同观察指标会得出不同的结论。注意新的基因突变。第15页/共57页进行系谱分析应注意的问题系谱的系统性、完整性、可靠性。去伪存15HbAHbAHbA

HbS

HbSHbS

正常人

携带着

患者（致死）

无有（50%）有（全部）

无

有（生存力强）----

基因型疾病（隐性）镰形细胞（显性）抗疟疾（显性）第16页/共57页HbAHbAHbAHbSHb16三、生物化学检查基因突变引起的单基因病往往表现在酶和蛋白质的质与量的改变或者缺如。因此酶和蛋白质的定量分析是诊断单基因病和先天性代谢性的主要方法。第17页/共57页三、生物化学检查基因突变引起的单基因病往往表现在酶和蛋白质的171.代谢产物的检出酶的缺陷导致一系列生化代谢紊乱，从而导致代谢底物、中间产物、终产物、旁路代谢产物发生改变。因此，检测某些代谢常物的质和量的改变，可以间接反映出酶的变化而作出诊断。苯丙酮尿症：血清中的苯丙氨酸；尿中苯乙酸。粘多糖病：尿中的硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素。DMD：血清中的磷酸肌酸酶活性。第18页/共57页1.代谢产物的检出酶的缺陷导致一系列生化代谢紊乱，从而导182.酶和蛋白质的分析基因突变导致的单基因病主要是特定的蛋白质、酶的质和量改变的结果。因此对酶的活性和蛋白质含量的测定是确定某些单基因病的主要方法。第19页/共57页2.酶和蛋白质的分析基因突变导致的单基因病主要是特定的蛋19检测材料的主要来源有：特定的组织和细胞，如肝细胞、皮肤成纤维细胞，肾，肠粘膜细胞等。注意的问题：一种酶的缺乏不一定在所有组织中都能够检测出来。例如苯丙氨酸羟化酶必须用肝组织活检，而血细胞中无法得到。第20页/共57页检测材料的主要来源有：特定的组织和细胞，如肝细胞、皮肤成纤20上海：1981～1987年对284,396名新生儿进行PKU筛查，查出PKU患儿15名，高苯丙氨酸血症4名。生物化学检查

苯丙酮尿症,PKUⅠ酶活性检查 PAH 肝细胞血液滤片法 Guthrietest血液FeCl3显色反应 苯丙酮酸尿液第21页/共57页上海：1981～1987年对284,396名新生儿进行PKU21四、基因诊断基因分析，即基因诊断(GeneDiagnosis)：

是利用DNA分析技术直接从基因水平(DNAorRNA)检测遗传病的基因缺陷。这种方法和传统的诊断方法主要差别在于直接从基因型推断表型，可以越过基因产物，直接检测基因的结构而作出诊断，改变了传统的表型诊断方式，所以又称为逆向诊断(ReverseDiagnosis)。第22页/共57页四、基因诊断基因分析，即基因诊断(GeneDiagno22第23页/共57页第23页/共57页231978年，KanYW——

镰状细胞贫血症状前诊断

——外周静脉血产前诊断

——孕早期的绒毛细胞

孕中期的羊水胎儿脱落细胞

母亲外周血中的胎儿有核红细胞植入前诊断

——受精卵卵裂细胞基因诊断第24页/共57页1978年，KanYW——镰状细胞贫血症状前诊断——24基因诊断的优点材料容易获得，不受细胞类型的限制；不受基因表达的时空限制。不受年龄的限制；可以于发病前做出诊断；方便有效，迅速准确，携带者也可以有效检出。第25页/共57页基因诊断的优点材料容易获得，不受细胞类型的限制；第25页/共25

基因诊断的难点：对大多数疾病尚未找到合适的基因诊断方法，另外由于遗传异质性、基因突变的多样性，一种基因诊断方法对同一疾病往往有很大差异。

基因诊断的对象：一般是指单基因病和某些有主基因改变的多基因病。至1997年，发现人类单基因病遗传病已达8587种，现已达到15988种第26页/共57页基因诊断的难点：对大多数疾病尚未找到合适的基因诊断方26进行基因诊断必须具备的条件：(1)致病基因的染色体定位已明确(2)致病基因的结构、顺序与突变性质巳清楚(3)致病基因与DNA多态存在连锁关系根据所具备的条件选择适合的基因诊断技术第27页/共57页进行基因诊断必须具备的条件：(1)致病基因的染色体定位已明确27基因诊断方法

目前常用的基因诊断方法:(1)聚合酶链反应DNA扩增法

(2)限制性酶谱Southern印迹杂交直接分析法

(3)限制性片段长度多态性(RFLP)连锁分析法

(4)寡核苷酸探针(oligonucleotideprobe)检测法

(5)DNA测序

(6)基因芯片第28页/共57页基因诊断方法目前常用的基因诊断方法:第28页/共57页28（一）聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)聚合酶链反应（PCR）是在体外特异和迅速地扩增特定靶DNA序列的方法第29页/共57页（一）聚合酶链反应聚合酶链反应（PCR）是在体外特异和迅29PCR的原理：1.为可选择性扩增,要有特异引物2.要有前身物、聚合酶和离子3.是链式反应，每一周期经过变性、复性和延伸三步4.一周期后DNA倍增第30页/共57页PCR的原理：第30页/共57页30

PCR的过程：

变性（92-95；1分钟）复性（40-60；1分钟）延伸（72；1.5分钟）第31页/共57页PCR的过程：第31页/共57页31

5’3’3’5’

变性

5’3’3’5’

特异引物复性

5’3’

5’3’

3’5’3’5’

DNA聚合酶延伸

3’

5’5’

3’

PCR第32页/共57页5’32

以地贫基因诊断为例

由于中国人α地贫80%以上为东南亚型缺失型（--SEA/）,该突变的缺失范围约20kb基因片段。因此，采用跨越断裂点PCR法（gap-PCR）,一次即可诊断出各种基因型。PCR的应用第33页/共57页以地贫基因诊断为例PCR的应用第33页/共57页33第34页/共57页第34页/共57页34α1

α2α1

α2第35页/共57页α1α2α1α2第35页/共57页35Multi-PCR第36页/共57页Multi-PCR第36页/共57页36PCR-SSCP1989年，Orita等建立的PCR产物单链DNA凝胶电泳技术。12345ab1：正常人；2,4,5：纯合体患者；3：杂合体(2的弟弟)左为泳动变位模式：a正常人；b纯合体患者第37页/共57页PCR-SSCP1989年，Orita等建立的PCR产物单链37PCR-SSCPGAA→GAGTGT→TATCTC→CAC第38页/共57页PCR-SSCPGAA→GAGTGT→TATCTC→CAC第38第39页/共57页第39页/共57页39PCR-DHPLCDHPLC（变性高效液相色谱）进行基因突变检测的原理

DHPLC进行基因突变检测是基于异源双链的形成和不同的双链与吸附拄的结合牢固程度不同。第40页/共57页PCR-DHPLC第40页/40

一个杂合子个体，PCR产物一定含有野生型和突变型两种DNA，并且两者的比例为1:1，将PCR产物进行变性复性过程，杂交会形成同源双链和异源双链，同样，当把野生型和突变型PCR产物混合后，进行变性复性过程，杂交后会出现四种情况。第41页/共57页一个杂合子个体，PCR产物一定含有野生型和突41

异源双链由于碱基对不匹配，在部分变性的温度条件下，就会在不匹配的碱基对处部分解链，由于单链DNA带负电荷减少，结合力弱，因此，异源双链比同源双链先洗脱出来，根据柱子保留时间的不同将同源双链和异源双链分离，出现不同的检测峰。第42页/共57页异源双链由于碱基对不匹配，在部分变性的温度条42

DHPLC的特点：

1）快速分离DNA分子，一般进行基因突变检测，一个样品约需8.8分钟

2）自动化操作系统

3）准确测定DNA片段大小

4）基因突变检出率高，达95-100%5）经济、操作简便、PCR产物无须进行纯化处理即可用于突变检测第43页/共57页DHPLC的特点：第43页/共57页43（二）分子杂交第44页/共57页（二）分子杂交第44页/共57页44

Southern印迹杂交

(Southernblothybridization)原理:

DNA碱基的替换和数目的改变可导致限制性酶切片段长度改变

1.点突变至酶切位点消失或出现新切点

2.较大片段碱基缺失

3.串联重复数目较大的改变

4.较大片段碱基重复第45页/共57页Southern印迹杂交第4545限制酶的识别序列与切割：

绝大多数Ⅱ型限制酶的识别序列都是回文结构,即以双对称轴按5’3’方向阅读时,其碱基顺序在双链上相同

BamHⅠ识别GGATCC5’-GGATCCATGGAACCGTAGCGGATCCTAGT-3’3’-CCTAGGTACCTTGGCATCGCCTAGGATCA-5’

BglⅡ识别AGATCT5’-AGATCTTACATTGGCATCGAGATCTTAGT-3’3’-TCTAGAATGTAACCGTAGCTCTAGAATCA-5’第46页/共57页限制酶的识别序列与切割：第46页/共57页46

探针的种类和标记

杂交探针

DNA

cDNA

寡核苷酸基因组DNA

或PCR产物

mRNA

逆转录

化学合成

双链

0.1-20kb

双链

0.1-10kb

单链

15-150bp缺口平移，随机引物，PCR缺口平移，随机引物，PCR类型来源特征标记

末端标记第47页/共57页探针的种类和47

探针标记(probelabeling)

同位素标记:32P,35S,3H

非同位素标记:生物素，地高辛标记方法:

缺口平移双链探针标记随机引物

PCR

寡核苷酸标记:5’末端标上标记物第48页/共57页探针标记(probelabeling)第4481．限制性酶谱直接分析法：

应用专一性基因探针和限制性内切酶，经

Southern印迹杂交直接检测致病基因存在

原理：

限制性内切酶能识别DNA中特定核苷酸顺序，在正常情况下某种限制性内切酶所切出的片段长度是固定的，当基因发生突变后,核苷酸顺序发生改变,导致限制性内切酶的酶切位点改变，从而使片段长度发生改变。第49页/共57页1．限制性酶谱直接分析法：第49页/共57页49直接分析法镰状细胞贫血(HbS)：第6位密码子A→TAAASSSMstⅡ:CCTNAGG

1.2Kb

0.2Kb1.40Kb1.20Kb0.20KbA:CCTGAGGAGS:CCTGTGGAG第50页/共57页直接分析法镰状细胞贫血(HbS)：第6位密码子A→50ααα/αααα/αααα/α-

α-/-

-

-

-/-

-第51页/共57页ααα/αααα/αααα/α-α-/-51RFLP连锁分析Neurofibroma,NF1RFLP连锁分析ⅠⅡⅢ1212345678123456784.7kb3.0kb?第52页/共57页RFLP连锁分析Neurofibroma,NF1Ⅰ152

ASO点杂交(ASOdothybridization)

(ASO:allele-specificoligonucleotide)

能鉴定一对等位基因中单一核苷酸的差别原理：

1.点突变时突变点的碱基被替换

2.设计分别与正常和点突变序列互补的探针

3.单一碱基的不配对足以导致异源杂交链的结合不稳定

4.严格的洗脱条件下,只有完全互补的异源杂交链能保留而显示杂交信号

第53页/共57页ASO点杂交(ASOdothybridizati53ASO斑点杂交1986年，胡流清等基于点突变原理，用寡核苷酸探针进行基因诊断。正常探针突变探针PKU，AR第54页/共57页ASO斑点杂交1986年，胡流清等基于点突变原理，用寡核苷酸54βA–

ASO(N

probe)5’CTCCTGAGGAGA

3’βS

–ASO(M

probe)5’CTCCTGTGGAGAA

3’221331待测DNA杂交反应

βAβA

正常βAβS

杂合子ASO斑点杂交鉴定镰型细胞贫血突变βAβS杂合子βSβS纯合子第55页/共57页βA–ASO(Nprobe)βS–ASO(M55DNA测序用四种不同颜色荧光素分别标记A，T，G，C核苷酸碱基，经过测序反应，标记的碱基代替原有碱基，通过标记碱基发出的荧光颜色确定待测DNA样本的序列。第56页/共57页DNA测序用四种不同颜色荧光素分别标记A，T，G，C核苷酸碱56基因(DNA)芯片技术将大量标记的探针分子（通常每平方厘米点阵密度高于400

）固定于支持物上后与样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子杂交信号的强度，获取样品分子的数量和序列信息第57页/共57页基因(DNA)芯片技术将大量标记的探针分子（通常每平方厘米点57遗传病的诊断(DiagnosisofHereditaryDisease)可以分为产前诊断、症状前诊断和现症病人诊断三种类型。遗传病的诊断是开展遗传咨询和防治工作的基础。第1页/共57页遗传病的诊断(DiagnosisofHeredita58遗传病的诊断方法普遍性诊断原则是指与一般疾病相同的诊断方法，即通过对病史、症状、体症、实验室检查和其他诊断技术所获得的资料进行归纳分析，同时排除拟诊疾病，然后确立诊断。遗传学的特殊诊断主要是指染色体检查、性染色质检查、特异性酶和蛋白质以及代谢中间产物的生化分析、DNA\RNA以及家系分析、皮肤纹理分析、携带者的检出等等。第2页/共57页遗传病的诊断方法普遍性诊断原则是指与一般疾病相同的诊断59一病史、家族史和体症

1.病史由于遗传病多有家族聚集现象，所以病史的采集的准确性非常重要。除关注一般病史外，主要着重于患者的家族史、婚姻史和生育史。第3页/共57页一病史、家族史和体症

1.病史由于遗传病多有家族60(1)家族史

2.家族史采集家族史时应该特别注意因患者或代述人由于文化程度、记忆能力、思维能力、判断能力以及精神状态而使症状、体症的描述不够准确、全面，或者因为患者、代述人提供假材料等都会影响家族史的准确性。着重了解结婚年龄、次数、配偶健康状况以及是否近亲结婚等。第4页/共57页(1)家族史2.613.生育史着重了解生育年龄、子女数目、健康状况、有无流产、死产、早产史等。如有新生儿死亡或患儿，则除询问父母及家庭成员上述情况外，还应该了解患儿有无产伤、窒息，妊娠早期母体有无患病毒性疾病和接触过致畸因素，如服用过致畸药物或接触过电离辐射或有害化学物质等。第5页/共57页3.生育史着重了解生育年龄、子女数目、健康状况、有无624.症状和体症遗传病除和其他疾病有相同的体症之外，往往有其本身的特异性症候群，为诊断提供初步的线索。苯丙酮尿症：智力发育不全，特殊腐臭尿液半乳糖血症：智力发育不全伴有白内障，肝硬化。第6页/共57页4.症状和体症遗传病除和其他疾病有相同的体症之外，往往有63由于大多数遗传病在婴儿和儿童时期即可有体症和症状出现，故除观察外貌特征外，还应该注意身体发育情况：诸如体重增长速度，智力增进、性器官以及第二性症发育、肌肉的张力、婴儿啼哭的声音等情况。由于有遗传异质性，若欲作出病因诊断，单凭体症、症状资料是非常困难的，一定要进行必要的实验室检查。诊断中应该注意的问题第7页/共57页由于大多数遗传病在婴儿和儿童时期即可有体症和症状出现，故除观64二、系谱分析系谱(Pedigree)：将患者家族的所有成员及其发病情况按照一定格式排绘制成的图解，就成为系谱。系谱分析(PedigreeAnalysis)：对某种性状或者疾病的多个系谱进行综合研究，从而得出这种性状或者疾病的遗传方式，称之为系谱分析。第8页/共57页二、系谱分析系谱(Pedigree)：将患者家族的所65ⅠⅡⅣⅢ一例并指症的系谱第9页/共57页ⅠⅡⅣⅢ一例并指症的系谱第9页/共57页66一例多指（趾）的系谱ⅠⅡⅢ12

2341567123456第10页/共57页一例多指（趾）的系谱ⅠⅡⅢ122341567123456第67一例β-地中海贫血的系谱12ⅠⅡⅢ213456789812345679101112设：贫血基因—0

正常基因—A

A

0A0A0AA重型贫血轻型贫血00A0

第11页/共57页一例β-地中海贫血的系谱12ⅠⅡⅢ21345678981236812ⅠⅡⅢ11７８3764510912412813２1Ⅳ634215356９101112131415一例白化病的系谱第12页/共57页12ⅠⅡⅢ11７８3764510912412813２1Ⅳ6369一例甲型血友病的系谱ⅠⅡⅢ212345678910111234567891第13页/共57页一例甲型血友病的系谱ⅠⅡⅢ212702一例抗维生素D性佝偻病的系谱ⅠⅡⅢ12345678910111234567891设：致病基因—XA

正常基因—XaXAXaXaYXAYXAXaXAY第14页/共57页2一例抗维生素D性佝偻病的系谱ⅠⅡⅢ1271进行系谱分析应注意的问题系谱的系统性、完整性、可靠性。去伪存真。分析显性遗传病时应注意延迟显性、不规则显性、外显不全等。分析性连锁遗传病时应注意与从性和限性遗传相区别。要注意显隐性的相对性。因为同一种遗传病采用不同观察指标会得出不同的结论。注意新的基因突变。第15页/共57页进行系谱分析应注意的问题系谱的系统性、完整性、可靠性。去伪存72HbAHbAHbA

HbS

HbSHbS

正常人

携带着

患者（致死）

无有（50%）有（全部）

无

有（生存力强）----

基因型疾病（隐性）镰形细胞（显性）抗疟疾（显性）第16页/共57页HbAHbAHbAHbSHb73三、生物化学检查基因突变引起的单基因病往往表现在酶和蛋白质的质与量的改变或者缺如。因此酶和蛋白质的定量分析是诊断单基因病和先天性代谢性的主要方法。第17页/共57页三、生物化学检查基因突变引起的单基因病往往表现在酶和蛋白质的741.代谢产物的检出酶的缺陷导致一系列生化代谢紊乱，从而导致代谢底物、中间产物、终产物、旁路代谢产物发生改变。因此，检测某些代谢常物的质和量的改变，可以间接反映出酶的变化而作出诊断。苯丙酮尿症：血清中的苯丙氨酸；尿中苯乙酸。粘多糖病：尿中的硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素。DMD：血清中的磷酸肌酸酶活性。第18页/共57页1.代谢产物的检出酶的缺陷导致一系列生化代谢紊乱，从而导752.酶和蛋白质的分析基因突变导致的单基因病主要是特定的蛋白质、酶的质和量改变的结果。因此对酶的活性和蛋白质含量的测定是确定某些单基因病的主要方法。第19页/共57页2.酶和蛋白质的分析基因突变导致的单基因病主要是特定的蛋76检测材料的主要来源有：特定的组织和细胞，如肝细胞、皮肤成纤维细胞，肾，肠粘膜细胞等。注意的问题：一种酶的缺乏不一定在所有组织中都能够检测出来。例如苯丙氨酸羟化酶必须用肝组织活检，而血细胞中无法得到。第20页/共57页检测材料的主要来源有：特定的组织和细胞，如肝细胞、皮肤成纤77上海：1981～1987年对284,396名新生儿进行PKU筛查，查出PKU患儿15名，高苯丙氨酸血症4名。生物化学检查

苯丙酮尿症,PKUⅠ酶活性检查 PAH 肝细胞血液滤片法 Guthrietest血液FeCl3显色反应 苯丙酮酸尿液第21页/共57页上海：1981～1987年对284,396名新生儿进行PKU78四、基因诊断基因分析，即基因诊断(GeneDiagnosis)：

是利用DNA分析技术直接从基因水平(DNAorRNA)检测遗传病的基因缺陷。这种方法和传统的诊断方法主要差别在于直接从基因型推断表型，可以越过基因产物，直接检测基因的结构而作出诊断，改变了传统的表型诊断方式，所以又称为逆向诊断(ReverseDiagnosis)。第22页/共57页四、基因诊断基因分析，即基因诊断(GeneDiagno79第23页/共57页第23页/共57页801978年，KanYW——

镰状细胞贫血症状前诊断

——外周静脉血产前诊断

——孕早期的绒毛细胞

孕中期的羊水胎儿脱落细胞

母亲外周血中的胎儿有核红细胞植入前诊断

——受精卵卵裂细胞基因诊断第24页/共57页1978年，KanYW——镰状细胞贫血症状前诊断——81基因诊断的优点材料容易获得，不受细胞类型的限制；不受基因表达的时空限制。不受年龄的限制；可以于发病前做出诊断；方便有效，迅速准确，携带者也可以有效检出。第25页/共57页基因诊断的优点材料容易获得，不受细胞类型的限制；第25页/共82

基因诊断的难点：对大多数疾病尚未找到合适的基因诊断方法，另外由于遗传异质性、基因突变的多样性，一种基因诊断方法对同一疾病往往有很大差异。

基因诊断的对象：一般是指单基因病和某些有主基因改变的多基因病。至1997年，发现人类单基因病遗传病已达8587种，现已达到15988种第26页/共57页基因诊断的难点：对大多数疾病尚未找到合适的基因诊断方83进行基因诊断必须具备的条件：(1)致病基因的染色体定位已明确(2)致病基因的结构、顺序与突变性质巳清楚(3)致病基因与DNA多态存在连锁关系根据所具备的条件选择适合的基因诊断技术第27页/共57页进行基因诊断必须具备的条件：(1)致病基因的染色体定位已明确84基因诊断方法

目前常用的基因诊断方法:(1)聚合酶链反应DNA扩增法

(2)限制性酶谱Southern印迹杂交直接分析法

(3)限制性片段长度多态性(RFLP)连锁分析法

(4)寡核苷酸探针(oligonucleotideprobe)检测法

(5)DNA测序

(6)基因芯片第28页/共57页基因诊断方法目前常用的基因诊断方法:第28页/共57页85（一）聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)聚合酶链反应（PCR）是在体外特异和迅速地扩增特定靶DNA序列的方法第29页/共57页（一）聚合酶链反应聚合酶链反应（PCR）是在体外特异和迅86PCR的原理：1.为可选择性扩增,要有特异引物2.要有前身物、聚合酶和离子3.是链式反应，每一周期经过变性、复性和延伸三步4.一周期后DNA倍增第30页/共57页PCR的原理：第30页/共57页87

PCR的过程：

变性（92-95；1分钟）复性（40-60；1分钟）延伸（72；1.5分钟）第31页/共57页PCR的过程：第31页/共57页88

5’3’3’5’

变性

5’3’3’5’

特异引物复性

5’3’

5’3’

3’5’3’5’

DNA聚合酶延伸

3’

5’5’

3’

PCR第32页/共57页5’89

以地贫基因诊断为例

由于中国人α地贫80%以上为东南亚型缺失型（--SEA/）,该突变的缺失范围约20kb基因片段。因此，采用跨越断裂点PCR法（gap-PCR）,一次即可诊断出各种基因型。PCR的应用第33页/共57页以地贫基因诊断为例PCR的应用第33页/共57页90第34页/共57页第34页/共57页91α1

α2α1

α2第35页/共57页α1α2α1α2第35页/共57页92Multi-PCR第36页/共57页Multi-PCR第36页/共57页93PCR-SSCP1989年，Orita等建立的PCR产物单链DNA凝胶电泳技术。12345ab1：正常人；2,4,5：纯合体患者；3：杂合体(2的弟弟)左为泳动变位模式：a正常人；b纯合体患者第37页/共57页PCR-SSCP1989年，Orita等建立的PCR产物单链94PCR-SSCPGAA→GAGTGT→TATCTC→CAC第38页/共57页PCR-SSCPGAA→GAGTGT→TATCTC→CAC第95第39页/共57页第39页/共57页96PCR-DHPLCDHPLC（变性高效液相色谱）进行基因突变检测的原理

DHPLC进行基因突变检测是基于异源双链的形成和不同的双链与吸附拄的结合牢固程度不同。第40页/共57页PCR-DHPLC第40页/97

一个杂合子个体，PCR产物一定含有野生型和突变型两种DNA，并且两者的比例为1:1，将PCR产物进行变性复性过程，杂交会形成同源双链和异源双链，同样，当把野生型和突变型PCR产物混合后，进行变性复性过程，杂交后会出现四种情况。第41页/共57页一个杂合子个体，PCR产物一定含有野生型和突98

异源双链由于碱基对不匹配，在部分变性的温度条件下，就会在不匹配的碱基对处部分解链，由于单链DNA带负电荷减少，结合力弱，因此，异源双链比同源双链先洗脱出来，根据柱子保留时间的不同将同源双链和异源双链分离，出现不同的检测峰。第42页/共57页异源双链由于碱基对不匹配，在部分变性的温度条99

DHPLC的特点：

1）快速分离DNA分子，一般进行基因突变检测，一个样品约需8.8分钟

2）自动化操作系统

3）准确测定DNA片段大小

4）基因突变检出率高，达95-100%5）经济、操作简便、PCR产物无须进行纯化处理即可用于突变检测第43页/共57页DHPLC的特点：第43页/共57页100（二）分子杂交第44页/共57页（二）分子杂交第44页/共57页101

Southern印迹杂交

(Southernblothybridization)原理:

DNA碱基的替换和数目的改变可导致限制性酶切片段长度改变

1.点突变至酶切位点消失或出现新切点

2.较大片段碱基缺失

3.串联重复数目较大的改变

4.较大片段碱基重复第45页/共57页Southern印迹杂交第45102限制酶的识别序列与切割：

绝大多数Ⅱ型限制酶的识别序列都是回文结构,即以双对称轴按5’3’方向阅读时,其碱基顺序在双链上相同

BamHⅠ识别GGATCC5’-GGATCCATGGAACCGTAGCGGATCCTAGT-3’3’-CCTAGGTACCTTGGCATCGCCTAGGATCA-5’

BglⅡ识别AGATCT5’-AGATCTTACATTGGCATCGAGATCTTAGT-3’3’-TCTAGAATGTAACCGTAGCTCTAGAATCA-5’第46页/共57页限制酶的识别序列与切割：第46页/共57页103

探针的种类和标记

杂交探针

DNA

cDNA

寡核苷酸基因组DNA

或PCR产物

mRNA

逆转录

化学合成

双链

0.1-