艾草中黄酮类化合物的提取步骤

艾草中黄酮类化合物的提取步骤一、试验仪器及药品试验仪器：天平、紫外分光光度计、恒温水浴锅、小鼠固定器、灌胃器、恒温干燥箱、真空抽滤机、毛细血管、容量瓶、移液管等。试验药品：盐酸、乙醇、芦丁标品、5%亚硝酸钠溶液、10%硝酸铝溶液、1mol/L氢氧化钠溶液、阿司匹林、生理盐水二、技术路线技术路线1：艾草采集→干燥→粉碎→过筛→浸提→趁热抽滤2次→合并滤液→冷却→黄酮类粗品→乙醇重结晶→冷却→黄酮类化合物精品技术路线2：小鼠编号分组—灌胃给药—毛细血管静脉取血—观察并记录凝血时间技术路线3：小鼠编号分组—灌胃给药—小鼠断尾—观察并记录凝血时间三、实验步骤：（一）艾草中黄酮类化合物的提取工艺研究分别以液料比（艾草质量：溶剂体积）、浸提温度、浸提时间3个方面进行单因素实验，以黄酮类化合物的提取率为指标，确定单因素的合适范围，然后做单因素正交实验，确定最佳的提取工艺组合。1、艾草中黄酮类化合物粗提取液的制备①艾草采集：采取8月中旬的艾草。1/5②干燥：以风干为最佳干燥方法。③浸提：准确称取1g艾草粉末，加约 6倍量已煮沸的蒸馏水，搅拌下加饱和石灰水调pH至8～9，并保持此pH下微沸40～50min。④合并提取液：在80～90℃，搅拌下用盐酸调pH4～5，静止，沉淀完全抽滤，水洗至洗液呈中性，60℃干燥至恒重。⑤乙醇重结晶：收集干燥得黄酮粗提物，加500mL已煮沸的蒸馏水，加热煮沸20min至溶液澄清，趁热过滤，收集滤液，放置充分冷却，沉淀完全抽滤，水洗至洗液呈中性，沉淀60℃干燥至恒重。2、黄酮含量测定：1）制备标准曲线：取干燥恒重芦丁配成浓度为0."065mg/mL标溶液,取上述标准溶液0."0,2."0,4."0,6."0,8."0,10."0mL,分别置于25mL容量瓶中,加30%乙醇补足至2/512."5mL,加5%亚硝酸钠溶液0."7mL摇匀,放置5min后,精确加入10%硝酸铝溶液0."7mL摇匀,放置5min,精确加入1mol/L氢氧化钠溶液5mL,用30%乙醇稀释至刻度。以第1容量瓶为空白,于510nm波长下测定吸光度,以吸光度为坐标，浓度为横坐标,绘制标准曲线,建立回归方程。2）黄酮类化合物的测定：取提取液0."1mL,置于25mL容量瓶中,加30%乙醇补足至12."5mL,加5%亚硝酸钠溶液0."7mL摇匀,放置5min后,精确加入10%硝酸铝溶液0."7mL摇匀,放置5min,精确加入1mol/L氢氧化钠溶液5mL,用30%乙醇稀释至刻度。以0."1氧化钠溶液5mL,用30%乙醇稀释至刻度。以0."1mL30%乙醇为空白,于510nm波长下测定吸光度A,由标准曲线得对应浓度C,可算得艾草样品的总黄酮含量。3、黄酮化合物提取优化试验（1）单因素试验①液料比：80℃水浴浸提3h，液料比分别为 1:15、"1:20、"1:25、"1:30、"1:3/535、"1:40条件下提取艾草中黄酮化合物，以黄酮化合物的提取率为指标，研究液料比对黄酮提取效率的影响。选取对黄酮提取率影响较大的范围，用于正交试验。②浸提温度：液料比1:25水浴浸提3h，温度分别为60℃、70℃、80℃、90℃、100℃条件下提取艾草中黄酮类化合物，以黄酮化合物的提取率为指标，研究温度对黄酮提取效率的影响。选取对黄酮提取率影响较大的范围，用于正交试验。③浸提时间：80℃水浴、液料比1:25，时间分别为 1h.、1."5h、2h、2."5h、3h、3.5h条件下提取艾草中黄酮化合物，以黄酮化合物的提取率为指标，研究液料比对黄酮提取效率的影响。选取对黄酮提取率影响较大的范围，用于正交试验。（2）正交试验以（1）单因素试验中的数据进行 L9(33)正交试验。（二）艾草中黄酮类化合物的凝血试验①小鼠分组：将50只2周龄的小鼠随即分成5组，分别为：空白对照组（生理盐水0."2mL/10g（体重）），阳性对照组（ 20mg/kg阿司匹林），5."0、10."4/50、15."0g/黄酮类化合物组。②灌胃给药：按照步骤①所述条件，用针管将生理盐水、阿司匹林、各浓度黄酮类化合物注射到小鼠嘴内，每天2次，连续3d。③毛细管静脉取血：末次给药1h后，用内径1mm毛细管插入小鼠内龇静脉丛中取血，血液注满毛细管后轻轻放于桌面。④观察并记录凝血时间：从血液开始流入毛细管开始计时，每隔30s打断毛细管，观察断裂处有无凝血丝的出现，一旦出现则说明凝血，停止计时，记录时间，即为凝血时间。（三）、艾草中黄酮类化合物的出血试验①、②于二中的①、②相同。③小鼠断尾：小鼠固定于