病毒性肝炎血清学检测的基础与实践

（优选）病毒性肝炎血清学检测的基础与实践第一页，共六十四页。为什么ELISA检测抗体容易假阳性?抗体的粘附特性，特别是IgM抗体ELISA的高灵敏性抗体结合抗原的适应性：Fab－CDR抗-HIV初筛试验抗-HIV确诊试验第二页，共六十四页。CLVLVHCH1CH2CH3V区Fab段Fc段s-ss-ss-ss-sCDR1CDR3CDR2抗体结构简图IgM是五聚体，与抗原具有5或10价结合力。Fab：fragmentantigen-bindingCDR：complementaritydeterminingregionFab段抗体结合抗原的适应性：Fab－CDR第三页，共六十四页。抗体产生过程简图第四页，共六十四页。间接ELISA检测抗体1.抗原包被2.封闭3.待测血清4.酶标二抗5.TMB显色6.2MH2SO47.OD450EEEEEE+SubstrateTMB抗-IgG抗-IgA抗-IgMIgGIgAIgM第五页，共六十四页。抗体的粘附特性00.501.001.502.00原倍10100100010000血清稀释倍数OD450间接ELISA，无抗原包被间接法ELISA检测抗体，灵敏，但容易出现假阳性第六页，共六十四页。捕捉法ELISA检测IgM抗体1.抗mu链抗体包被2.封闭3.待测血清4.酶标抗原（特异性）5.TMB显色6.2MH2SO47.OD450CLVLVHCH1CH2CH3V区s-ss-ss-ss-s敏感性较间接法低，但特异性强第七页，共六十四页。ELISA检测抗原1.抗体包被2.封闭3.待测血清4.酶标抗体5.TMB显色6.2MH2SO47.OD450EEEEEE+SubstrateTMB包被抗体与酶标抗体识别的免疫表位必须不同第八页，共六十四页。病毒性肝炎甲型乙型丙型丁型戊型HepatitisAVirus,HAVHepatitisBVirus,HBVHepatitisCVirus,HCVHepatitisDVirus,HDVHepatitisEVirus,HEV消化道血液消化道感染途径血液血液病原学病程分型急性急性,慢性急性,慢性急性,慢性急性GBV-C，所谓庚型肝炎病毒，不引起肝损，不是肝炎病毒EB病毒、巨细胞病毒等可引起肝损，但以脏器损伤为主，不称肝炎病毒第九页，共六十四页。病毒性肝炎的病原诊断根据临床表现无法确定病原诊断依赖实验室检查血清学方法：血清+免疫技术检测抗原或抗体分子生物学：酶免疫测定：enzymeimmunoassay,EIA酶联免疫吸附测定：enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA分子杂交：同位素或其他物质标记已知DNA或cDNA，即探针，与待测标本中的核酸互补，特异性结合。－－淘汰聚合酶链反应：polymerasechainreaction，PCR－－普遍使用第十页，共六十四页。甲型肝炎病毒HAV无包膜RNA病毒：抗原种类少正链RNA，7.4kbHAV抗原只有一种，即衣壳蛋白；难以测到，不开展特异性抗体：抗-HAVIgG,IgM，保护性抗体；常用HAVRNA：RT-PCR检测，但阳性率低，仅用于研究第十一页，共六十四页。024681012抗甲肝抗体浓度感染后周数病毒血症大便排病毒转氨酶升高期症状期IgMIgGHAV感染后人体抗体应答抗-HAVIgM：感染后～3周即可阳性，1-3月后转阴，近期或急性感染。抗-HAVIgG：IgM产生后数天即可阳性，存在数十年，单纯阳性很可能是既往感染，故单独检测抗-HAVIgG通常不用于诊断。第十二页，共六十四页。甲型肝炎诊断流程同时检测抗HAVIgM和IgG时：4种情况仅检测抗-HAVIgM时甲型肝炎抗-HAVIgM阳性抗-HAVIgG阳性甲型肝炎1.2.既往感染，对甲肝有免疫力排除甲肝，而且为易感者抗-HAVIgM阴性抗-HAVIgG阳性抗-HAVIgM阴性抗-HAVIgG阴性3.阳性阴性排除第十三页，共六十四页。甲型肝炎诊断流程同时检测抗HAVIgM和IgG时：4种情况甲型肝炎早期或IgM假阳性1-2周后复查甲型肝炎甲型肝炎IgM假阳性排除甲型肝炎抗-HAVIgM阳性抗-HAVIgG阴性IgM阳性IgG阳性IgM阴性IgG阳性IgM阳性IgG阴性4.第十四页，共六十四页。乙型肝炎病毒HBV颗粒完整HBV：

Daneparticle；球形，42nm，双层壳膜结构小球形颗粒：22nm，乙肝表面抗原（hepatitisBsurfaceantigen,HBsAg）丝状(管状)颗粒：直径22nm，长短不等，HBsAg18.7万倍20万倍25万倍HBV双层壳膜结构，外层是HBsAg，内层是HBcAg第十五页，共六十四页。HBV基因与基因产物pre-S1pre-S2ORFSORFPORFXORFCpre-C+-5’5’HBsAgPolymerase:DNApolymeraseRNaseHReversetranscriptaseothers

HBxAgHBcAgHBeAgpre-S1pre-S2第十六页，共六十四页。HBV主要结构示意图HBsAgHBcAgHBVDNAHBeAg不是病毒的结构成份第十七页，共六十四页。HBVPreC/C基因序列1814atgcaactttttcacctctgcctaatcatctcttgttcatgtcctac1861tgttcaagcctccaagctgtgccttggggggctttgggacatggacattg1911accactataaagaatttggagcttctgtggagttactctcttttttgcct1961tttgacttctttccttctattcgagatctcctcgacaccgcctctgctct2011ctatcgagaggccttagagtctccggaacattgttcacctcaccatacag2061cactcaggcaagctgttctgtgttggggtgagttgatgaatctggccacc2111tgggtgggaagtaatttggaagacccagcatccagggaattagtagtcgg2161ctatgtcaatgttaatatgggcctaaaaatcagacaactattggggtttc2211acatttcctgtcttacttttggaagagaaactgttctagagtatttggtg2261tcttttggagtgtggattcgcactcctcccgcttacagaccaccaaatgc2311ccctatcttatcaacacttccggaaactactgttgttagacgacgaggca2361ggtcccctagaagaagaactccctcgcctcgcagacgaaggtctcaatcg2411ccgcgtcgcagaagatctaaatctcgggaatctcaatgttag第十八页，共六十四页。MQLFHLCLIISCSCPTVQASKLCLGGLWDM

DIDHYKEFGASVELLSFLPFDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAVLCWGELMNLATWVGSNLEDPASRELVVGYVNVNMGLKIRQLLGFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSKSRESQC147-149HBVPreC/C编码HBcAg/HBeAgHBcAg:21.5kDHBeAg:15.5kD第十九页，共六十四页。HBV抗原5’3’5’3’42nmHBsAgHBcAgHBVDNAHBeAg不是HBV本身的成分是HBcAg的裂解产物能释放到细胞外外周血能测到能释放到细胞外外周血能测到不能释放到细胞外外周血不能测到外周血无游离HBVDNA检测时先裂解HBVHBV示意图第二十页，共六十四页。HBV抗原5’3’5’3’42nmHBsAgHBcAgHBVDNAHBeAg不是HBV本身的成分是HBcAg的裂解产物能释放到细胞外外周血能测到能释放到细胞外外周血能测到不能释放到细胞外外周血不能测到外周血无游离HBVDNA检测时先裂解HBVHBV示意图第二十一页，共六十四页。HBV携带者肝脏每天释放1010~12病毒血液HBsAg是HBV的1000~100000倍HBV编码抗原特点第二十二页，共六十四页。HBsAg抗-HBsHBsAg+，有传染性HBsAg+和HBeAg+，传染性强HBsAg-，无传染性，除隐匿性感染或变异外抗-HBs+，>10mIU/ml，有保护力HBeAg抗-HBe抗-HBc乙型肝炎病原学检测HBVDNA有条件的开展抗病毒治疗考核疗效第二十三页，共六十四页。乙肝血清学检测结果的意义HBsAg抗-HBsHBeAg抗-HBe抗-HBc临床意义+-+-+感染、传染性强+--++感染、有传染性+--+-感染、有传染性+---+感染、有传染性+-+--感染、传染性强+++/-+/-+/-感染、有传染性、病毒可能变异+----感染潜伏期、有传染性+----接种疫苗后、无传染性第二十四页，共六十四页。HBsAg抗-HBsHBeAg抗-HBe抗-HBc临床意义-+-++既往感染已恢复、有保护力-+--+既往感染已恢复、有保护力-+-+-既往感染已恢复、有保护力-+---接种疫苗或既往感染已恢复、有保护力---++既往感染已恢复、无保护力---+-既往感染已恢复、无保护力----+既往感染已恢复、无保护力-----既往无感染、易感人群乙肝血清学检测结果的意义第二十五页，共六十四页。为什么可通过检测外周血抗原诊断HBV感染？HBeAg能释放到细胞外－－比较容易测到HBsAg能释放到细胞外－－可测到HBV携带者肝脏每天释放1010~12病毒血液HBsAg是HBV的1000~100000倍其他病毒复制过程中，缺乏类似特性，不释放游离抗原，故通常不检测抗原，而通过检测特异性抗体而诊断。以上原因，决定了诊断HBV感染可通过检测病毒抗原。容易测到第二十六页，共六十四页。抗-HBc的意义抗-HBcIgG：长期存在，阳性时如HBsAg阴性，既往感染抗-HBcIgM：短期存在，阳性时，通常HBsAg也阳性；见于急性感染或慢性携带者急性发作实际工作中，抗-HBc阳性具有传染性－－基本不正确－－抗-HBcIgM具有传染性－－正确目前检测的抗-HBc是总抗体，包括IgG、IgM等，只要IgG阳性，抗-HBc即阳性；多数情况下，抗-HBc阳性仅是IgG抗体阳性。正确－－HBsAg阳性具有传染性第二十七页，共六十四页。HBsAg(－)HBeAg(+)阳性HBV携带者March2008October2008January2009HBsAg(IU/ml)--(0.01)-(0.00)抗-HBs(mIU/ml)++

(5356)+

(11578)

HBeAg++

(72.78)+

(72.89)抗-HBe--(4.33)-(4.28)抗-HBc++

(11.89)+

(15.91)抗-HBcIgMnotdone--ALT(U/L)21.024.221.5HBVDNA(copies/ml)notdone+

(491)+

(370)第二十八页，共六十四页。HBsAg(－)HBeAg(+)阳性携带者新的S基因变异PCR产物测序克隆后测序第二十九页，共六十四页。preS2geneHBsAg(－)HBeAg(+)阳性携带者前S2基因序列PCR产物测序克隆后测序第三十页，共六十四页。HBsAg(－)HBeAg(+)阳性HBV携带者IF3.124第三十一页，共六十四页。具有研究价值的HBV标本HBsAg抗-HBsHBeAg抗-HBe抗-HBc研究内容+++/-+/-+/-变异+----转归+-+--转归+--+-？抗c阴性-+-+-？抗c阴性-+---？抗c阴性*---+-？抗c阴性*未接种疫苗，即自然感染除外。第三十二页，共六十四页。丙型肝炎病毒HCVHCV30-60nm有包膜的RNA病毒，核心含有核心蛋白和RNA－－单链正义HBVHCV抵抗力弱，且RNA容易降解，检测核酸时，标本需在30分钟内分离血清，-80ºC保存。第三十三页，共六十四页。Lipidlayer脂质层Core,核心蛋白E1,包膜蛋白1E2,包膜蛋白2RNA,病毒核酸直径30-60nm结构蛋白HCV结构简图糖基化蛋白HCV示意图第三十四页，共六十四页。HCV基因与基因产物hypervariableregion1,HVR1UntranslatedRegion,UTRNoncodingregion,NCR针对HCV所有抗原的抗体都没有证实有中和作用第三十五页，共六十四页。HVR138clones15sequencesHCV高度变异HVR1第三十六页，共六十四页。抗原检测HCVcore:仅用于研究抗-HCVIgM：一般不开展，阳性率低HCVRNA：有条件的开展；抗病毒治疗考核疗效抗-HCVIgG：开展，(+)通常表示有HCV感染HCV病原学诊断针对HCV所有抗原的抗体都没有证实有中和作用第三十七页，共六十四页。抗-HCVIgM：一般不开展抗-HCVIgG：开展，90-95％的(+)提示HCV感染HCV病原学诊断－－抗-HCV检测包被抗原1st代3rd代2nd代50-75%90-95%95-99%阳性率第三十八页，共六十四页。丁型肝炎病毒HDVDeltavirusgenus中的唯一病毒HDV,36nmHDVRNA,1.7kb缺陷病毒，必须有HBsAg第三十九页，共六十四页。HDAg：仅用于研究抗-HDIgM：(＋)近期感染抗-HDIgG：(＋)感染HDVRNA：仅用于研究HDV病原学检测仅在HBsAg阳性人群中检测才有意义：第四十页，共六十四页。戊型肝炎病毒HEV属于familyHepeviridae,genusHepevirusHEV,30-32nm无包膜：抗原种类少新的HEV发现：兔HEV－－王佑春等第四十一页，共六十四页。HEV基因及其蛋白ORF1ORF3？ORF25’3’核衣壳Capsid非结构蛋白结构蛋白主要抗原决定簇中和免疫459607核酸：单链正义RNA，7.2kb第四十二页，共六十四页。02468101214转氨酶升高期症状期IgMIgG病毒血症大便排病毒抗戊肝抗体浓度感染后周数HEV感染后人体抗体应答－－与HAV类似抗-HEVIgM：感染后～3周即可阳性，1-3月后转阴，近期或急性感染。抗-HEVIgG：IgM产生后数天即可阳性，存在数十年，单纯阳性很可能是既往感染，故单独检测抗-HAVIgG通常不用于诊断。第四十三页，共六十四页。HEV抗原：一般不开展，仅用于研究HEV病原学检测－－与甲肝类似抗-HEVIgM：(＋)近期感染抗-HEVIgG：双份血清HEVRNA：一般不开展，仅用于研究第四十四页，共六十四页。HEV病原诊断－－抗-HEV同时检测抗HAVIgM和IgG时：4种情况仅检测抗-HEVIgM时戊型肝炎抗-HEVIgM阳性抗-HEVIgG阳性戊型肝炎1.2.既往感染，对戊肝有免疫力排除戊肝，而且为易感者抗-HEVIgM阴性抗-HEVIgG阳性抗-HEVIgM阴性抗-HEVIgG阴性3.阳性阴性排除第四十五页，共六十四页。同时检测抗HAVIgM和IgG时：4种情况戊型肝炎早期或IgM假阳性1-2周后复查戊型肝炎戊型肝炎IgM假阳性排除戊型肝炎抗-HEVIgM阳性抗-HEVIgG阴性IgM阳性IgG阳性IgM阴性IgG阳性IgM阳性IgG阴性4.HEV病原诊断－－抗-HEV第四十六页，共六十四页。抗-HEV检测试剂质量差异很大(国外)方法种类抗原ORF来源病毒+血<6月9例+血>6月20例-血清22例1EIAR2昆虫巴基91802EIAR2昆虫缅甸92003WBR2昆虫缅甸9201[6]4WBR2,3大肠中国8190[1]5EIAR2大肠缅甸91906EIAR2,3大肠缅,墨51407EIAR2,3大肠缅,墨91708EIAR2,3大肠缅,墨614[1]09EIAS3－缅甸115[2]10EIAS2－缅甸7[1]3[6]011EIAS3－缅,墨22012EIAS2,3－缅,墨6100Hepatology1998;27:857-861.第四十七页，共六十四页。12种检测方法早期康复期血清抗-HEV滴度Hepatology1998;27:857-861.WBWB昆虫大肠杆菌合成肽第四十八页，共六十四页。抗-HEVIgG诊断试剂阳性率比较(国内外)厂商结果明确人群(符合率%)总符合率%230例普通人群(%)患者24例非患者30例万泰+23(95.83)1(3.33)96.3073(31.74)-1(4.17)29(96.67)高达+21(87.50)094.4440(17.39)-3(12.50)30(100)华美+21(87.50)1(3.33)92.5955(23.91)-3(12.5)29(96.67)GeneLab+16(66.67)085.1818(7.83)-8(33.33)30(100)科华+11(45.83)075.938(3.48)-13(54.17)30(100)不同试剂检测结果偏差很大，尤其在血清流行病学调查。中华实验和临床病毒学杂志2007;21(1):59-61.第四十九页，共六十四页。抗-HEVIgM抗-HEVIgG检测方法存在一定假阳性和假阴性第五十页，共六十四页。607-660ORF21-111458-607ORF3-EORF3-S112391123ORF36601主要抗原决定簇GeneLabs试剂的抗原，间接法JVirolMethods1992;38(1):175–86.包被抗原ORF2ORF31和2型、合成肽和细菌表达灵敏度和特异性低第五十一页，共六十四页。ORF2衣壳蛋白，72kDa国产抗-HEV试剂盒所用抗原万泰公司抗原：IgM，包被mu链，酶标抗原IgG，包被抗原，酶标二抗3946061660特异性高灵敏度较高458-607高达试剂：合成肽？同时包括了ORF2和ORF3多肽抗原，具体不详？首都公共卫生2007;1(4):168-170.华美公司和科华公司：第五十二页，共六十四页。灵长动物实验感染后抗-HEVIgM和IgG应答Yu,etal.CGLI2003第五十三页，共六十四页。急性戊肝病人抗-HEVIgM和IgG应答Seriwatana,etal.CGLI2002第五十四页，共六十四页。如何提高戊型肝炎诊断的准确性？急性HEV感染，发病时抗-HEVIgM和IgG通常同时阳性确诊同时检测抗-HEVIgG和IgMIgG＋IgM＋IgG－IgM＋IgG＋IgM－IgG－IgM－1－2周后复查排除既往感染IgG＋IgM＋IgG－IgM＋IgG－IgM－确诊假阳性假阳性第五十五页，共六十四页。Ch1374(Sar-55,I)A450Ch1375(Sar-55,1)458-6071660112-6070.00.53.03.50246810131517112-607458-607475-607475-607Ch1374(Sar-55,1)感染后周数感染后周数0.00.51.01.52.02.53.03.50246810131517112-607458-607475-607A4501.01.52.02.5利用抗原主要决定簇多肽的高反应性检测阳性标本利用抗原主要决定簇截短肽的无反应性排除假阳性如何提高戊型肝炎诊断的准确性？第五十六页，共六十四页。表达载体HEVORF21660459459607594ORF2多肽的蛋白表达472607将重组质粒导入大肠杆菌第五十七页，共六十四页。123123123459-607459-594472-607kDa362216ORF2多肽大肠杆菌表达ORF2多肽SDS电泳结果第五十八页，共六十四页。459-607459-594472-607459-607459-594472-607kDa36221650二聚体单体SDS加样缓冲液煮沸5min不加热