光谱分析技术(好资料)课件

光谱分析技术光学导论光谱：复色光经色散系统分光后，按波长（或频率）的大小依次排列的图像光学导论基于测量物质的光谱而建立起来的分析方法称为光谱分析法吸收光谱发射光谱分子光谱原子光谱光学导论发射光谱化学发光热/电激发发光光致发光光学导论光谱分析法的准确分类分子光谱

吸收（根据吸收波段不同细分）

紫外-可见

红外

发射（根据发射原理不同细分）光致发光：荧光、磷光

化学发光光学导论光谱分析法的准确分类原子光谱

吸收

发射（根据发射原理不同细分）热/电激发发光：发射光致发光：荧光光学导论光谱分析≠光学分析！光学分析=光谱分析+非光谱分析

非光谱分析：基于物质与辐射的相互作用，测量辐射的某些性质，如折射、散射、干涉、衍射和偏振等变化的分析方法光学导论光的本质：电磁辐射、波粒二象性波波长λ、频率γ、速度υυ=γλc

(真空中的υ)=3×108m·s-1波长λ：相邻两个波峰或波谷间的直线距离单位可以是nm、μm、cm、m频率γ：在1秒时间内经过某点的波数（即每秒内振动的次数）单位Hz(s-1)周期T：频率的倒数；波数σ：波长的倒数光学导论波长λ5×10-3～0.10.1～1010～200200～400名称γ射线x射线远紫外光近紫外光波长λ400～750750～1.0×1061.0×106～1.0×1091.0×109～1.0×1012名称可见光红外光微波无线电波吸收光谱发射光谱光学导论某分子的外层价电子从基态跃迁到激发态需要20eV，请问该分子吸收光的波长？解：1eV=1.602×10-19J根据公式Ｅ=hc/λ则λ=hc/Ｅ=（6.626×10-34×3×108）/（20×1.602×10-19）=0.62×10-7m=62nm紫外-可见分光光度法什么是紫外-可见光谱远紫外光区：10~200nm近紫外光区：200~400nm

UVC：200~280nmUVB：280~320nmUVA：320~400nm可见光区：400~780nm红外光区：780nm~1mm什么是紫外-可见分光光度法基于分子外层价电子跃迁产生的在紫外-可见光谱区的吸收光谱进行分析的一种常用的光谱分析方法。ultravioletandvisible(UV-vis)spectrophotometry分子能量的变化：

E=Ee+Ev+ErEe>Ev>Er基本原理基本原理分子吸收光（电磁波）后产生的能量的变化：远红外光谱（转动光谱）中红外光谱（振动光谱）紫外-可见光谱（电子光谱）基本原理价电子σ电子→饱和的单键

π电子→不饱和的双键、三键n电子→孤对电子分子中分子轨道有成键轨道与反键轨道：它们的能级高低为：σ<π<n<π*<σ***n非键轨道反键轨道反键轨道成键轨道成键轨道→*n→*→*n→*>>>COHnpsH

1.σ→σ*跃迁：饱和烃（C-C，C-H）能量很高，λ<150nm2.n→σ*跃迁：含杂原子饱和基团（-OH，-NH2）能量较大，λ150~250nm3.π→π*跃迁：不饱和基团（C=C，C≡C）能量较小，λ~200nm共轭体系，E更小，λ>200nm4.n→π*跃迁：含杂原子不饱和基团（C≡N，C=O）能量最小，λ200~400nm基本原理朗伯-比尔定律——定量分析的基础当强度为I0的一定波长的单色入射光束通过装有均匀待测物的溶液介质时，该光束将被部分吸收Ia，部分反射Ir，余下的则通过待测物的溶液It，即有：I0=Ia+It+Ir朗伯-比尔定律如果吸收介质是溶液（测定中一般是溶液），式中反射光强度主要与器皿的性质及溶液的性质有关，在相同的测定条件下，这些因素是固定不变的，并且反射光强度一般很小。所以可忽略不记，这样：I0=Ia+It朗伯-比尔定律透光率——透光率表示透过光强度与入射光强度的比值，用T来表示，计算式为：T=It/I0T常用百分比（%）表示。吸光度——透光率的倒数的对数叫吸光度。用A表示：A=-lgT=lg(I0/It)当用一束强度为I0的单色光垂直通过厚度为b、吸光物质浓度为c的溶液时，溶液的吸光度正比于溶液的厚度b和溶液中吸光物质的浓度c的乘积。朗伯-比尔定律IoItbaA=lg(I0/It)

=Kbc朗伯-比尔定律吸光系数：当溶液浓度c的单位为g/L,溶液液层厚度b的单位为cm时，K叫“吸光系数”，用a表示，其单位为L·g-1·cm-1摩尔吸光系数：当溶液浓度c的单位为mol/L，液层厚度b的单位为cm时，K叫“摩尔吸光系数”，用ε表示，其单位为L·mol-1·cm-1

ε=aM

(M为吸光物质的分子量)工作原理基仪器结构框图光源碘钨灯氘灯单色器测量池参比池样品池光电倍增管数据处理和仪器控制光源样品池单色器检测器数据处理仪器控制紫外-可见分光光度计紫外-可见分光光度计单光束分光光度计双光束分光光度计紫外-可见分光光度计吸收池的材料玻璃360nm2.25mm紫外-可见分光光度计石英200nm2.5mm紫外-可见分光光度计吸收池的形状可拆卸圆形测量池两面透光圆形测量池两面透光1cm长方形测量池两面透光气体测量池两面透光微量测量池两面透光流动测量池两面透光紫外-可见分光光度计思考题为什么紫外可见分光光度计的最大吸收值只能到3或者5，超过该值便会造成数据溢出？

生物分子的紫外-可见吸收光谱糖紫外可见光谱在糖的分析中,主要作定量检测。最大吸收波长为218nm,多糖最大吸收波长为206nm。○

生物分子的紫外-可见吸收光谱脂脂肪○○230~240nm,于有机溶剂中（如乙醇、正己烷等）类脂维生素A326nm于乙醇番茄红素番茄红素在溶剂正己烷中的谱图番茄红素在溶剂石油醚中的谱图生物分子的紫外-可见吸收光谱

生物分子的紫外-可见吸收光谱蛋白质Proteinsinsolutionabsorbultravioletlightwithabsorbancemaximaat280and200nm.Aminoacidswitharomaticringsaretheprimaryreasonfortheabsorbancepeakat280nm.Peptidebondsareprimarilyresponsibleforthepeakat200nm.酪氨酸

色氨酸

苯丙氨酸生物分子的紫外-可见吸收光谱核酸嘌呤和嘧啶在250～280nm有强的吸收作用，综合起来在260nm吸收值最大。Tips：1.吸收强度：单核苷酸>单链DNA>双链DNA（增色效应、减色效应）2.A260/A280＝1.8～2.0，DNA较纯A260/A280

<1.8，DNA样品中含有蛋白质A260/A280>2.0，DNA样品中含有RNA微生物的紫外-可见吸收光谱600nm测细菌等微生物的浊度，用于估计细菌的生长情况。比如，得到的OD600的数值如果在0.6-0.8之间，表明细菌处于旺盛生长的对数生长期，OD600>3表明细菌已经饱和等。核酸蛋白测定仪EppendorfBioPhotometerplus

ELISA原理图YY

①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）

②酶标记的抗原或抗体（标记物）③酶作用的底物（显色剂）酶标仪酶标仪TecanInfinite®200Pro多功能酶标仪ELISA分子荧光光谱什么是荧光光谱某些物质经紫外-可见光照射后，能立即放出能量较低（亦即波长较长）的光——光致发光。当照射停止后，如化合物的发射在10-9秒钟内停止，则称荧光(fluorescence);超过此限度即称为磷光(phosphorescence)。什么是荧光光谱基本原理Ee0Ev0Ev1Ev2Ev3Ev4Ee1Ee2荧光发射：当分子处于单重激发态的最低振动能层时，去活化的一种形式是以10-9~10-7s左右的短时间内发射光子返回基态，这一过程称为荧光发射。激发光谱激发光谱固定荧光发射波长，扫描激发波长荧光激发光谱与紫外-可见吸收光谱类似，Why？横坐标是入射光（激发光）的波长，纵坐标是发射光（荧光）的强度发射光谱固定激发光波长，扫描发射波长横坐标是发射光（荧光）的波长，纵坐标是发射光（荧光）的强度发射光谱(荧光光谱)2.三维荧光光谱IF

∝f(λex、λem)蒽的激发光谱固定发射波长、扫描激发波长IF

∝f(λex、λem)蒽的发射光谱固定激发波长、扫描发射波长蒽的三维等高线光谱图蒽的三维等荧光强度光谱荧光量子产率（荧光效率）kF为荧光发射过程的速率常数，取决于荧光物质的分子结构；Ki为其他过程（如振动弛豫等）的速率常数总和，主要取决于化学环境，同时也与荧光物质的分子结构有关。荧光与有机化合物的结构1.π*→π是有机化合物产生荧光的主要跃迁类型。2.产生荧光的有机物质，都含有共轭双键体系，共轭体系越大，荧光越容易产生。产生荧光的条件荧光物质的刚性和平面性增加，有利于荧光发射。3.刚性平面结构荧光与有机化合物的结构荧光强度与浓度的关系荧光的淬灭荧光淬灭：荧光分子与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起荧光强度降低或消失的现象。荧光淬灭剂：这些溶剂分子或其它溶质分子称为荧光淬灭剂（如卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基/羰基/羧基化合物等）。荧光能量共振转移（FRET）能量共振转移（FRET）FluorescenceResonanceEnergyTransfer相互作用的研究荧光分光光度计光源氙灯激发单色器样品池光电倍增管数据处理仪器控制光源样品池激发单色器检测器数据处理仪器控制发射单色器发射单色器问题：荧光分光光度计与紫外-可见分光光度计有何异同点？紫外-可见分光光度计:光源样品池单色器检测器数据处理仪器控制荧光(磷光)分光光度计:光源样品池激发单色器检测器数据处理仪器控制发射单色器荧光分光光度计样品池1.样品池的材料：与紫外-可见分光光度计的吸收池一样2.吸收池的形状：紫外-可见分光光度计的吸收池两面透光荧光分光光度计的样品池四面透光问题：紫外-可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计的样品池有什么区别？荧光分光光度计紫外-可见分光光度计

测量池(吸收池)荧光分光光度计样品池I0ItI0ItIF,p荧光分光光度计荧光光谱的应用芳香族化合物存在共轭的不饱和体系，是有机化合物荧光测定的主要类型。1.有机化合物的鉴定荧光光谱的应用2.分子标记与追踪在生物学研究中，科学家们利用能发光的荧光分子对生物体进行标记。将荧光分子通过化学方法“挂在”其他“不可见”的分子上，原来不可见的部分就变得可见了。生物学家利用这种标记方法，把原本透明的细胞、细胞器或生物分子从黑暗的显微镜视场中“揪出来”。

量子点（无机纳米粒子）荧光染料（有机小分子）荧光蛋白（蛋白质）荧光光谱的应用2.1荧光在核酸研究中的应用——电泳MidoriGreenEthidiumbromide荧光光谱的应用SYBRGreenI2.2荧光在核酸研究中的应用

实时定量荧光PCR（RT-qPCR）2.3荧光在核酸研究中的应用—分子信标荧光光谱的应用Taq-Man荧光光谱的应用2.4荧光在蛋白质研究中的应用几种含苯基侧链的氨基酸可以发出荧光，且受微环境变化的影响，因此可用于作为内源荧光探针来研究蛋白质构象。荧光光谱的应用2.5ELISA中的“荧光”荧光光谱的应用下村修等人于1962年在一种学名为Aequoreavictoria的水母中发现能发光的蛋白——绿色荧光蛋白（green