细菌内毒素经典简介及检测方法

关于细菌内毒素经典简介及检测方法第1页，共34页，2022年，5月20日，19点21分，星期五内容基本概念实验方法操作注意事项第2页，共34页，2022年，5月20日，19点21分，星期五一、概念及相关知识热原反应：病人在静脉给药15分钟后发生冷感、寒战、发热、头痛、恶心、呕吐、昏迷、休克等症状。热原：任何可以导致肌体发热的物质。机理：外源性热原质通过内源性热原质起作用。外源性热原质吞噬性白细胞内源性热原质体温调节中心发热新蛋白合成新mRNA翻译第3页，共34页，2022年，5月20日，19点21分，星期五1942年，美国药典首次收载热原检查法，中国药典自第一版（1953年版）起收载。所有注射用药品（肌肉注射、静脉注射）都要经过热原检查。热原检查法的局限性：

1、重现性差。

2、对药物引起的增加、抑制作用无法控制。

3、不同细菌产生的热原质的致热域有差别。

4、非定量反应。虽然不排除有其他热原物质存在，但细菌内毒素是最主要的热原物质。第4页，共34页，2022年，5月20日，19点21分，星期五细胞壁结构：肽聚糖脂蛋白革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌外膜细菌细胞壁外膜中的脂多糖（LPS）。当细胞磷壁酸脂多糖细菌内毒素：革兰氏阴性壁外膜结构完整时不具备生物活性，只有当细菌死亡，脂多糖脱落才显示出内毒素活性。脂多糖结构：多糖O抗原＋核心多糖＋类脂A致热活性部分第5页，共34页，2022年，5月20日，19点21分，星期五内毒素的量值：1、内毒素单位（EU）

1982年FDA将当时美国代号为EC－2的内毒素标准品规定为5EU/ng。1983年内毒素单位（EU）被USP正式引用。2、国际单位（IU）

WHO先后两次组织协作标定，建立内毒素国际标准品，其中第二批内毒素国际标准品适用于所有内毒素检查法，且明确1IU＝1EU。第6页，共34页，2022年，5月20日，19点21分，星期五鲎：一种古老的栖身于沿海的海洋生物，节肢动物门，在我国主要分布于浙江、福建及两广的沿海一带。鲎试剂：利用鲎血液中的变性细胞，经裂解液和机械方式促使细胞破裂而提取到的一种细胞溶解物，能与极微量的细菌内毒素形成特异凝胶反应，反应的速度和凝胶的坚固程度与内毒素浓度有关，是体外检测内毒素的敏感试剂。第7页，共34页，2022年，5月20日，19点21分，星期五第8页，共34页，2022年，5月20日，19点21分，星期五鲎试剂与内毒素反应机理内毒素C因子活化的C因子凝胶B因子凝固酶原凝固酶活化的B因子凝固蛋白原鲎凝血系统－酶联反应第9页，共34页，2022年，5月20日，19点21分，星期五细菌内毒素检查法

凝胶法浊度法光度法显色基质法重现性好能定量能控制药物的增强/抑制干扰操作简便。节省时间方法分类方法特点第10页，共34页，2022年，5月20日，19点21分，星期五二、细菌内毒素检测之凝胶法实验程序1、试验准备：试剂、仪器及用具2、选择鲎试剂灵敏度，计算样品稀释度3、鲎试剂灵敏度复核4、供试品干扰试验（新药或新方法）5、供试品内毒素限量检查第11页，共34页，2022年，5月20日，19点21分，星期五实验材料及用具1、仪器名称要求天平感量0.1mg以下电热干燥箱～300℃恒温水浴箱37±1℃水银或酒精温度计～100℃±1℃漩涡混合器/计时器60min±1min2、器具器具分类器具名称反应试管玻璃试管（外径10×75mm）、试管架、小三角瓶或磨口瓶移液器具刻度吸管及洗耳球或移液器及无热原吸头其他酒精灯、脱脂棉球、镊子、剪刀、砂轮、封口膜、记号笔第12页，共34页，2022年，5月20日，19点21分，星期五试剂1、鲎试剂：具有国家颁发的批准文号2、内毒素工作标准品3、内毒素检查用水4、三效热原灭火剂5、75％乙醇常用英文缩写BET：细菌内毒素检查BET水：细菌内毒素检查用水MVD：供试品最大有效稀释倍数NC：阴性对照MVC：供试品最低有效浓度PC：阳性对照λ：鲎试剂灵敏度L：供试品细菌内毒素限值第13页，共34页，2022年，5月20日，19点21分，星期五灵敏度复核试验：每批鲎试剂用于检测前都必须进行灵敏度复核。试验举例：内毒素工作标准品为100EU/支；待测鲎试剂灵敏度λ＝0.25EU/ml。1、制备内毒素标准溶液：取工作标准品一支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈出划痕，用75％酒精擦拭后启开，加1mlBET水溶解，封口膜封住，置漩涡振荡器上混匀15min后进行稀释，步骤如下(箭头下方为加入BET水量)：100EU/ml10EU/ml1EU/ml0.5EU/ml0.25EU/ml0.125EU/ml0.0625EU/ml0.2ml1.8ml0.2ml1.8ml0.9ml0.9ml0.9ml0.9ml0.9ml0.9ml0.9ml0.9ml第14页，共34页，2022年，5月20日，19点21分，星期五0.2ml0.2ml0.9ml0.9ml0.9ml0.9ml水水溶解后的标准品水水水水100EU/ml10EU/ml1EU/ml0.5EU/ml0.25EU/ml0.125EU/ml0.0625EU/ml（2λ）（λ）（0.5λ）（0.25λ）第15页，共34页，2022年，5月20日，19点21分，星期五2、溶解鲎试剂：若鲎试剂为0.1ml装量，则取18支，每支加入0.1mlBET水溶解；若鲎试剂装量大于0.1ml，则取若干支，按标示量加入BET水溶解，再取0.1ml分装于标准玻璃试管（10mm×75mm），将试管按如下形状排列。3、加样：每列每支加入相应浓度的内毒素标准品溶液各0.1ml，第五列加入BET水0.1ml。12λ2λ30.5λ40.25λBET水2λ2λ2λ2λλλλλ0.5λ0.5λ0.5λ0.5λ0.25λ0.25λ0.25λ0.25λ第16页，共34页，2022年，5月20日，19点21分，星期五反应及结果判断：加样结束后用封口膜封口，轻振动混匀，置37℃水浴中保温60±2min，将每管拿出缓缓倒转180°，凝胶不变形为“＋”，凝胶不能保持完整为“－”。当2.0λ四支管都为阳性，0.25λ四支管都为阴性时，试验成立，按下面底公式计算复核的灵敏度λc

：

λc＝lg-1(∑X/4)（X:反应终点浓度的对数值。）

当0.5λ≤λc≤2.0λ时，鲎试剂灵敏度复核合格，检测时仍以标示灵敏度λ为准。第17页，共34页，2022年，5月20日，19点21分，星期五举例：设待复核的鲎试剂标示灵敏度λ为0.125EU/ml:平行管数内毒素标准溶液浓度（EU/ml）NC反应终点浓度CX(lgC)0.250.1250.060.031+++--0.06-1.222++---0.125-0.9033++--/0.125-0.9034++--/0.125-0.903λc＝lg-1(∑X/4)

＝lg-1｛［（-1.22）＋（-0.903）＋（-1.22

）＋（-1.22

）］/4｝＝0.104（EU/ml）

λc在0.5λ～2.0λ范围内，符合规定。第18页，共34页，2022年，5月20日，19点21分，星期五样品内毒素检查1、供试品最大有效稀释倍数的计算：

C·LMVD＝

λλ：测试用鲎试剂灵敏度标示值(EU/ml)。L：供试品细菌内毒素限值。C：供试品浓度或供试品复溶后所得样品浓度。当L单位为EU/ml（溶液）时，C的单位为1ml/ml；当L单位为EU/mg或者EU/u时（抗生素原料），C的单位为mg/ml或者u/ml。第19页，共34页，2022年，5月20日，19点21分，星期五2、供试品溶液稀释：将供试品稀释，稀释倍数为MVD。含2λ内毒素标准品的供试品溶液（PPC）的制备：3、加样：取鲎试剂8支，每支加入BET水0.1ml溶解。2支为样品管，加入样品液0.1ml；2支加入阴性对照管，加入BET水0.1ml；2支为阳性对照管，加入22λ浓度的内毒素标准品溶液0.1ml；2支为样品阳性管，加入0.1ml含2λ内毒素标准品的样品溶液。

37±1℃水浴中保温60±1min。稀释0.5MVD倍的供试品1.0ml4λ浓度的内毒素标准品溶液1.0ml＋混合含2λ内毒素的供试品溶液第20页，共34页，2022年，5月20日，19点21分，星期五示意图：结果判断：

阳性对照为阳性阴性对照为阴性试验结果成立样品阳性对照为阳性

2支样品管均为阴性时，样品符合规定；

2支样品管均为阳性时，样品不符合规定；样品管1支为阳性1支为阴性时，需复试。复试时做4支样品管，有1支为阳性则样品不符合规定。样品阳性阴性样品阳性第21页，共34页，2022年，5月20日，19点21分，星期五例：硫酸庆大霉素注射液规格：4000U/ml内毒素限值L：参考兽药典“每1000庆大霉素单位含内毒素的量应小于0.5EU”，即

L＝0.5EU/1000U=0.0005EU/U鲎试剂标示灵敏度λ：0.125EU/U供试品最大稀释倍数

C·L4000U/ml×0.0005EU/UMVD＝＝＝160（倍）

λ0.125EU/U第22页，共34页，2022年，5月20日，19点21分，星期五供试品溶液制备：含2λ内毒素标准品的供试品溶液的制备：取500U/ml的样品溶液1.0ml＋0.5EU/ml的内毒素标准品溶液混合。供试品4000U/ml1000U/ml500U/ml250U/ml0.4ml3.6ml1.0ml3.0ml2.0ml2.0ml2.0ml2.0ml稀释10倍稀释40倍稀释80倍稀释160倍用量多第23页，共34页，2022年，5月20日，19点21分，星期五结果判断：结果判断样品管阴性对照阳性对照样品阳性对照符合规定－－－－＋＋＋＋不符合规定＋＋－－＋＋＋＋需复试＋－－－＋＋＋＋符合规定－－－－－－＋＋＋＋不符合规定＋－－－－－＋＋＋＋第24页，共34页，2022年，5月20日，19点21分，星期五三、操作注意事项试验前准备：1、玻璃器具应规范化，便于除热原、计量准确、清洗操作方便。洗净去污去内毒素去洗涤剂精洗除外源性热原：250

℃干烤至少1小时。2、尽量用铝制器具和不锈钢用具，且用蒸馏水冲洗后250

℃干烤至少1小时。3、用于内毒素检测的稀释试管最好用玻璃试管；塑料用具只能为一次性且保证无内毒素。第25页，共34页，2022年，5月20日，19点21分，星期五实验环境：最好在洁净室或洁净工作台内进行，保证环境温度、湿度及通风稳定。实验人员：用适宜的洗涤剂洗手，用75％酒精棉球消毒，戴工作帽和口罩。实验过程：1、内毒素工作标准品应严格按要求低温保存；工作标准品开封后尽快使用且应一次性用完，不再保存。2、溶解后的标准品用封口膜封口后在漩涡振荡器上混匀15min；进一