DB15T 2690-2022青贮饲料中乳酸菌菌种的分离与保藏技术规程

ICS65.020.01CCSICS65.020.01CCSB25内蒙古自治区地方标准DB15/T2690—2022青贮饲料中乳酸菌菌种的分离与保藏技术规程TechnicalprotocolforisolationandpreservationoflacticacidTechnicalprotocolforisolationandpreservationoflacticacidbacteriastrainsinsilage2022-07-152022-08-15内蒙古自治区市场监督管理局发布前 言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由内蒙古农业大学提出。本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC19）归口。青贮饲料中乳酸菌菌种的分离与保藏技术规程范围本文件适用于青贮饲料中乳酸菌菌种的分离与保藏。（GB/T4789.28食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB20287农用微生物菌剂SN/T1538.1培养基制备指南第1部分：实验室培养基制备质量保证通则3术语和定义3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4基本原则应针对菌种的生物学性状选择分离与保藏方法。应使分离和保藏的菌种不染杂菌，使退化和死亡降到最低限度。应保证菌种分离和保藏的安全性，不能对周围环境造成污染和危害。5设备恒温培养箱：5℃～60℃。厌氧培养装置：5℃～60℃。振荡器：往复式。冰箱：4℃冰箱、超低温冰箱（-50℃～-86℃）。分析天平：感量0.001g。光学显微镜：4×～100×。均质器及无菌均质袋、均质杯或灭菌乳钵。水浴锅：0℃～100℃。超净工作台。试剂MRS。8.5g1000mL12130min。GB/T6682菌液制备以无菌操作称取10g样品置于盛有90mL无菌生理盐水的聚乙烯均质袋内，用拍打式无菌均质器拍打2min，制成1：10的样品菌液。菌液稀释用1mL（1:1019mL1→101→1×1011→1×102、1→1×103、1→1×104，1→1×105（）。菌种培养按照GB20287规定制备琼脂培养基，于高压灭菌锅灭菌后备用。选择2～3个适宜稀释度的样品菌液（20μL20μL3072h）。乳酸菌的分离与纯化1～2于MRS30℃恒温厌氧培养箱中培养48h～72h1。乳酸菌的筛选将分离纯化的乳酸菌菌液混匀并提取其悬液以6%的浓度接种至MRS培养基中，恒温培养（37℃）24h，期间每2h用紫外可见分光光度计测其在波长620nm的OD值，每个菌种均重复3次，最终将测定结果绘制生长曲线。3.0pH=6.5MRS（37℃培养24h2用pHpH3%MRS44℃培养10d，10℃与30℃培养3d，45℃培养7pH以及浓度为3.0%和6.5%NaCl的MRS30℃培养48620nmD0.小于D.，生长：0.5小于OD值小于0.1OD值小于0.2OD值大于1.0）493图1菌种分离及筛选程序BCA.2制法A.2制法100H至6.±01115in。附录A（）A.1MRS乳酸菌培养基见表A.1。表A.1乳酸菌培养基成分组成称取量蛋白胨10.0g牛肉粉5.0g酵母粉4.0g葡萄糖20.0g吐温801.0mLK2HPO4•7H2O2.0g醋酸钠•3H2O5.0g柠檬酸三铵2.0gMgSO4•7H2O0.2gMnSO4•4H2O0.05g附录B（）本方法广泛适用于细菌、放线菌、真菌等的短期保藏。原料））按照GB/T4789.28和SN/T1538.1执行。接种点接（）。用接种环从斜面中部自下而上划一直线。适用于细菌和酵母菌等。用接种环从斜面底部自下而上划稀“之”字形线。适用于易扩散的细菌，也适用于部分真菌。之”用接种铲挖取菌丝体连同少量琼脂培养基，转接到新鲜斜面上。适用灵芝等担子菌类真菌。（）挑取少量固体斜面菌种或用无菌滴管等吸取原菌液接种于新鲜液体培养基中。培养30℃～38培养好的菌种于4℃～6℃保藏，有些菌种（如：部分弧菌、假单胞菌等）4℃～6℃容易死亡，适于25℃室温保藏。培养好的菌种于4℃～6℃保藏，有些菌种（如：部分弧菌、假单胞菌等）4℃～6℃容易死亡，适于25℃室温保藏。通常相对湿度为50%～70%。B.4.5定期移植1～24～6（1～330～38附录C（）本方法适用于大多数需要长期保藏的细菌、真菌、放线菌、病毒等。原理60将2.0mL冻存管（圆底硼硅玻璃安瓶管或螺旋式塑料管）清洗干净，121℃高压灭菌15min～20min，备用。也可使用商品化的菌种保藏管。注意冻存管不能有裂纹。保护剂种类要根据微生物的类别选择，一般采用无菌的10%～20%甘油或脱脂奶粉，或10%二甲亚砜。5mm～10mm），真菌最好取菌落边缘的菌块，与保护剂混匀后加入冻存管内；1.2mm～2mm2d～10d将含菌种的冻存管插入保