法医物证学实验指导

法医物证学实验指导法医物证学教研室2009年编写实验须知一、实验目的①法医物证检验是法医学鉴定工作中的一项不可缺少的重要内容，在掌握了收集、采取和送验物证的基础上，进行物证检验，以达到鉴定的目的。②学习物证检验的基本操作(Basicoperation)技术和研究方法(Researchmethods),为今后从事法医工作打下良好的基础。③培养学生科学的思维方法和实事求是的工作作风，防止主观主义，草率从事。二、实验要求①实验前必须先预习，做到胸中有数，才能有条不紊的做好实验，获得较好的结果。预习的重点在于：实验目的、实验原理。实验的主要步骤及实验过程中应特别注意的问题。并计划好实验仪器及大致的时间分配，做到有计划。有步骤地做实验。②实验中要求操作正规，取试剂要准确。仔细观察实验现象，如实记录实验结果。养成认真细致，实事求是的科学态度，并联系有关理论进行分析，提出正确结论，写好实验报告。三、实验程序①准备工作⑴实验前要预习，做到胸中有数。(2)清点实验仪器(Instruments)和药品(Drug),如有短缺应报告教师补给。⑶清理实验桌面，有秩序地放好仪器和药品，实验中不用的书籍杂物不要放在实验台上。②实验操作⑴按指定的编组进行实验。实验时按讲义规定的顺序，用正规的操作方法进行操作。⑵如实验中需使用多种不同试剂时，注意分清各自的滴管。刻度吸管及试管等，各试剂的瓶塞滴管均不能混错，以免污染试剂。⑶在试验过程中，不能直接用手接触检材，以免污染。(4)每次实验均要写实验报告，并于当天交给指导教师评阅记分，作为平时成绩。③实验后的清理实验结束后，应将试剂瓶，公用吸管等排列整齐，未用完的抗血清应用胶布或胶塞封好瓶后，立即放回冰箱，将所用的仪器。玻璃器皿等洗净收好，整理桌面。值日生应负责打扫实验室，离开实验室之前要检查水、电、门、窗、是否关好。四、实验室规则①遵守课堂纪律，实验室内禁止抽烟吃零食，不许打闹，保持安静。不迟到，不无故缺课。②爱护仪器。尽量避免损坏，精密仪器必须在教师指导下严格按操作规程使用。节约使用抗血清等试剂及水电。③废液可倒入水槽(Gutter)并放水冲走，固体废物(包括血凝块(Includebloodclot))切勿倒入水槽，以免阻塞下水道。④仪器(Instrument)如有破损，应如实报告教师，填写破损登记表后补领。实验室内一切物品，未经教师同意不携出室外。⑤保护好实验台，防止强酸(Strongacid),强碱(Strongbase)和高温物品损坏台面，在整个实验过程中，必须时刻注意安全，以免发生意外。⑥学生实验中损坏的实验器皿(Experimentalcontainers)应折价赔偿。五、实验报告的书写格式㈠实验名称(Nameoftheexperiment)㈡实验H的(Purposeoftheexperiment)㈢实验原理(Experimentalprinciple)㈣实验仪器(Experimentalapparatus)㈤实验试剂(Reagents)伉)操作步骤(Steps)(-t)实验结果(Experimentresults)(A)分析讨论(Analysisdiscussion)W实验者及实验日期第一篇 玻璃仪器(Glasswareinstrument)的洗涤和使用实验目的.练习和掌握玻璃仪器(Glasswareinstrument)的洗涤方法。.复习吸管(Sucker)的使用。讲解、示教㈠玻璃仪器(Glasswareinstrument)的洗涤1.洗涤剂(Detergent)①肥皂水，去污剂(洗衣粉)为乳化剂，可降低油水之间的表面张力，使脂肪、蛋白质及其他污物溶解或脱落。常用于敞口的器皿及酶学检查所用器皿的洗涤。②堇铭酸钾(KChO,-H2sO,清洁液)配制：配制的方法：KzCmO7先溶于50ml水中，将500ml的H2sO,慢慢倒入KzCnCh溶液中洗涤时，主要是KzCrO?和H2s起作用，反应式如下：K2Cr2O7+4H2SO4-K2SO4+Cr2(SO4)2+4H?O+3⑼所产生的3分子[0],其氧化力很高，另外H2sO’也能使很多物质溶解下来。③Na3Po4一般配成5%的Na3PCM碱性)，可清洗油污。@乙二胺四乙酸二纳(EDTA-Na?)为一络合剂，可使玻璃器皿(Glassware)上的金属离子以络合物的形式脱离下来。一般配成5—10%的浓度。⑤盐酸 酒精(Hydrochloricacid——Alcohol)用于去除器皿上的染料，一般配成3%的浓度。⑥其他硝酸：用于去除水银。王水：用于洗去所有金属盐。尿素：用于清洗蛋白质。实验中最常用的是⑴、⑵两种。2.玻璃仪器(Glasswareinstrument)的洗涤①•般玻璃仪器(Glasswareinstrument)如试管(Testtube)、烧杯(Beaker)、锥形瓶(Erlenmeyerflask)等容量要求不严格的器皿。先用自来水洗刷至无污物，再选用大小合适的毛刷沾取洗衣粉或肥皂水，将器皿内外壁细心刷洗，再用自来水冲洗干净，洗至容器内壁光洁不挂水珠即可，最后用蒸播水冲洗2—3次，放于清洗处待水滴干后，放入烤箱内(100—125℃)烤干，停烤后不要立即打开烤箱门，防止温差造成玻璃器皿(Glassware)的爆炸。②容量分析仪器(Capacityoftheinstruments)如吸量管(Pipette)、滴定管(Burette)。量瓶等。使用后立即浸泡于凉水，勿使物质干涸，并及时用流水冲洗干净，然后再用重铝酸钾(PotassiumDichromate)清洗液浸泡数小时，用自来水反复冲洗干净，最后用蒸储水冲洗2—3次，凉干或放入37C孵箱中干燥(移液管(One-markpipette)、容量瓶(Measuringflask)及结构复杂的器皿严禁烤干)。③沉降管沉降管使用后应用吸管逐管冲洗，然后每管内加入清洁液(不要有气泡)，24小时后逐管吸出清洁液，放回清洁槽(或瓶)内，再用自来水、蒸储水冲洗沉降管，甩干水份，放入烤箱内烤干。㈡吸管的种类和使用：.种类(1)移液管(大肚吸管)(One-markpipette)属单标吸管，放液时管尖的残余液体不得吹出。(2)奥氏吸量管属单标吸管，放液时管尖的残余液体必须吹出至容器内。(3)多刻度吸量管①普通吸量管：直筒状，有多种不同规格，刻度方法有自上而下和自下而上两种，每种刻度法又有刻度到尖端和刻度不到尖端两种。刻度到尖端者，使用时必须把管尖残留液体吹入容器内(一般注有“吹”字)，刻度不到尖端者，管尖残留液体不要吹出。当液体不再流出时,应将管尖在容器内壁上停15—30分秒，同时转动吸量管。②莫氏吸量管：总量刻度在尖端以上，放液体时按刻度进行。.吸量管的使用(复习)㈢离心机(Centrifuge)的使用(复习).离心机(Centrifuge)的种类。.离心机(Centrifbge)的使用方法。.离心机(Centrifuge)使用的注意事项。第二篇 血型检验(Bloodtest)一、新鲜血液红细胞血型测定(Determinationofbloodtypefreshblood)(-)ABO血型测定(ThetestofABObloodgroup)实验目的①掌握ABO血型(ABObloodgroup)测定方法。②掌握红细胞混悬液(Erythrocytesuspensions)的制备方法。③熟悉红细胞凝集现象(Erythrocyteagglutination),能根据实验结果准确判定血型(Bloodgroup)o实验原理正常人类红细胞表面含彳/ABO型抗原(ABOantigens),而血清(Serum)中含有其相应的抗体(Antibody)。采用标准抗A、抗B血清和标准A型、B型红细胞来与待测的血液红细胞或血清(Serum)作用，观察是否有凝集反应(Agglutination)出现，而判断血型(Bloodgroup)。用标准抗血清检验红细胞的抗原(Antigen)为正定型。用标准A型和B型红细胞检测血清中的抗体为反定型。在实际工作中将两者结果相互对照以便获得准确的结果。实验仪器白瓷板、试管(Testtube)、试管架(Testtubeholder)、离心机(Centrifuge)、显微镜、刺血针、消毒用品、滴管、玻璃铅笔、天平(Balance)。实验试剂.标准抗A及抗B血清。.生理盐水。操作方法.红细胞混悬液(Erythrocytesuspensions)的制备⑴取生理盐水约2ml放入小试管内。(2)用酒精(Alcohol)棉球消毒手指，待酒精(Alcohol)蒸发干后，用消毒针头刺入适当深度，即有血液流出，然后用滴管取3滴血放入装有生理盐水的试管内，混匀。⑶在天平上配平，即另取一小试管盛水，作平衡管。在天平上平衡。然后把试管放入离心机中相对应的位置上，以2000rpm的速度离心一分钟弃去上清液，这样反复洗涤三次后。弃去上清液。(4)取1滴压积红细胞(Hematocritredbloodcells),加49滴生理盐水，配成2%的红细胞混悬液(Erythrocytesuspensions),或取1滴压积红细胞(Hematocritredbloodcells),加99滴生理盐水，配成1%的红细胞混悬液(Erythrocytesuspensions)».ABO型血型(ABObloodgroup)正定型 凝集原测定(Agglutinationoftheoriginaldetermination)A.试管法(Tubemethod)(1)取二支试管分别标明“A”、“B”。⑵按标记分别加入抗A、抗B血清各1滴。(3)分别加入2%的被测红细胞悬液(Erythrocytesuspensions)1滴。(4)混匀，以lOOOrpm的速度离心1分钟。⑸轻摇试管，使管底沉降的红细胞悬浮，观察并记录结果。如阴性结果室温中静置30分钟，再离心观察结果。B.玻片法(Slidemethod)(1)在玻片两端分别标明“A”、"B”字样。⑵按标记分别加标准抗A、抗B血清各一滴。(3)各加•滴被检2%红细胞悬液(Erythrocytesuspensions)--滴。(4)室温下应左右旋转玻片，使之混匀：静置15分钟后，转动玻片观察结果，必要时可用显微镜核对。C.结果判定出现凝集块者为阳性；反之不出现凝集块则为阴性。凝集强弱的标准：++++呈一个大凝集块，无游离的红细胞，背景清亮。+++凝集块稍小，有小量游离红细胞，背景仍较清亮。++凝集块更小，有1/2的游离红细胞，背景较红。+凝集块呈细小沙粒状，游离红细胞更多，背景红。ABO血型结果判定——正定型抗A抗B血型判定——0+—A—+B++AB.AB0血型反定型一一凝集素的测定⑴试管法(Tubemethod).取二支试管，分别标明“A”、“B”。.分别加入2滴被测的人血清。.加1滴2%A型标准红细胞于A管中，力U1滴2%B型标准红细胞于B管中。.混匀，以1000转/分的速度离心1分钟。.轻摇，观察结果。⑵结果判定ABO血型判定一一反定型A型RBCB型RBC血型判定++0—+A+—B——AB⑶注意事项①阴性结果可在室温中静置30分钟，离心观察结果。②一般不用玻片法作ABO反定型，因为血清中的抗A、抗B抗体与标记红细胞作用,若不经离心，难以形成肉眼可见的凝集反应。㈡MN血型测定实验原理正常人类红细胞表面含有MN血型系统的抗原，用免疫制得的抗M,抗N血清与待测血液的红细胞作用，观察是否有凝集反应由现而判断血型。实验仪器同ABO型测定。实验试剂.标准抗M,抗N血清。.生理盐水。操作方法.试管法(Tubemethod)(1)取二支试管，分别标明“M”、“N”。⑵按标记，分别将抗M和抗N血清各一滴加入“M”和“N”管中。(3)在两管中各加2%被测红细胞混悬液(Erythrocytesuspensions"滴。混匀后以1000转/分离心1分钟。(4)离心后，轻轻摇动，观察结果。.玻片法①取一凹玻板，分别在两端标明“M”和“N”孔。②在两端各加抗M、抗N血清2滴。③于“M"、"N”孔中分别加入1%被检红细胞混悬液(Erythrocytesuspensions/滴。④左右旋转混匀，置室温(Roomtemperature)下10分钟内观察结果。.结果判定抗M抗N血型判定+——M—+N++MN㈢Rh血型测定(DeterminationofRhbloodgroup)实验原理Rh血型抗体(Rhbloodgroupantibodies)多是不完全抗体(Incompleteantibody).用不完全抗体(Incompleteantibody)来检测Rh血型抗原(Rhbloodgroupantigens)由于IgG分子量小，在生理盐水介质中不能使相应的RBC直接发生可见的凝集反应(Agglutination),只能使具有相应抗原的RBC致敏。因此，需要用清蛋白试验，酶法(Enzymatic)或抗人球蛋白试验(coombstest)进行测定，实验原理分述如下：清蛋白试验(Albumintest)的原理：清蛋白能提高介质的介电常数，使动电位减少，即降低电动势。从而使红细胞易于靠拢而促使RBC在抗体的作用下发生可见的凝集反应。酶法(Enzymatic)的原理：由于红细胞膜表面涎酸的竣基(-C00H)族电离后，使红细胞表面带上负电荷，从而使RBC不易与不完全抗体(Incompleteantibody)发生凝集反应(Agglutination)»若用蛋白水解随Protease(如无花果酶，番木瓜酶。菠萝蛋白酶。胰蛋白酶或神经氨酸酶等)处理RBC,使红细胞膜上的涎酸残其释放，则RBC表面的负电荷减少，动电位也减少。从而缩短了红细胞的间距，使红细胞能与不完全抗体发生可见的凝集反应。抗人球蛋白试验(coombstest)的原理：由于血型抗体本身是球蛋白，具有抗原性，它可以作为抗原来免疫动物而使之产生抗人球蛋白抗体(Anti-humanglobulinantibodies),在已被抗体完全致敏的红细胞中再加入抗人球蛋白抗体(Anti-humanglobulinantibodies)后，抗人球蛋白抗体(Anti-humanglobulinantibodies)即与吸附于RBC上的不完全抗体(Incompleteantibody)发生抗原抗体反应，尤如起一种搭桥的作用，使致敏的红细胞出现可见的凝集反应。实验仪器离心机、显微镜、试管、试管架、记号笔、天平、37℃恒温水箱。实验试剂.标准抗D、抗E、抗C、抗e、抗c血清。.抗人球蛋白(Coombs)血清。3.1%菠萝蛋白酶液(Thepineappleproteinaseliquid)»4.30%清蛋白液。5.生理盐水。操作方法.清蛋白试验(Albumintest)①取五只试管，分别标记上D、C、c、E、e字样，按标记分别加相应的抗D,抗C,抗c,抗E,抗e,血清各2滴。②每管各加待测血红细胞悬液(Erythrocytesuspensions)1滴。③混匀后，以lOOOrpm,离心1,观察是否出现凝集反应。④未出现凝集反应者，则每管各加2滴30%清蛋白，混匀，再次以lOOOrpm离心1分钟。取出试管，轻摇，观察并记录结果，出现凝集现象者为阳性反应。⑤根据试验结果判断出被测血之Rh血型。.酶法①取五只试管，分别标记上D、C、c、E、e按标记分别加相应的抗D、抗C、抗c、抗E、抗e血清各2滴。②每管各加待测血红细胞悬液(Erythrocytesuspensions”滴。③混匀后，立即离心lOOOrpml分钟，观察并记录结果。④未出现凝集反应者，则每管各加配好的1%菠萝蛋白酶液一滴，混匀后，置37C恒温水箱内放30分钟.⑤取出试管，以lOOOrpm离心1分钟，观察并记录结果。出现凝集现象为阳性反应。阳性结果表明被测红细胞上含有与抗体相应的抗原。.抗人球蛋白试管(Coombstest)①取五只试管，分别标记上D、C、c、E、eo按标记分别加相应的抗D、抗C、抗c、抗E、抗e血清各2滴。各管再加入一滴待测的红细胞悬液(Erythrocytesuspensions).混匀。②以lOOOrmp离心1分钟观察有无凝集反应。③未出现凝集反应，则将试管置37c水箱内放30分钟.④再以lOOOrpm离心1分钟，观察有无凝集。⑤无凝集者，则用盐水将试管内的红细胞离心洗涤3次。尽量弃去上清液，目的在于去除尚未结合在红细胞上的不完全抗体。⑥各管加入抗人球蛋白2滴，混匀以lOOOrpm离心1分钟，轻摇试管，观察并记录结果，出现凝集者为阳性反应。阳性结果表明被测红细胞上含有与抗体相应的抗原。二、唾液分泌状态测定实验目的学习和掌握和用中和试验(凝集抑制试验)测定唾液分泌状态的实验原理和操作方法。实验原理分泌型(Secretetype)人的唾液中含有与其红细胞ABO血型一致的水溶性血型物质。HAB血型物质能特异地与标准抗血清中相应的抗体结合，一旦抗体被结合后，该血清就不能再使相应的红细胞发生凝集，将唾液与标准抗血清作用后，再加入相应的指示红细胞，然后观察红细胞是否出现凝集反应，从而判断被检者的分泌状态及ABO血型。如所加指示红细胞不出现凝集，则为中和试验阳性，说明被检者为分泌型，如加入指示红细胞后，仍出现凝集,则为中和试验阴性，被检者为非分泌型。实验仪器试管、试管架、滴管、记号笔、离心机、烧杯。实验试剂.标准抗一A、抗一B血清和抗一H试剂。.已知2%A型、B型、0型红细胞生理盐水悬液。.生理盐水。.待测的唾液标本。操作方法.抗血清(Serumresistance)的标定(1)取24只康氏试管，分为三排，每排8只，分别标记上A、B、H,每管加2滴生理盐水，按标记分别将2滴抗一A、抗一B血清及抗一H试剂加入每排第一管中，作2—倍数系列稀释，最后一管弃去2滴，其稀释倍数为1:256。⑵每管加1滴相应的指示红细胞混悬液(Erythrocytesuspensions)混匀，A、B、H三排放入离心机，以lOOOrpm离心1分钟，观察结果，记录抗血清效价。⑶以凝集反应强度为++的最后一管的倍数稀释抗血清，此稀释液与相应指示红细胞发生的凝集反应为说明抗血清的标定和稀释是正确的，这样方可用于作中和试验。.唾液的采集和处理(1)唾液的采集：先嘱被检者嗽口后，使其流涎入大口玻璃瓶内，收集2-5ml,如要采集婴儿或幼儿唾液，可叫其喝水后，以棉球擦其口腔底部，直至被唾液湿透，然后将湿棉花的唾液挤出，用同一棉球反复几次，便可取得足量。⑵唾液的处理：唾液收集好后，立即在沸水中煮10分钟，使唾液中的血型分解酶灭活然后离心10分钟，1500rpm,取上清液备用。.中和试验(Neutralizationtest)(1)唾液的稀释取30只试管，分为三排，每排10只，分别标记上A、B和H与1-10的序号，用生理盐水将待测唾标本作2-4倍数系列稀释，共稀释三排，每排的稀释倍数为1:2—1:1024。(2)中和A排每管分别加2滴稀释好的抗一A血清。B排每管分别加2滴稀释好的抗一B血清。H排每管分别加2滴稀释好的抗一H试剂。室温下放置30分钟，使唾液中所含的血型物质充分中和血清中的相应抗体。⑶加指示红细胞A排各管加1滴2%A型红细胞悬液，混匀。B排各管加1滴2%B型红细胞悬液，混匀。H排各管加1滴2%O型红细胞悬液，混匀。A、B、H、三排加入指示红细胞后，放到离心机上离心，lOOOrpm离心1分钟，读结果。(4)结果判断不出现凝集反应者为中和试验阳性，被连续抑制3管以上者，可确定唾液中含有相应抗原。唾液稀释倍数2481632641282565121024结果判定A+++-H-BH++++++++++++-H-H-+-H-+++4-H-++-H-++-H4--I-H--H--4-H-A分泌型AB-H-H--H-H-4-H-+-H-+++-H-++-H-十-HH-++-H--H-B分泌型H++++-HH-4-H-ABH-H-H-卜+++-H-H--H-H-++++-F-H-l-+++++++-HH-+-H-+-H--H-4--H-+++++-H-++-H-+-H-++++-H--H-O分泌型A+++++-H-B+++++++AB分泌H+-++++-H-型三、人类白细胞抗原(HLA)的分型(HLA、A、B)位点实验原理用微量淋巴细胞毒试验法(Tracelymphocytespoisoningexperimentmethod|)。被检活淋巴细胞膜上的HLA抗原遇相应的HLA抗体可与之相结合(致敏)，在补体存在的情况下，可以破坏细胞膜。经过染色，使染料进入细胞而着色。在镜下计算着色细胞百分数,达一定标准以上，认为是阳性反应(存在相应的抗原)。实验器材大试管、小试管、小量筒、特制小玻璃套管、注射器、重复微量加样器、微量淋巴细胞毒反应板。白细胞计数盘、显微镜、离心机、毛细吸管。实验试剂(1)肝素钠抗凝液(Heparinsodiumanticoagulationliquid)肝素钠用生理盐水溶解，使每毫升液体含肝素钠200单位，经9磅15分钟的高压消毒，冰箱保存备用。⑵PBS原液氯化钠216克，磷酸二氢钠6克、氯化钾7克、磷酸氢二钠(2分子水)32.6克(若用1分子水的则用65.5克)。蒸储水加至1000ml,经9磅15分钟高压消毒，冰箱保存备用。使用稀释液取原液40m1,加蒸锵水至1000ml。(3)淋巴细胞分离液(Thelymphocyteseparationfluid)有市售比重为L077±0.002(18℃)的淋巴细胞分离液，也可用以下药品配制：泛影酸5.77g、葡甲胺183g,加蒸馀水至1000ml,调PH至7.0—7.2。菲可很icoll水溶性聚蔗糖)9g,加蒸储水溶解，调比重至1.020(20℃)。取1体积泛影酸、葡甲胺液加2.4体积菲可液，调比重至1.077(18℃),经高压消毒后保存冰箱备用。(4)淋巴细胞保养液(Lymphocytemaintainsfluid)10.5gRPMI1640(小行血清培养基)加双储水至1000ml,分装后保存于-20C。(5)白细胞计数稀释液(DilutionsWBCcount)1.5%醋酸溶液(含少许甲紫)。(6)5%曙红田0$亩)水溶液(7)中性Formalin液，0.5%酸红0.4ml加入福尔马林100ml中(8)补体6支以上兔新鲜血清，应无天然淋巴细胞毒，且补体活性良好。(9)HLA分型标准血清盘(10)抗淋巴细胞血清(Antilymphocyteserum)用人淋巴细胞免疫兔制得。(1D石蜡油(医用)淋巴细胞的准备(Lymphocytesofpreparation)(1)抗凝血的制备：取一试管盛大1.5ml肝素抗凝液，抽取被检查者静脉血液3ml,加入抗凝剂中，轻轻倒置试管，使其混匀。⑵加等量的PBS稀释抗凝血。(3)取二试管，每管装2ml与抗凝血比例为1:1.5的淋巴细胞分离液，将试管微倾斜，把稀释了的抗凝血小心地加于液面上(注意不要与分离液混合)。放入不平式离心机离心(1800转/分)20分钟(20℃)但注意在启动及关机时动作避免粗暴。(4)离心后，血液成份被分成数层，如下图。用毛细吸管把血浆及血小板层液体吸出弃去。小心地把淋巴细胞层(呈白色)混浊)吸至另一盛有数毫升PBS或淋巴细胞保养液的试管中(吸出时注意不要吸取棕多的分离液，因它含有单核细胞，其比例过大时会干扰试验结果。⑸混匀后，作第二次离心(1200转/分)离心10分钟后，弃去上清液，轻摇试管使细胞悬浮，再加入适量的PBS或保养液，混匀后作第三次离心，(900转/分)，离心8分钟，小心地把上清液弃去后，加适量的(0.2ml)淋巴细胞保养液(Lymphocytemaintainsfluid),并使细胞混匀。(6)淋巴细胞计数：取白细胞计数稀释液0.78ml于小试管内，加入淋巴细胞液0.02ml,混匀后，吸出少量滴入血细胞计数盘内。静置1-2分钟后，于低倍镜下计算计数盘上下左右四大格中淋巴细胞数，按下列公式计算：NX100=细胞数/I微升N=四大格细胞总数根据细胞数的量，用保养液调至每微升含淋巴细胞2000个。把此细胞悬液保存于4℃冰箱中备用。HLA抗血清反应板的准备(HLAresistanceofserumreactionplatepreparations)⑴微量淋巴细胞毒试验反应板一块(具72个凹孔，在两边上铸记有标记，如图，并附有盖玻片和板盖各一块)。ABCDE1OOOOOO2OOOOOO3OOOOOO4OOOOOO5OOOOOO6OOOOOO70OOOOO80OOOOO90OOOOO10OO0OOO11OO0OOO12OO0OOO图二⑵在反应板上每个凹孔中加石腊1小滴。⑶根据需要用微量加样器将抗HLA血清加入反应板(1A1B凹除外)的各凹孔中，每凹加抗血清1微升。1A孔加入1微升与手中已知HLA型标准淋细胞相对应的抗淋巴细胞血清作阳性反应对照孔，1B孔加入1微升PBS或保养液作阴性对照孔。(反应板中各抗血清的种类附表于后)。微量淋巴细胞毒试验(Tracelymphocytespoisoningexperiment)(1)取血清反应板一块(制备过程见上项)。（2）用微量重复加样器把分离计数好淋巴细胞悬液按顺序（1A-lFf2Ff2Af3A—3Ff……）加入反应板的每凹中。每凹加入1微升（含淋巴细胞2000个），要注意加入凹孔血清中。在室温（20-25℃）入置30分钟，让细胞与抗血清充分作用。⑶于反应板的各凹加入补体（兔血清）5微升，放置1小时（20—25℃。（4）于反应板的各凹内分别加入5%曙红3毫升，3分钟后，再加入中性甲醛（新配）5毫升（中性甲醛使反应终止并起固定的作用）。⑸盖上盖玻片，加上盖板，静止2小时，使细胞集于凹底，便于观察（制成的板，在1一2周内观察，结果不变）。（6）结果判定：将反应板放在显微镜的载物台上，对好凹孔，每凹孔底部的全部细胞能在一低倍（10X10）视野内观察到。观察次序与加样顺序相同，记录结果（见附表）。根据凹内死亡与活的细胞比例，判定阳性或阴性。①死活细胞的区别：电光源显微镜观察。死细胞呈浅红色，体积大。不折光，平坦，边界模糊。活细胞呈小球状，有强折光，发亮，体积正常，不染色。观察时转动细调旋钮，死活细胞易于区分。倒置相差显微镜观察：死细胞呈煤球状，灰黑色，体积略大而扁平。活细胞呈环状一圈或呈指环状，红亮。②根据细胞死亡的百分数，要用记分法来判定结果：死亡细胞的百分数记分结果判定0-101阴性11-202阴性可疑21-404弱阴性41-806阳性81-100注意事项8强阳性⑴抗血清：选择效价高的，交叉反应少，无脂肪及杂质的抗血清，否则会干扰结果。⑵补体：要选择无天然细胞毒性作用，补体活性好的,一般要将多只兔血清混匀后使用。⑶试验的反应时间：可视抗体及补体的情况而增减，加有许多抗血清的反应与反应时间有很大关系，如反应时间过长，则会出现交叉反映，时间恰好，则显示其特异性有特点或交叉反应减至最低程度，不会出现干扰。如反应时间过短，弱抗体的作用显示不出来，阳性变为阴性。（4）反应的温度：整个操作过程均应于20—25℃下进行。高于25℃,则淋巴细胞易死亡,低于15C时因抗血清中的冷抗体干扰结果，出现阳性。⑸淋巴细胞的纯度及数量：单核细胞的污染率高时易致假阳性。血小板数过大时，会大量吸附抗体出现假阴性。红细胞污染时会增加活细胞数量（低倍镜下无法区分）。同时会吸附补体使其活性下降。细胞数量的统一标准为1000—2000个/微升。细胞悬液中死细胞不能超过

10%。(6)中性甲醛的PH要准确，量也要够，否则会增加死细胞的数量。⑺加样时尽量不要把前一凹的材料带至后凹去，更不应漏加，否则结果不准确。附表：表中提到的抗血清是根据现有的数量而设计安排的，在不同凹孔中的相同的抗血清是来自不同的人或不同批量的血清。检测结果，被检测人是Al、AU、B8、B170管号抗血清种类结果管号抗血清种类结果管号抗血清种类结果1A阳性对照85AA28+AW3319AB5+18+BW351B阴性对照1BAW331BB5+18+BW351CA18CAW331CBW351DA18DB71DB88EA18EB71EB88FA21FB7+401FB1212FA216FB7+40110FB121EA21EB7+401EB121DA2+A281DB7+401DB151CA2+A281CB13+401CB151BA2+A281BB13+401BB151AAll8AB13+401AB513AAll87AB13+40111ABW161BAll8BB131BBW161CA11+A38CB131CBW161DA11+A38DBW601DB178EA31EBW601EB178FA31FBW601FB17+B584FA918FB5112FB51EA91EB51EB271DA91DB51DBW221CA101CB7+271CBW221BA101BB7+BW351BBW221AAW30+311AB7+BW351ABW221四、血清型(Serotype)的电泳检测㈠结合珠蛋白(Hp)表现型的测定——园盘电泳法实验目的⑴掌握电泳(Electrophoresis)的概念、基本原理以及分类。⑵掌握HP表现型测定的原理，基本操作步骤，结果测定。(3)学会使用园盘电泳槽(Electrophoresischamber)=⑷了解配制凝胶(jelly)的方法。电泳的理论基础：概念：生物大分子(蛋白质、核酸、多糖等)在一定的离子强度和电场的强度下，沿着与其所带电荷相反的方向泳动的过程。其迁移率与分子量大小、所带电荷多少、PH值等等有关。分类：(1)按照电泳槽形式：分水平电泳和垂直电泳(2)按照电泳原理分：移动界面电泳、区带电泳和稳态电泳(3)按照电泳系统均•性：连续电泳和不连续电泳(4)按照电泳凝胶中是否加入变性剂：变性电泳和非变性电泳电泳操作流程：样品的制备、*电泳 ►染色 *电泳 ►染色 ►结果的判断利用聚丙烯胺凝胶作电泳支持物，带有电荷和分子大小不一的蛋白通过浓缩效应、电荷效应、分子筛效应而被精细分离，可将血清分为12—25个组分，结合珠旦白具有特殊的分带。HP—Hb复合物各电泳区带可用显色剂——联苯胺(或邻联茴香胺)显示，读出其表现型。实验仪器电泳仪、园盘电泳槽、凝胶管、凝胶管架、腰穿针、微量进样器(20ul)、滴管烧杯(25ml、50ml)、刻度吸管(2ml、10ml)、洗耳球。实验试剂(1) 23.3%丙烯酰胺溶液(23.3%单体母液)丙烯酰胺22.8g -»加蒸储水至100ml(或Cyanogm23.3g加蒸储水至100ml)亚甲基双丙烯酰胺0.5g」(2)凝胶缓冲液PH=8.8三羟甲基氨基甲烷(Tris)0.057g。乙二胺四乙酸(EDTA)1.17g。⑶10%过硫酸胺(APS)50mgAPS加蒸储水至5ml。(4)5%蔗糖液⑸电极缓冲液：硼酸缓冲母液PH=9硼酸2.45g、硼砂15.25g、加储水至500mL临用时，取母液90ml,加蒸储水至1440ml或取母液18ml,加蒸储水至288ml。(6)配联苯胺用醋酸缓冲液PH=4.5无水醋酸钠16.48]»加蒸储水至1000ml冰醋酸11.6ml -⑺联苯胺染色液联苯胺0.2g ]甲醇15ml 4存于棕色瓶中4℃冰箱保存，临用时取50ml,加30%“过氧化氢”醋酸缓冲液200m#0.1ml约四滴(8)加速剂：四甲基乙二胺(TEMED)用原液Hb溶液配制①取新鲜抗凝血数毫升，加入4倍体积的生理盐水，以3000rpm的速度离心10分钟，洗涤四次。②于洗好的压积血球中加入等体积蒸偏水和1/2体积的甲苯摇匀后，放入冰箱过夜，使之完全溶血。然后以3000rpm的速度离心15分钟，用棉花吸去上层甲苯，用滴管插至管底吸取Hb液，用滤纸过滤后，放入4℃冰箱备用(此液可保存1个月)。操作方法.凝胶柱制备按凝胶管根数来计算试剂需要量试剂需要量凝胶管根数16812蒸储水(ml)1.06.08.012.0Tris-EDTA(ml)0.171.01.362.0423.3单位母液(ml)0.53.04.06.010%APS(pl)20.83125.0166.64249.96TEMED(gl)0.834.986.849.96混匀后，立即用滴管沿管壁缓慢加入凝胶管直至凝胶管高度7cm处，然后立即加入双蒸水于胶面上约0.5cm高，使两间有一清晰界面。室温放置30—60分钟，使凝胶聚合。.样品准备

（1）被检血清样品取血清一滴，力口2滴5%的蔗糖水溶液，用牙签蘸取50%的Hb液体加于血清中，混合使成樱红色为止，置室温10分钟使形成Hp—Hb复合物。（2）血痕的处理血痕检材0.25—1cm（不少于0.25cm2）剪细放入试管中，力口5%蔗糖溶液lOOul。•周内的血痕4'C冰箱中浸泡3小时。超过一周的血痕4℃冰箱过夜或浸泡2天，然后充分搅拌，尽力将检材中的液体挤出，除去检材残渣，力口1503氯仿振摇2分钟后以3000rpm的速度离心15分钟，可见试管中内容物分为三层:下层为氯仿层，上层为血痕液层，两层之间为薄薄一层的红棕色Hb,这是多余的或变性Hb,收集上层即含彳了HP-Hb复合物的液体备用，如上层液体还混浊，须作第二次离心。3加样⑴倒去凝胶柱上端的蒸储水，用滤纸吸去管垫周围的蒸播水，观察凝胶柱内有无气泡,凝胶面是否平整，有气泡或表面不平者都不能使用。⑵将合格的凝胶管插入电泳槽各孔，下槽先装电极缓冲液至槽高的3/4处，」二槽放在下槽上，先用滴管把电极缓冲液加满凝胶管（不能有气泡产生），再把电极缓冲液加入上槽，使液面高于凝胶管1-2cm。⑶用微量进样器将样品（血清样品加20ul,血痕液全部）小心地加到凝胶柱表面，盖好上槽的盖子，上槽接负极，下槽接正极。.电泳电泳需在2mA/每管及4c或室温条件下进行的，按所加样的凝胶管数调整电流强度，恒电流，当游离的Hb带距凝胶管下端1cm时，停止电泳。电泳时间约2—3小时。.染色（1）显色原理因为HP为结合珠旦白，可结合Hb,利用Hb有过氧化物酶作用，可使过氧化氢释放出新生态氧，后者使联苯胺（无色）氧化成联苯胺兰（兰色）如图所示：HbH2O2►[O]联苯胺 ►联苯胺兰⑵操作电泳后取出凝胶管，用腰穿针沿管壁周围注射自来水，同时慢慢旋转凝胶管，推针前进,使凝胶与管壁分开，抽出针头即可将凝胶一并带出。将凝胶柱放入联苯胺染色液中染色，约10分钟左右，即显示出明显的带。颜色初为兰色,约2—3小时后，变为棕色，显色后的凝胶柱可放入蒸储水保存或透射光直接照相。结果判定，，b A1—1 2—1 2—2图三Hpl-l型：只有一•条宽谱带，迁移速度最快，紧靠清蛋白。Hp2—2型：由数条谱带组成，迁移速度最慢。Hp2—1型：是Hpl—1型与Hp2—2型的混合型，具有1—1和2—2两型谱带，只是谱带的位置和强度有所不同。注意事项（1）丙烯酰胺不能配制时间过久，应现配现用，时久失效，不能分出谱带。⑵过梳酸胺应保持干燥，不能受潮。⑶凝胶柱不能有气泡。表面应十分平整，因为柱内有气泡会影响电流通过，而表面不平整，则谱带不直。（4）加样时，针尖不能触及胶面，并且应缓慢将样品平铺于凝胶表面，不要振动，否则会影响电泳谱带的清晰度。⑸电泳开始时，电流有下降的趋势，约半小时后，又有所上升，需不断调整，保持恒定的电流强度。㈡Gc表现型的测定——园盘电脉法实验目的掌握Gc表现型的测定原理，操作步骤及结果判定。实验原理利用聚丙烯酰胺凝胶作电泳支持物，具有一定电荷和分子大小不一的血清旦白通过浓缩效应，电荷效应、分子筛效应而被精细地分离，能将血清旦白分出12—25个组分，Gc型具有特殊的分带，用染色剂染色，可显示出Gc型各带。实验仪器同HP表现型测定实验试剂（1）电极缓冲液：pH=8.29三羟甲基氨基甲烷(Tris)10.75g乙二胺四乙酸：钠(EDTA•Na2)0.937g\加蒸储水至1000ml硼酸5.04g J(2)5.5%凝胶液丙烯酰胺5.36g ]»加入电极缓冲液至100ml双丙烯酰胺0.14g」⑶催化剂2%过硫酸铉。(4)蔗糖溟酚蓝混合液蔗糖60g、0.01%澳酚蓝100ml、溶解蔗糖。⑸染色剂①0.1%氨基黑染液氨基黑0.1g,加在10%冰醋酸溶液中溶解。②0.25%考马斯亮兰G250染色液考马斯亮兰G2500.5g,溶丁90ml乙醇中，再加冰醋酸10ml,临用时用蒸储水稀释二倍。(6)固定液12.5%三氯醋酸操作方法.凝胶柱的制备取下列试剂混合之：(此为16管量)。.5%凝胶液50mL过硫酸钱20ml。TEMED5011L然后用滴管加入凝胶管内，方法同Hp型测定。.加样(1)样品准备取被检血清2滴于凹玻板内，用细玻棒或竹签沾取1%溟酚兰少许，与血清混匀，使之成天兰色即可使用(澳酚兰主要是在电泳时起示踪的作用，便于观察血清样品在电泳时迁移的位置)。⑵加样用微量进样器分别吸取各份准备好的样品20U1-30U1,小心地加到凝胶柱上面之界面处。.电泳在3mA/每管及4℃冰箱的条件下进行电泳，稳定电流强度，电泳120分钟(或待溟蓝指示带移至距管端约0.5—1cm处时)停止电泳。.固定染色、脱色

取出凝胶管，用腰穿针剥离凝胶柱，方法同HP测定。将胶柱放入装有10%三氯醋酸液的容器中固定30分钟，弃去固定液，用蒸福水冲洗两次凝胶柱。将凝胶柱放入装有0.1%氨基黑染液的容器内，置60—80℃的热水浴中染色30分钟。或用0.25%考马斯亮壬G250浸泡凝胶柱12—24小时。然后弃去染液，用10%冰醋酸脱色至谱带清晰为止（在此期间一般需要更换脱色液2—3次）。结果判定+Gc2-1图四转铁蛋白带白蛋白带结果判定+Gc2-1图四转铁蛋白带白蛋白带如图所示：在白蛋白带与转铁蛋白带之间的几条带为Gc带。Gel-1型：靠近白蛋白带的一条快带。GC2-2型：靠近转铁蛋白带的一条慢带。Gc2—1型：为Gel-1和Gc2-2的混合型，具有和2—2两型谱带。注意事项同HP型。㈢Ge表现型的测定——垂直平板电泳实验目的掌握其测定原理，了解操作步骤和结果判定。实验原理同Ge型园盘电泳。实验仪器电泳仪、垂直板状电泳槽、滴管、刻度吸量管(10ml、1ml、5ml)微量进样器(20U1)、烧杯、洗耳球。实验试剂⑴丙烯酰胺凝胶贮备液丙烯酰胺28g ]700ml双蒸水，过滤后存放在棕色瓶中(不超过一个月)甲叉双丙烯酰胺0.75g।⑵凝胶缓冲液a.分离胶缓冲液Tris：18.17；浓HCL：2.2ml溶于100ml双蒸水中，调至PH=8。b.浓缩胶缓冲液Tris：6.06g；浓HCL：3.0ml,溶于100ml双蒸水中,调至PH=6.3。⑶电极缓冲液(贮备液)Tris：3.0g；甘氨酸：14.4g,溶于1000ml双蒸水，调至PH=8.3,临用前1:10稀释一工作液。⑷10%过硫酸胺液过硫酸胺(PAS)lg,溶于10ml双蒸水中(现配现用)。(5)1%琼脂糖液琼脂糖1g，溶于10ml电板缓冲液(工作液f1:10稀释)现配现用。(6)含0.01%溟酚兰的60%蔗糖混合液(7)四甲基乙二胺(TEMED)(8)10%三氯乙酸(9)5%考马斯亮兰10%冰醋酸操作方法.凝胶板的制备(1)将干净的两块玻板嵌入槽内，并架于电泳槽内，用夹子夹紧两边。⑵将1%琼脂糖在电炉上溶化，用滴管乘热立刻封底部和上端的小槽，按下表配制分离胶灌入。表胶浓度及试剂用量(ml)分离胶T=7.1%C=2.6%浓缩胶T=5.2%C=2.6%双蒸水186.9凝胶贮备液91.7凝胶缓冲液9(a液)1.25（液）10%APS0.30.03TEMED0.020.01⑶待聚合后，用滤纸吸去胶表面的水分再加入浓缩胶，然后马上插入样品梳，25C下聚合。取出样品梳。.加样(1)将1:10稀释的电板缓冲液倒入上下槽，直至盖过上下槽凹形玻板的低凹处。⑵用20U1微量进样器吸取被检血清和蔗糖澳酚兰混合液20U1,混匀后，按顺序加入样品梳所制的凹槽内。.电泳加样完毕，即可电泳。上槽接负极，下槽接正极，以3mA/凹槽的电流强度。在4c或室温下进行电泳，直至澳酚兰指示带距胶底端0.5cm处即可停止电泳，电泳整个过程中应稳流，大约需要2—4小时。.固定染色脱色(1)电泳结束后，先关机，拔去电源，回收下槽内的缓冲液。⑵将两块垂直玻板取出，缓慢轻巧分开，将胶板轻轻移至另一块玻板上，弃去下端的琼脂糖凝块，用玻棒轻轻将凝胶板移入装有10%三氯醋酸的培养皿内，固定15—30分钟。然后加入5%考马斯亮兰染液2—4ml。⑶染色24小时，若谱带显现不清晰，可用10%冰乙酸脱色至清晰为止。结果判定同见图四。Gcl-kGc2-1、Gc2-2如图所示：在白蛋白带与转铁蛋白带之间的带为Gc带。Gel-1型：靠近白蛋白带之间的带为Ge带。Gc2-2型：靠近转铁蛋白带的两条快带。GC2-1型：在1—1型和2—2型区带范围内的三条谱带为2—1型。注意事项⑴用琼脂糖液封槽时，上槽的琼脂糖液应加满整个槽，不能有气泡。⑵拔取样品梳时，动作要轻巧，否则凹槽不予出现。⑶同HP园盘电泳。五、红细胞酶型(Redbloodcellenzyme-type)检验㈠醐型检验的理论基础红细胞酶型是指红细胞内同工前的遗传多态性(Redcellissoenzymepolymorphisms),同工醐即是指由遗传基因(Genes)决定的，分子的•级结构不同(即受控于不同的结构基因),但催化(Structuregene)活性相同，能催化同一种化学反应的多种形式的一组能。在人的血细胞及其它体液、分泌液等中，含有丰富的同工酶(Isoenzyme),其多态性是由同一位点的复等位基因(Multiplealleles)所决定的。按照孟德尔定理遗传，是一类重要的遗传标记(Geneticmarker)0对红细胞酶的检测和分析，能够为法医学个人识别(Personalidentification)和亲权鉴定(Parentagetesting)提供很有价值的证据。目前已发现的主要红细胞酶型有：红细胞酸性磷酸酶(EPA)、酯酸D(ESD)。葡萄糖磷酸变位酶I(PGMI)、乙二醛酶I(GLOI)、酸葡萄糖酸脱氢酶(PGD)、谷丙转氨酶(GPT)、腺首脱氨酚(ADA)、腺甘酸激酶(AK)、肽酶(PEPA)。检测同工醐的多态性采用的是同工酶谱技术，这是近30年来发展起来的一门新的实验技术。利用酶的化学本质是蛋白质，具有两性离子的性质以及酶具有特殊的催化活性，且对其催化反应中的作用物(即底物)具有高度特异性的特点，将电泳技术和组织化学染色方法结合起来用于同工酶遗传多态性的检测。酶谱技术(Zymogramtechnique)方法主要包括以下两个步骤：⑴电泳分离：酶的化学本质是蛋白质，在一定PH条件的溶液中，由于前蛋白分子上的氨基，竣基以及其它一些侧链团的电离而使酶蛋白分子成为带电颗粒。不同分子结构的酶蛋白，加其所带电荷的不同，其电泳迁移率亦不一样，因此，运用电泳的方法，可将不同分子的前蛋白在一定的支持介质(如醋酸纤维素膜、淀粉凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等)上分离成为不同的区带。⑵酶谱显示：电泳分离后的酶谱显示，是利用酶具有催化活性且对底物具有高度特异性的特点，将相应的底物加于分离酶蛋白的电泳介质表面，在有酶活性存在的地方，底物即在醐的催化作用上，通过一定的化学反应，生成具有一定颜色的或能发荧光的产物，从而将酶的谱带于电泳介质上显示出来，根据各种酶电泳谱带的不同，即可进行酶型分析。在法医血清学实际工作中，除新鲜血液外，血痕、精液及精斑，带毛根的新鲜毛发等物证检材，也越来越多地对其进行酶型的检测，以增加个人识别及亲权鉴定机会，下面即介绍常用的醐型技术方法。㈡检材样品的处理⑴新鲜血细胞解离液的制备取静脉血或耳血于生理盐水中，一般以5倍体积量的生理盐水离心洗涤三次，取1体积的压积红细胞加1份体积的冷蒸馈水振摇使其混匀，置4c冰箱内放置45—60分钟，室温下温融(或置冰盒中冰冻过夜，检测前取出温融)，所得之溶血物即可用于电泳分析。⑵精液样品的处理收集精液样品，室温置30分钟使之液化，4℃下高速离心(1500rpm)10分钟，使精浆与精子分离，精子可用等渗的生理盐水离心洗涤二次(3000rpm)10分钟，上清液即可用于分析。⑶血斑及精斑检材的处理血斑(痕)检材，可用0.05M的二硫苏糖醇(DTT)溶液少许浸泡10—20分钟后(检材较陈旧时可浸泡过夜)用于分析。精斑检材一般采用电泳的电极缓冲液或DTT直接浸泡后用于分析。作斑痕的分型实验时，一定要用新鲜血已知标准型作平行对照。(4)毛发检材的处理离体24小时之内有毛根的毛发，剪取带毛根的毛发1cm左右，置于-196C液氮中冷冻5分钟，然后取出在室温下温融30—40分钟即可直接插入凝胶内进行电泳。可将带毛根的毛发砸扁后，用少许的凝胶缓冲(内含l%Tritonx-100)浸泡洗脱使其能蛋白充分释放出来，然后用滤纸片吸取浸出液插在凝胶板中进行电泳分析(或先在凝胶板上打上样品槽，将浸出液直接加入槽中进行电泳)。新拔下的毛发，可连同其根剪取1cm左右直接插入胶内。㈢电泳支持介质的制备及处理见能型检测的具体方法。㈣法医学中常用红细胞酶型检测方法1.葡萄糖磷酸变位酶1(PGM1)(1)电极缓冲液：0.1MTris-马来酸缓冲液(PH7.4)三羟甲基氨基甲烷(Tris)12.11g马来酸11.62g乙二胺四乙酸2.92gMgCk•6H2O2.03gNaOH 6g加蒸储水500ml,搅拌使其溶解后，用INNaOH调PH至7.4,加水至1000ml。(2)凝胶缓冲液(PH7.4)将缓冲液1:15倍稀释作为凝胶缓冲液。⑶底物缓冲液：0.4MTris盐酸缓冲液(PH8.0)Tris 1.2gMgC12-6H2O0.4g加蒸储水50ml溶解后，用2NHC1(或1:1HCL)调PH至8.0,然后加水至100ml。⑷凝胶板的制备采用单纯的琼脂糖凝胶或琼脂糖和水解淀粉混合胶，浓渡均为1%,凝胶板厚度为1mm,凝胶板大小为15X20cm2»凝胶的制备：琼脂糖凝胶：琼脂糖0.4gTOC\o"1-5"\h\z凝胶缓冲液 40ml混合胶：琼脂糖 0.4g水解淀粉 0.4g凝胶缓冲液40ml在三角烧瓶内，沸水浴中加热溶解后，倒入预先放置的水平之凝胶玻板上的模框内，铺满整个模框，注意不要有气泡，室温放置20分钟或4c冰箱内放5分钟，即可使用。亦可头天制备好胶板于保湿盒内放入4℃冰箱中，次日使用。(5)样品的准备①新鲜血液：用生理盐水离心洗涤三次，取压积红细胞加少许蒸储水振摇后放冰槽过夜，次日离心取上面的溶血产物作为电泳样品。②血斑：可剪取两根0.8cm长的血痕纤维，加少许0.05M的二硫苏糖醇(DTT)浸透后直接插入胶板中电泳。(6)加样①打孔，将制备好的凝胶板放于水平面台上，在距阴极端3cm处，用手术刀切一横排0.8cm长的小切口，每个切口之间间隔0.4cm。②加样：取0.8cm长的纱布纤维2根，沾取制备好的红细胞解离液埋入小切口内(血痕纤维则用DTT浸湿后直接埋入)。(7)电泳将加好样的凝胶板放在电泳槽冷却板上，用三层滤纸搭桥，加样侧接阴极，对侧接阳极,打开电源，按电场强度15V/cm调整电压，并用万用电表测试调整电压到实际需要的量。电泳时间2.5—3.5小时，循环温度2—4℃。(8)酶谱显示⑴显色反应的生化机能葡萄糖一1一磷酸盐IPGMI葡萄糖一6一磷酸 NADP< ►Formazan(兰色)I PMS6一磷酸葡萄糖内酯◄ ►NADPH MTT⑵显色步骤取葡萄糖一1一磷酸盐35mg葡萄糖1,6二磷酸盐0.2mg辅醐H(NADP) 2.0mg嘎哇兰(MTT) 2.5mg吩嗪甲酯硫酸盐(PMS)l.Omg混合装于一棕色小瓶内，加入10ml底物缓冲液使其充分溶解。另取琼脂糖0.2g装于50ml三角烧瓶内，加15ml蒸储水混匀，放沸水浴中使其溶解。室温冷至56—65C时，迅速将上述配好的显色液倒入、摇匀，立即加入葡萄糖一6一磷酸脱氢酶(G-6-PD)10ul,混匀后立即将此染色液铺于电泳凝胶表面(可放于有机玻璃模框于凝胶面上，框的一边与加样原点平齐)，置保湿盒内放37℃恒温箱内(避光)30—40分钟，待睡的兰色谱带清晰显现，即可判续PGM1表型。0)结果分析(见下图)正极fg 、^■1a负极原点 1 2—1 2图五PGM1三种普通表型标准谱.酯酶D(EsD)(1)电极缓冲液①「可用0.1M、Tris—1.65mM、LioH—16.5mM,柠檬酸一18mM、硼酸(PH7.5)配制方法：Trrs7.51g柠檬酸3.47g硼酸1.11g氢氢化锂69mg加水至1000ml,使其充分溶解，用2moiTris调PH至7.5。⑵凝胶缓冲液若用1.液，则将电极缓冲液稀释15倍作为凝胶缓冲液。若用2.液，则将电极缓冲液5倍稀释作为凝胶缓冲液。⑶底物缓冲液无水醋酸 0.41gH2O 50ml用1%醋酸调PH至6.5,然后加水至100。(4)凝胶板的制备：同PGM1表型测定(5)样品的准备：同PGM1(6)加样：同PGM⑺电泳电场强度12伏/厘米或15伏/厘米，电泳时间45-60分钟，电泳温度4—6℃。(8)航谱显示①显色反应的生化机理

4—甲基伞形酮醋酸盐ESD瘦酸阴离子< >4一甲基伞形酮(在长波紫外灯下发亮兰色荧光)②显色步骤取1.5mg—甲基伞形酮醋酸盐，力110.5亳升丙酮助溶，然后加底物缓冲3ml混匀，将该液体倒在15X8cm大小的新华滤纸上，使其充分浸透后覆盖在凝胶板表面，室温放10分钟后，直接(也可除去滤纸)在2500—3600A的紫外灯下观察荧光区带，判读EsD之表型。0)结果分析正极负极原点负极原点EsD1—1 2—1 2—3 3—1 4—1 4—2 5—1 6—1图六人红细胞EsD表型电泳谱.乙二醛酶I(GLOI)⑴电极缓冲液：0.1\11'1^一马来酸缓冲液出117.4),配制同前⑵凝胶缓冲液：1:15倍稀释之电极缓冲液⑶底物缓冲液：磷酸缓冲液(PH6.2)NaH2PO42.4gNa2HPO41.31g加水50ml溶解后，用1NHC1或NaOH调PH至6.2,然后加水至100ml。(4)显色用碘液1.65gKI(碘化钾)温水溶，搅拌5分钟，过滤，装棕色瓶中4c保存。TOC\o"1-5"\h\z1.5g 1（碘）30mlH2O⑸凝胶板的制备采用1%琼脂糖和1%水解淀粉混合凝胶，制备方法如下：琼脂胶 0.4g水解淀粉 0.4g凝胶缓冲液 40ml沸水溶解后倒入凝胶框内，室温放20—30分钟固化。（6）检材样品的准备：同PGM1,亦可直接用全血。⑺加样：用6X1.5mm大小的滤纸片沾取全血或溶血产物直接插入凝胶板距阴极端3—5cm处。（8）电泳电场强度15v/cm,时间45—60分钟，温度4℃。0）酶谱显示：（碘染色法）①反应机制甲基乙二醛GLOI]还原型谷胱甘肽 一乳酰谷胱甘肽（无色）GSSG」凝胶中含有起反应的谷胱甘肽可以使碘还原成碘化物，而有酶活性的地方，由于还原型谷胱甘肽变成了乳酰谷胱甘肽，而不能使碘还原，因而碘液即使凝胶中的淀粉显兰色，因此,显现兰色的地方就标志有GLOI的存在。②显色步骤.底物反应剂还原型谷胱廿肽12m研40%甲基乙二醛50ul»底物缓冲液6ml J取1.5X12cm大小的滤纸，将上液倒于滤纸上使其浸透后，覆盖在正极端凝胶面，室温放45分钟（或37c放30分钟），除去滤纸，吸干凝胶表面的水分，放一模框于凝胶表面。.碘凝胶制备取琼脂糖1.5g,加蒸储30ml,沸水浴热浴，凉至55℃时加碘液0.2ml摇匀，倒在凝胶表面的模框内，覆盖与底物反应剂作用的区域，立即判断结果。（9）结果分析：（见图七）负极原点1—12—12—21—12—12—2图七人工细胞GLOI表型电泳谱4.红细胞酸性磷酸酶(EAP)0.018M柠檬酸钠、0.029m磷酸二氢钠、0.0012M乙二胺四乙酸钠(PH6.0)Na3Citrato2H2ONaH2Po42H2ONa2EDTA加水溶解后，用INNaH2PO,调PH到6.0,加水至1000mL(2)凝胶缓冲液：0.05M柠檬酸、0.05M氢氧化钠、PH5.0。柠檬酸10.5gNaOH2g加水溶解，用INNaOH调PH至5.0,加水至1000mL(或按100ml量配制:柠檬酸1.05g,NaOH0.2g)(4)凝胶制备取15X20X0.1cm大小的模框，固定于水平板上的玻璃板上面。称取0.4g琼脂糖，加140ml凝胶缓冲液(8ml电极缓冲液和32ml蒸馀水)，放沸水中加热溶解，然后倒于模框内，室温固化15—30分钟，即为1%琼脂糖凝胶板。(5)样品的准备，同PGM1(6)加样取0.3X0.7cm大小的滤纸片，吸取待测的红细胞解离液，(约10—15ul),整齐地放置在胶板距阴极端3—5cm处，放室温扩散30分钟后小心除去样品纸条。⑺电泳槽内加入电极缓冲液，将凝胶板放置于冷却板上，两端用3层滤纸搭桥，加样侧接负极，对侧接正极，再检查一次电极是否正确。然后打开电源开关。电场强度为12V/cm—15V/cm,电泳2—3小时，循环水温度为10—20℃。(8)酶谱显示①显色反应的生化机理4一甲基伞形酮磷酸盐EAP磷酸＜ ►4-甲基伞形酮(在长波紫外灯下发亮兰色荧光)②显色步骤将1.5mg、4一甲基伞形酮磷酸盐溶于2.5ml底物缓冲液中，充分液解后倒在8X10cm大小的新华滤上，使其浸透后，覆盖于加样点至阳极端的凝胶表面，放保湿盒于37C温箱中放30分钟，在长波紫外灯卜.观察结果。正极⑼结果分析正极 起点负极ABABCACBC

图八人红细胞ACP表型电泳谱第三篇抗血清的制备一、抗人血清沉淀素的制备实验目的了解抗人血清（Anti-humanserum）制备的原理和方法。实验内容抗人血清和抗人血红蛋白沉淀素血清（Anti-humanhemoglobinserumprecipitin）的制备。实验原理免疫所用的沉淀原（Recipitinogen）是可溶性的人血清旦白，常用的免疫动物是家兔。沉淀原可刺激家兔机体产生特异的沉淀素，所得血清即为抗人血清（旦白）沉淀素血清（ASHP）。简称抗人血清。如欲制得抗某种动物血清旦白沉淀素血清，可用该动物血清给家兔免疫制得。实验仪器离心管（5ml』5ml）、注射器（2ml、50ml、30ml）、注射针头（5号、7号）滴管、试管、试管架、沉降管、沉降管架、刻度吸量管（1ml、2ml）、手术剪、手术镒、眼科剪、眼科镶、止血钳、动脉夹、三角烧杯、水浴锅、安瓶、酒精喷灯、兔箱、兔解剖台、手术刀、丝线、玻璃纸、酒精灯、漏斗、研体、研槌。实验试剂生理盐水、冰醋酸、二甲苯、酒精、碘酒、氯化钠各型人血清、叠氮钠、福氏完全佐剂。免疫方法(1)动物的选择最好选用白色短毛大耳年轻健康的雄性家免，体重在2公斤以上，未作过其他实验。如为雌兔则还要是未生育或怀孕。如需制备抗兔血清沉淀素血清，则多选用健康的“菜康”和大种的杂交公鸡，体重1.5—3公斤者为好。⑵沉淀原(抗原)的制备①凝固血清旦白制备取多个健康人新鲜血清，用蒸储水稀释10倍，再加1/5容枳的饱和盐水，按100ml加冰醋酸1一2滴，置沸水溶中加热15分钟，待蛋白凝固冷却后用滤纸过滤，当残渣凉至半干，用玻玻璃纸包成球状，每份0.5g放入二甲苯液中，在4℃冰箱保存备用。临用前取0.5g凝固血清旦白，置于滤纸上使二甲苯充分挥发，再将其置于研钵中加2ml生理盐水研磨，使成乳白色均匀的混浊液，供一只兔子免疫一次。②新鲜。型血清，以生理盐水稀释2倍。③福氏完全佐剂与人血清的2—3倍稀释等量混合，强度振荡使渐成包水状态。(3)免疫注射其方法很多，注射的剂量、途径、次数因免疫方法不同而异。常用的免疫注射途径有：耳静脉注射、皮下注射。皮内注射。腹腔内注射、肌肉注射、眼结膜下注射等。①皮下注射(以注射凝固旦白为例)用注射器吸取已稀释好的凝固血清旦白2m1(一只兔子的用量)，于兔子的背部、臀部、或腹股沟部、各选二个注射点，每点皮下注射0.5ml每隔七天注射一次，共注射三次，末次注射后的第7—10天采血测抗体效价。如果效价不理想可再注射一次或二次，隔七天后再采血测效价。如果效价仍不理想，说明动物的免疫反应不好，不必再注射。②耳静脉注射——以注射新鲜O型血清为例取数人O型血清混合，用生理盐水稀释2倍，以2ml/次/每只兔的量，隔日注入兔耳静脉一次，共2—4次。末次注射后的第七天采耳血测抗体效价。③肌肉注射——以加佐剂血清为例取巳配好的福氏完全佐剂血清给家兔多个部位肌肉注射，隔七日注射一次，共3次，末次注射后的第七天采耳血测抗体效价。上述几种方法并非固定不变，可根据需要加以调整，以能制取最高抗体效价为宜。(4)效价测定①耳静脉采血将兔子放入兔箱后由一人固定，找到耳静脉较粗一段，拔去兔毛，用手摩擦或轻弹耳静脉，使其充盈，或用二甲苯涂抹耳根部，也可使血管明显扩张，用针头刺破血管，取血1-2ml于试管中，在室温下数小时后，血清便可析出。②效价(tilers)测定 环状沉淀反应稀释抗原(antigen)：用生理盐水将抗原(人血清)作2—5倍数的稀释。如下表所表示表一 2—5倍数稀释法康氏管编号12345678生理盐水(ml)0.50.750.50.50.750.50.50.751/10血清(ml)0.50.50.50.50.50.50.50.5最后容积0.50.750.50.50.750.50.50.75血清稀释倍数1/201/501/1001/2001/5001/10001/20001/5000康氏管编号910111213生理盐水(ml)0.50.50.750.50.51/10血清(ml)0.50.50.50.5弃最后容积0.50.50.50.50.5血清稀释倍数1/1万1/2万1/5万1/10万0方法a.取七支沉降管，按下表每管加入待检抗人血清0.1ml,加时将滴管插入沉降管低，加血清至0.5cm的高度，然后吸至高度约0.3—0.4cm。(或加至管高为0.3—0.4cm)。注意勿加出气泡，有气泡产生时可离心除去气泡。b.用另一干净毛细滴管，从13号康氏试管开始，即从13至7的倒序依次每管吸出0.1ml的抗原稀释液加入沉降管内，使之重叠于抗人血清之上，加进要沿管壁轻慢加入，使两溶液之间有一清晰的界面。加入抗原的量要与待检抗血清的量相同。表二沉降管编号1234567抗人血清(ml)0.10.10.10.10.10.10.1抗廊解液康氏试管号78910111213抗原量(ml)0.10.10.10.10.10.10.1抗原稀释度1/20001/50001/1万1/2万1/5万1/10万0结 果4--H--H-++————③观察结果抗原加完后记时，每隔15分钟将沉降管架置于黑背景，用斜射光观察有无沉淀环出现。如果在两液之间有白色环出现为阳性反应，在15分钟、30分钟、60分钟出现白色沉淀者，分别为+++、++、+超过60分钟出现白色沉淀环者为非特异性反应。60分钟后不出现者为阴性反应。如果盐水对照管不出现白色沉淀环，则阳性反应为(+)的最后一管抗原稀释度的例数，即该抗人血清沉淀素的效价，即抗体的效价。如表2中第4号沉降管出现(+)的阳性反应而该管的抗原稀释度为1/2万，那么抗体效价就为2万倍。⑸特异性测定用家常动物如兔、狗、羊、鸡、猪、牛等的血清按2・5倍数法稀释为1/20、1/50、1/100、1/200和1/500倍等五种稀释液。②用环状沉淀反应进行测定，将各种动物血清按不同稀释度分别加入装有待检抗人血清的沉降管内，使两液之间形成-清晰界面，然后观察有无白色沉淀环出现。如在1/500—1/1000稀释度范围内均无白色沉淀环出现，则说明抗人血清的特异性好，可以使用。如1/100以后的管出现白色沉淀环，则表示特异性差，需用吸收法除去交叉反应的抗体。具体做法是用5%猴血清少量混匀后，室温2小时、4℃冰箱过夜，离心沉淀，取上清液再测其效价及特异性，如不理想可再做第二次吸收。(6)收集、保存抗人血清①大量采血当抗人血清效价合格时，可在测效价的第二天早上(未喂食前)进行大量采血，其方法很多,主要有心脏采血和颈动脉采血两种，现分述如F：a.心脏采血：将兔固定在兔解剖台上或由另外二人固定，手术者用手指尖触摸兔胸前区，找到心脏膊动最明显处。剪毛，消毒后用注射器剌入心脏直接抽取血液。b.颈动脉采血：将兔子固定在兔解剖台上，剪去颈区兔毛消毒，切开分离颈部各层组织,找出并分离两侧颈动脉。结扎右侧颈动脉及左侧颈边脉远心端。用动脉夹夹住左侧颈动脉近心端，在其上做“V”型切口，并插入一塑料导管，用丝线固定好，取下动脉夹，放血。将上述两种方法所采血液收集在三角烧杯内，斜置于室温下2小时，4C冰箱过夜，次日分离血清，离心沉淀，便可得到清晰的抗人血清。将其放入56℃水中30分钟，再经过用猴血清吸收得到合格的抗人血清。③抗人血清的保存在效价特异性均合格的抗人血清中，加入适量叠氮钠，使其在抗人血清中的总浓度为0.01%,然后在无菌室内将其分装于消毒安瓶中封存，放入冰箱保存。二、抗人血红蛋白沉淀素血清的制备实验目的了解抗人血红蛋白沉淀素血清(Anti-humanhemoglobinserumprecipitin)的制备方法。实验原理同抗人血清沉淀素的制备。实验仪器同抗人血清制备。实验试剂生理盐水、氯化钠、蒸锵水、酒精、碘酒、各型混合红血球、各种动物血球、20%黄柳酸、乙酸。兔疫方法(1)动物的选择同抗人血清制备。(2)沉淀原(precipitinogen)的制备方法I：a.取多个人的血凝块混合，用四层以上盐水湿纱布包裹放入研钵挤压，将红血球压出。或将抗凝血离心，弃去血清，即得红细胞。b.在红细胞中加入10倍盐水，离心，弃去上清液，再加盐水混匀。离心弃上清液，如此反复20次左右，直至上清液用20%黄柳酸检查无血清成份为止。c.取洗涤好的压积红细胞4ml,力口9倍量(36ml)蒸储水，混匀后冰箱过夜，便之完全溶血，再加纯氯化钠结晶0.32克，使之成为0.85%的氯化钠溶液。高速离心，除去细胞质膜和其他基质，上清液即为10%血红旦白盐水溶液，分装于安瓶中，冰箱保存。方法H：a.取O型人红细胞用生理盐水充分洗涤十五次，至上清液对20%黄柳酸反应阴性为上。分离得到压积红细胞加等量蒸馀水使之溶血。b.加1/5量的乙醛，3000rmp,离心5分钟，除去上层的红细胞基质，向溶液中通入空气，除去残余乙醛。在上清液中加入等量1.7%氯化钠液使成为5%血红旦白液，再用石棉漏斗过滤一次、离心后。可得到透明溶液，分装保存于-20C。(3)免疫注射眼结脸下注射：用注射器吸取己制备好的10%Hb盐水液0.2ml固定兔头，翻开兔上眼睑。将针头小心刺入眼穹窿部，球结膜内深约2mm,注射抗原。隔一天注射一次，左右眼交替，注射六次后休息七天，采耳静脉测定其效价。如放价渊意了，即可大量采血，如不满意，可再注射六次后再测效价，如再不满意即可放弃。其他的注射途径可根据实际情况而定。(4)效价测定同抗人血清制备，只不过抗原(沉淀原)是人血红旦白液。⑸特异性测定用家常动物的红细胞制成10%血旦白液、方法同抗人血清制备。(6)收集保存抗人血红旦白血清同抗人血清制备。注意事项(1)在制备抗血清的整个过程中，要保证无菌操作，所用器皿、器械、生理盐水都要进行消毒处理。⑵往沉降管内加抗血清时。不能有气泡产生。在抗血清上加入抗原时。动作一定轻慢,要沿着管壁缓慢加入。切勿冲坏液面。⑶采血后，严防发生溶血。⑶ 使用制备好的抗血清时。注意不要反复冻融，以防抗体效价跌得太快。第四篇 血痕(Bloodstains)检验一、血痕预备试验实验内容♦联苯胺试验(Benzidinltest)。.无色孔雀绿试验(Leucoma/achitegleentest)».过氧化试验。实验目的掌握血痕预试验的几个常用方法。实验仪器滴瓶、滴管、凹玻板