细菌生化反应课件

细菌鉴定生化反应常用试验碳水化合物的代谢试验蛋白质和氨基酸的代谢试验碳源和氮源利用试验各种酶类试验抑菌试验糖（醇）类发酵试验碳水化合物代谢试验不同细菌分解糖类的能力各不相同有的能分解多种糖类有的仅能分解1~2种糖类有的不能分解任何糖醇有的细菌可产气有的细菌不产气以此可作为细菌的鉴定依据蛋白胨10g牛肉膏3g氯化钠5gAndrade指示剂10ml蒸馏水1000ml葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇浓度为1%其他糖类、卫矛醇、水杨素浓度为0.5%培养基Andrade指示剂酸性复红0.5g1mmol/L氢氧化钠16ml蒸馏水100ml将复红溶解于蒸馏水中，加入氢氧化钠，数小时后如复红褪色不够，再加入1~2ml氢氧化钠直至呈淡黄色。已分纯菌种接种培养基，孵育18~24小时。方法结果判定阳性阴性培养基变为红色培养基不变色分解糖（醇）产酸培养基内出现气泡不分解糖（醇）产气细菌分解葡萄糖方式有两种即发酵和氧化发酵的终末产物为各种有机酸混合物，产酸量大，普通糖发酵培养基易测出。氧化的终末产物为CO2和H2O，产酸量小，普通糖发酵培养基不易测出。原理蛋白胨2g葡萄糖10g氯化钠5gK2HPO40.3g溴麝香草酚兰0.08g、琼脂2g蒸馏水1000ml培养基Hugh-Leifson二氏培养基发酵型两支均变黄为发酵糖产酸氧化型只有不加石蜡管变黄，加石蜡管不变色产碱型两支颜色均不变或变蓝结果变黄为产酸发酵型整个培养基变黄氧化型高层上半部变黄产碱型不变或变蓝单管接种结果判断ONPG（β-半乳糖苷酶）试验碳水化合物代谢试验细菌分解乳糖需要两种酶，即半乳糖苷渗透酶和ß-半乳糖苷酶。半乳糖苷渗透酶使乳糖分子向细菌细胞内渗入。细胞内的β半乳糖苷酶可切断乳糖分子的半乳糖苷键，生成葡萄糖和半乳糖。原理乳糖不发酵细菌因缺少这两种酶，故不能使乳糖发酵产酸。某些细菌缺乏半乳糖苷渗透酶但具有ß-半乳糖苷酶，可使乳糖缓慢发酵产酸。分解乳糖的细菌具有上述两种酶，因此可以迅速分解乳糖。原理取待检菌接种于ONPG管35℃孵育1~3小时和24小时，分别观察结果方法1~3h变黄色结果判断

阳性阴性24h不变色产生ß-半乳糖苷酶未产生ß-半乳糖苷酶七叶苷水解试验碳水化合物代谢试验蛋白胨5g七叶苷3gK2HPO41g枸橼酸铁0.5g琼脂15g蒸馏水1000ml培养基待检菌接种于七叶苷培养基35℃过夜培养后观察结果方法结果判断培养基变黑阳性阴性培养基不变色细菌分解葡萄糖产生丙酮酸丙酮酸脱羧产生乙酰甲基甲醇乙酰甲基甲醇在碱性环境中被氧化为二乙酰二乙酰与培养基中蛋白胨所含精氨酸的胍基作用，生成红色化合物。α萘酚可加速此反应原理葡萄糖5.0gK2HPO45.0g多价蛋白胨0.5g蒸馏水1000ml培养基0.5%葡萄糖蛋白胨水甲液

6%α萘酚酒精溶液乙液

40%氢氧化钾溶液试剂结果判定阳性20min内出现红色阴性不出现红色观察结果勿超过1小时，延长时间出现的棕色反应不是阳性甲基红试验碳水化合物代谢试验细菌分解葡萄糖产生丙酮酸进一步生成甲酸、乙酸、乳酸等混合酸使培养基PH降至4.5以下，使甲基红试剂后显红色若产酸量少，或进一步转化为其他物质，则培养基的PH仍在5.4以上，甲基红试剂后显黄色原理0.5%葡萄糖蛋白胨水，同V-P试验培养基试剂甲基红0.1g95%酒精300ml蒸馏水200ml纯培养物接种36℃培养48~72小时，不可少于48小时。加入甲基红试剂5滴，观察结果。方法结果阳性阴性红色橘红色黄色葡萄糖酸盐试验碳水化合物代谢试验某些细菌能氧化葡萄糖酸盐作为唯一碳源生成2-酮基葡萄糖酸盐加入班氏试剂，出现砖红色沉淀。原理蛋白胨1.5g酵母浸膏1.0g磷酸氢二钾1.0g葡萄糖酸钾40g蒸馏水1000ml培养基待测菌大量接种于培养基35℃培养过夜或至48h加入班氏试剂沸水中煮沸10分钟，观察结果。方法结果判断阳性阴性有黄色到橙色出现没有颜色变化明胶液化试验蛋白质和氨基酸代谢试验某些细菌可产生一种胞外酶—明胶酶能使明胶分解为氨基酸，失去凝固力。半固体变为液体。原理待测菌接种于明胶培养基22℃培养7天，观察结果因明胶在35℃可自行液化，故35℃孵育后，观察前应先置4℃冰箱30min。方法培养基呈液化状态结果阳性吲哚（靛基质）试验蛋白质和氨基酸代谢试验某些细菌具有色氨酸酶能分解培养基的色氨酸产生吲哚吲哚与试剂中的对二氨基苯甲醛结合形成玫瑰吲哚原理胰蛋白胨20g氯化钠5g蒸馏水1000ml培养基蛋白胨水柯氏试剂主要成分含量高，灵敏度高对二氨基苯甲醛5g溶于75ml戊醇缓慢加入浓盐酸25ml欧氏试剂对二氨基苯甲醛1g溶于95ml95%乙醇缓慢加入浓盐酸20ml试剂待测菌接种于培养基36℃培养24-48小时，必要时可培养4~5天加入Kovac氏试剂0.5ml，轻摇试管。或沿管壁徐徐加入欧氏试剂0.5ml，覆盖与培养液表面，使成两层。方法结果阳性阴性试剂层呈红色两液接触面出现红色无色阴性取被检菌18小时培养液1毫升加入5%亚硝基铁氰化钠水溶液2滴

2NNaOH2滴50%醋酸溶液各2滴充分混匀用亚硝基铁氰化钠试剂检测吲哚方法结果判断阳性阴性出现草绿色、蓝绿色或深蓝色黄色或棕色较敏感硫化氢试验蛋白质和氨基酸代谢试验某些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸产生硫化氢后者遇亚铁离子或铅则形成黑褐色的沉淀原理三糖铁琼脂或双糖铁琼脂含硫代硫酸钠、硫酸钠或亚硫酸钠上述成份被细菌还原后产生硫化氢与二价铁生成黑色的硫化铁原理可检测细菌是否产生硫化氢待测菌接种于上述培养基35℃培养24-48小时，观察结果。培养基方法醋酸铅培养基或双（三）糖铁培养基结果阳性阴性培养基变黑培养基不变色尿素分解试验蛋白质和氨基酸代谢试验某些细菌具有尿素酶能分解尿素产生大量的氨使培养基呈碱性原理蛋白胨10g葡萄糖1.0g氯化钠5.0g磷酸二氢钾2.0g琼脂12.0g蒸馏水900ml0.4%酚红水溶液3.0ml尿素含量2%培养基待测菌接种于培养基35℃培养2~4h及24h，观察结果。阴性结果应观察至3天。方法结果阳性阴性培养基变红培养基不变色苯丙氨酸脱氨酶（TDA）试验蛋白质和氨基酸代谢试验某些细菌可产生苯丙氨酸脱氨酶使苯丙氨酸脱去氨基形成苯丙酮酸加入三氯化铁试剂后产生深绿色反应延长反应时间，绿色很快褪去。原理

dl苯丙酮酸2.0g（L型1.0g）酵母浸膏3.0g磷酸氢二钠1.0g琼脂12g蒸馏水1000ml培养基三氯化铁12g浓盐酸2.5ml蒸馏水100ml试剂待测菌接种于培养基35℃培养18-24小时加三氯化铁试剂4-5滴使从培养物表面流下观察结果方法结果阳性阴性立刻出现绿色接种菌量要多，否则出现假阴性不出现绿色快速苯丙氨酸脱氨酶试验用1%苯丙氨酸磷酸盐缓冲液(pH7.2~7.4)浸泡滤纸，凉干剪成1cm2大小。用此纸片蘸菌落，35℃保温15分钟。再于纸片菌落上滴加

三氯化铁溶液立即观察结果绿色为阳性（I~2‘分钟即消失）氨基酸脱羧酶试验蛋白质和氨基酸代谢试验某些细菌具有氨基酸脱羧酶能分解氨基酸使其脱羧生成胺和二氧化碳胺使培养基变碱，使指示剂变色。原理

氨基酸脱羧酶培养基蛋白胨5.0g酵母浸膏3.0g葡萄糖1.0g蒸馏水1000ml1.6%溴甲酚紫1.0mlL赖氨酸、L鸟氨酸或L精氨酸0.5g氨基酸对照培养基基本成分同上，不加氨基酸。培养基纯培养物接种上述两种培养基加入无菌液体石蜡36℃培养24小时方法

对照管因葡萄糖产酸变黄色，应保持结果判断结果氨基酸管对照管阳性先变黄后变紫黄色阴性紫色黄色试验错误/紫色精氨酸双水解酶试验精氨酸经两次水解生成鸟氨酸、氨及二氧化碳鸟氨酸在脱羧酶的作用下生成腐胺氨及腐胺均为碱性物质，故可使培养基变色。沙门菌分解精氨酸系由精氨酸双水解酶大肠埃希菌分解精氨酸系由精氨酸脱羧酶鉴别试验中不作区分沙门菌分解精氨酸系由精氨酸双水解酶大肠埃希菌分解精氨酸系由精氨酸脱羧酶鉴别试验中不作区分枸橼酸盐利用试验碳源和氮源利用试验某些细菌可利用铵盐作为唯一氮源以枸橼酸盐为唯一碳源可在枸橼酸盐培养基上生长分解枸橼酸盐，生成碳酸钠使培养基变碱。原理

氯化钠5.0g、柠檬酸钠5.0、琼脂12gMgSO4·7H2O0.2g、NH4H2PO41.0gK2HPO41.0g0.2%溴麝香草酚兰40.0g蒸馏水1000ml培养基培养物做成盐水悬液取一环涂抹接种于斜面35℃培养4天，每天观察结果一次。方法

培养基无细菌生长，仍为绿色结果阳性阴性培养基有细菌生长，由绿色变蓝色丙二酸盐利用试验碳源和氮源利用试验细菌可利用丙二酸盐为唯一碳源将其分解生成碳酸钠使培养基变碱原理氯化钠2.0g、酵母浸膏1.0g、K2HPO40.6gKH2PO40.4g（NH4）2SO42.0g丙二酸钠3.0g0.2%溴麝香草酚兰12.0蒸馏水1000ml培养基琼脂培养物接种35℃培养2天每天观察结果一次方法培养基有细菌生长，仍为绿色结果阳性阴性培养基有细菌生长，由绿色变蓝色马尿酸钠水解试验（三氯化铁法）碳源和氮源利用试验B群链球菌具有马尿酸水解酶可水解马尿酸为苯甲酸和甘氨酸苯甲酸与三氯化铁试剂结合形成有色的苯甲酸铁沉淀原理

肉浸汤(pH7.4)100m1马尿酸纳1.0培养基

结果判断阳性出现黄色沉淀物试剂同苯丙氨酸脱氨酶试验马尿酸钠水解试验（茚三酮法）碳源和氮源利用试验马尿酸水解成甘氨酸及苯甲酸甘氨酸在茚三酮(强氧化剂)的作用下氧化脱氨基生成氨、二氧化碳和相应的醛茚三酮则生成了还原型茚三酮反应中形成的氨和还原型茚三酮与残留的茚三酮形成紫色化合物原理

马尿酸钠试剂：1%马尿酸钠水溶液茚三酮试剂：3.5g茚三酮溶于100ml丙酮、丁醇混合液(1:1)中试剂0.4ml被检菌液加1%马尿酸钠水溶液混合后，35℃培养2小时加入0.2ml茚三酮试剂振摇，观察颜色变化方法

无颜色改变结果阳性阴性出现紫色触酶试验各种酶类试验细菌具有过氧化氢酶可分解过氧化氢为水和氧产生气泡原理3%过氧化氢溶液试剂挑取固体培养基菌落置于洁净玻片上滴加3%过氧化氢1~2滴静置，观察结果。方法无气泡产生结果阳性阴性1min内产生大量气泡氧化酶试验各种酶类试验某些细菌具有氧化酶可使细胞色素C氧化氧化型细胞色素C可氧化对苯二胺生成醌类化合物呈现颜色反应原理1%盐酸四甲基对苯二胺水溶液1%盐酸二甲基对苯二胺水溶液试剂

纸片制作事先剪好适当大小新华定性滤纸片将滤纸片浸泡在上述试剂中5min置35℃温箱烘干防潮保存。取检测滤纸一片印贴平板上菌落10秒钟内观察颜色变化方法颜色不变结果阳性阴性菌落变为蓝紫色硝酸盐还原试验各种酶类试验硝酸盐还原反应有两个过程在合成代谢中，硝酸盐还原为亚硝酸盐和氨；氨转化为氨基酸和细胞内其它含氮化合物。分解代谢中，硝酸盐或亚硝酸盐代替氧作为呼吸酶系统的终末受氢体。原理检测氨和还原态亚硝酸盐硝酸盐还原的过程可因细菌不同而异有的细菌仅能将硝酸盐还原为亚硝酸盐，如大肠杆菌等有的细菌可使其还原为亚硝酸盐和离子态的铵有的细菌可将其还原为氮，如沙雷菌属和假单胞菌属

硝酸盐或亚硝酸盐如果生成气体的终末产物如氮或氧化氮.称为脱硝化作用。蛋白胨1g硝酸钾0.1g蒸馏水100ml培养基甲液对氨基苯磺酸0.8g5N醋酸100ml乙液α奈胺0.5g5N醋酸100ml试剂待测菌接种于硝酸盐培养基35℃培养18-24小时加入等量甲、乙液1-3滴立即观察结果。方法不出现红色结果阳性阴性出现红色气体检查培养管内加1只小倒管(Durham管)，如管内出现气泡，表示有氮气产生。硝酸盐还原试验加入硝酸盐还原试剂不出现红色①硝酸盐没有被还原，试验阴性；②亚硝酸盐被进一步还原为氨和氮等其他产物而致假阴性硝酸盐还原试验无红色出现需检查亚硝酸盐是否被还原在原试验管内加入少许锌粉

出现红色表明锌使硝酸盐还原为亚硝酸盐，而待检菌无还原硝酸盐能力。仍保持无色表示亚硝酸盐已被进一步分解，为假阴性，实际为阳性。DNA酶试验各种酶类试验DNA酶可水解DNA长链为寡核苷酸链长链DNA可被酸沉淀寡核苷酸链由几个单核苷酸组成，溶于酸可在菌落周围形成透明环原理DNA2g胰酶水解蛋白胨15g大豆胨5g氯化钠5g琼脂15g蒸馏水1000ml培养基细菌点种于DNA平板35℃培养过夜在平板表面滴加1mol/L盐酸，观察结果。方法菌落周围无透明环出现结果阳性阴性菌落周围出现透明环凝固酶试验各种酶类试验葡萄球菌可产生凝固酶能凝固纤维蛋白是鉴定金黄色葡萄球菌的主要试验本试验有玻片法、试管法两种。原理检测“结合”凝固酶，即凝集因子。能直接作用于纤维蛋白原故可用玻片法检出玻片法

试管法可检测“游离”凝固酶此酶与血浆中的凝固酶反应因子协同作用于纤维蛋白原，使血浆凝固本方法用于玻片法阴性复查和玻片凝集试验结果的肯定。试管法将1-2个菌落与玻片上的一滴盐水乳化经10~20秒不发生凝集用接种环蘸取人或兔血浆一环混合后观察结果方法玻片法取小试管3只每管加兔血浆或人血浆(EDTA抗凝)0.5毫升挑取3-5个被检菌菌落与试验管血浆混匀同样操作取金黄色葡萄球菌标准菌株作为阳性对照管另一管不加任何细菌作为阴性对照管置37℃水浴每3-4h观察结果试管法无凝集结果阳性阴性有明显颗粒样凝集而盐水对照无凝集玻片法试管法阳性阴性试验管和阳性对照管出现明显凝胶块而阴性对照管不凝固观察到24小时仍无凝固发生

多数致病性葡萄球菌30~60min出现明显凝固少数菌株（中间型葡萄球菌）凝固力较弱，需孵育较长时间才可出现阳性。注意CAMP试验各种酶类试验B群链球菌能产生CAMP因子可促进葡萄球菌β溶血毒素的活性在两菌的交界处溶血力加强出现矢形溶血区原理在BAP上用金葡菌划种一横线将被测菌作垂直划线两线不能相交，距离0.3-1cm35℃孵育过夜同时应设阴阳性对照方法

无箭头样溶血区出现结果阳性阴性两划线交界处出现箭头样溶血区本试验所用血液不同而结果会有差异以羊血或牛血为宜用无菌盐水洗涤三次的羊红细胞效果更好所用基础培养基以胰酶肉汤琼脂较好注意胆汁溶菌酶试验各种酶类试验胆汁或胆盐可溶解肺炎链球菌细菌发生自溶，菌落消失。原理试剂

10%去氧胆酸钠或纯牛胆汁方法平板法可疑菌落上加10%去氧胆酸钠一环，于35℃15~30min观察结果。试管法被测菌培养物0.9ml+10%去氧胆酸钠0.1ml，35℃水浴10-30min观察结果。可疑菌落仍存在结果阳性阴性可疑菌落消失平板法试管法阳性阴性培养液由浊变清，对照管仍混浊培养液浊度无变化O/129试验抑菌试验O/129二胺基二异丙基喋啶可抑制弧菌属，出现抑菌环对气单胞菌属无抑制作用，无抑菌环。原理

含0.5%NaCL的M-H琼脂同纸片法药敏接种被检菌株贴10μg、150μg两种含量纸片35℃培养18小时，观察有无抑菌环培养基

方法

结果判定抑菌环结果150μg/片10μg/片有有S有无S/R无无R杆菌肽试验