基因编辑技术CRISPR-dCas9靶向去甲基化的研究与应用进展

基因编辑技术CRISPR/dCas9

靶向去甲基化的研究与应用进展［摘要］CRISPR/Cas9是对靶向基因进行特定DNA修饰的重要工具，Cas9的核酸酶剪切活性取决于两个结构域RuvC和HNH,当RuvC和HNH同时处于失活状态时，Cas9将不具有核酸酶活性，成为dCas9,应用CRISPR/dCas9系统使靶向调控DNA甲基化成为可能.多位研究者应用CRIS-PR/dCas9系统中，dCas9能与DNA序列结合的能力，将dCas9通过与TET1或DNMT3a等其他蛋白的融合，使其发挥转录因子的作用，促进或抑制基因的表达.本文综述了证明CRISPR/dCas9系统是能够编辑特定基因序列的DNA甲基化或DNA去甲基化的强大工具，可以应用在去甲基化的各种研究中，为临床治疗表观遗传、肿瘤等疾病提供新的研究思路.［关键词］CRISPR/Cas9系统；dCas9;去甲基化GeneeditingtechnologyCRISPR/dCas9

ResearchandApplicationProgressofTargetedDemethylationAbstract:CRISPR/Cas9systemisoneofgenomeeditingtechnologiesintargetedDNAmodification.EndonucleasesofCas9nucleaseshastwoactivefractionRuvCandHNH.TheengineereddCas9proteinbyinactivatingRuvCandHNHnucleasedomainsofCas9proteinplaysaroleingeneexpressionregulation.CRISPR/dCas9systemmaketargetedDNAdemethylationpossible.ResearchersmanipulatedthestructuresofdCas9thatcanattractDNAsequencebindingproteinswhichfusetodifferenttranscriptionfactorsforthepurposeofactivatingorinhibitinggenetranscrip-tion.AnddCas9fusedtotheepigeneticeffectorsTET1andDNMT3a,makingitplaytheroleoftranscriptionfactor,promotingorinhibitinggeneexpression.ThisreviewsummarizestheevidencethattheCRISPR/dCas9systemisapowerfultooltoeditDNAmethylationordemethylationofspecificgenomicsequences,andcanbeusedinvariousstudiesofdemethylationforclinicaltreatmentofepigeneticsandtumors.Keywords:CRISPR/dCas9system;dCas9;Demethylation表观遗传学是研究基因序列不发生改变的情况下，通过DNA甲基化、组蛋白修饰和空间结构域的改变调节控制基因表达的的一门遗传学的分支学科.在哺乳动物基因组中，大约70%的胞嘧啶残基在5'-CpG-3'都被甲基化，DNA甲基化操控着许多生物进程，现已证明DNA甲基化与许多疾病有关，包括肿瘤、印记疾病DNA甲基化是在DNA甲基转移酶的作用下，利用S-腺苷甲硫氨酸提供甲基，在CpG二核苷酸中胞嘧啶嘧啶环的五号碳原子上加上甲基的共价修饰过程.TET蛋白家族能转化5-甲基胞嘧啶为5-羟甲基胞嘧啶，从而启动去甲基化的过程'DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则可诱导基因的重新活化和表达.尽管DNA甲基化在许多生物进程中起重要作用，但由于缺乏广泛可行的技术在特定的靶点添加或移除甲基化，其在许多疾病中的致病影响并不清楚.在原理上，基因编辑技术可以应用在靶向表观遗传学治疗，但没有特异性的方法能移除甲基化.像5-aza-2'脱氧胞苷能抑制DNA甲基化转移酶，常被用来研究甲基化的转录起始点'3'.然而5-aza-2'脱氧胞苷是作用于整个基因组的去甲基化，很难针对特定的DNA甲基化区域进行去甲基化，如果使用其进行治疗性的应用会面对很多无法预料的问题.近年来，CRISPR/Cas9'4«这种基因编辑技术可以通过融合非催化活性核酸内切酶来补充特异位点的催化活性.CRISPR/dCas9系统应用dCas9能与DNA序列结合的能力，使其发挥转录因子的作用，融合TET结构蛋白家族在细胞中能羟化特定的位点，可以激活去甲基化.这样看来，CRIS-PR/dCas9技术的出现为DNA靶向去甲基化提供了条件.1CRISPR/dCas9系统的作用机制CRISPR/Cas9是对靶向基因进行特定DNA修饰的重要工具，其具有效率高、操作简单的特点.CRISPR/Cas9系统可以特异性的识别出外源DNA，并将它们切断，沉默外源基因的表达.CRISPR/Cas9系统是细菌针对噬菌体和质粒DNA入侵进化形成的一种获得性免疫系统.大约40%的细菌和90%的古细菌拥有CRISPR/Cas位点「7-9'.CRISPR/Cas系统按照其结构特点可以分为3大类型(I型、II型和III型系统)，它们的共同特点是RNA介导的核酸酶能够特异性地切割外源入侵的DNA，包括噬菌体和质粒DNA'5'.II型CRISPR/Cas系统鉴于其结构简单，目前被广泛应用于真核细胞的基因组编辑中.CRISPR位点由一系列短的重复序列(Repeats)构成，这些重复序列被具有相同长度的“间隔序列”隔开.间隔序列可与噬菌体基因组配对结合并使入侵细菌和古细菌的外源遗传物质降解.当外源噬菌体或质粒入侵宿主菌时，“重复一间隔”阵列被转录成长的crRNA前体.crRNA前体可被CRISPR-associate(Cas)核酸酶或者细菌内源RNA酶III在重复序列处切割，并释放出小的crRNA.然后crRNA与辅助小片段RNA(Trans-activatingcrRNA，tracrRNA)通过部分序列互补形成RNA二聚体，该二聚体能够被Cas9蛋白特异识别并形成RNA蛋白复合体，通过crRNA序列中的间隔序列介导Cas9核酸酶发现靶序列并降解侵入物的基因组.在自然状态下，Cas9由tracrRNA和crRNA前体介导至其靶点，在人工合成的系统中这2个短的RNA可以被融合成一个嵌合的导向RNA(guideRNA)"0，'「.CRISPR/Cas9系统由单链的guideRNA和有核酸内切酶活性的Cas9蛋白构成，能特异性识别靶基因序列，并在靶定位点剪切双链DNA，细胞的非同源末端连接修复机制重新连接断裂处的基因组，并引入插入或缺失突变，也可提供一个外源双链供体DNA片段通过同源重组整合进断裂处的基因组，从而达到对DNA修饰的目的「5，气CRISPR/Cas9系统能在293T、K562、iPS等多种细胞中，进行有效的靶向酶切，非同源重组、同源重组效率在3%~25%之间，并能在多个靶点进行靶向酶切.Cas9的核酸酶剪切活性取决于两个结构域:RuvC和HNH.这两个结构域分别负责切割DNA的两条链，并且这两个结构域能够单独地被人工点突变失活.化脓性链球菌中存在一种Cas9D10A突变体，这种链球菌Cas9的RuvC失活(RuvC-)，HNH仍有活性(HNH+)；另一种Cas9H840A的突变体的Cas9蛋白则呈现RuvC激活(RuvC+)和HNH失活(HNH-)的状态，但这两种突变体的Cas9仍然具有核酸酶活性，可对靶向序列进行剪切作用.当RuvC和HNH同时处于失活状态时（D10A&H840A；RuvC-&HNH-）,Cas9将不具有核酸酶活性，成为dCas9（deadCas9）.dCas9与靶向特定基因gRNA在细胞中共表达，则gRNA可以介导dCas9蛋白与DNA结合.如果dCas9结合到靶基因的阅读框内，可以阻断RNA聚合酶的延伸作用，如果dCas9结合到靶基因的启动子区域，则可以阻止基因转录的起始.研究者利用dCas9与DNA序列结合的能力，将dCas9与其他蛋白的融合，使其发挥转录因子的作用，促进或抑制基因的表达.2CRISPR/dCas9系统靶向去甲基化的研究DNA去甲基化催化酶在表观遗传调控中很重要，但尚不清楚这些胞嘧啶修饰如何被逆转.TET1是一种a-酮戊二酸和Fe2+依赖的双加氧酶，催化5-甲基胞嘧啶（5mC）转化为5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）,还可以从5mC以酶促活性依赖性的方式生成5-甲酰基胞嘧啶（5fC）和5-羧基胞嘧啶（5caC）「14'.He等”研究表明，TET1双加氧酶将DNA中的5mC和5hmC氧化为5caC后，被修饰的5caC被胸腺嘧啶-DNA糖基化酶（TDG）特异性识别和切除，再通过碱基切除修复途径使该位点转化为胞嘧啶，构成了活性DNA去甲基化的途径.来自中科院上海生化细胞所的胡荣贵研究员课题组的研究员Xu等用dCas9和gRNAs插入双拷贝的噬菌体MS2RNA元件，构建了修改的单导向RNAs（sgRNAs）（sgRNA2.0），从而有利于TET1催化结构域（TET1-CD）与dCas9或MS2外壳蛋白融合，进而结合到特定基因位点行驶DNA去甲基化功能.这个系统能显著上调的转录目标基因，并且dCas9/sgRNA2.0-directed去甲基化能高效针对目标基因，其脱靶率低.日本科学家SumiyoMorita等17更完整的应用dCas9融合TET1进行靶向去甲基化.失去剪切活性的dCas9融合具有催化活性的TET1（TET1CD），羟化特异性的位点以激活该位点的去甲基化.另外，加入SunTag补充TET1-CD，可以使TET1-CD的活性明显改善17.SunTag实质上是一套分子挂钩，其能够将多个拷贝的生物活性分子挂到可用来靶向一些基因或其他的分子的蛋白质支架上.相比于没有这些挂钩的组装分子，整合了SunTag的分子生物活性显著放大"8,多重复拷贝的TET1羟化酶和dCas9的融合极大地增强去甲基化的活性.SumiyoMorita等还证明，dCas9融合TET1的系统适用于在胚胎干细胞，癌细胞系，原代神经前体细胞和小鼠胎儿体内的操纵特定位点的甲基化，使体内治疗表观疾病成为可能.Liu等「20'早期研究表明，dCas9和TET1或DN-MT3a融合可以精确编辑CpG甲基化区域，可以使甲基化或去甲基化启动子序列激活或者沉默，无论在体外还是体内.脑源性神经营养因子W（BDNF2）或肌分化转录激活因子MyoD的靶向去甲基化作用可以通过融合dCas9-TET1加强，从而诱导BDNF在有丝分裂后的神经元中表达或激活MyoD促进成纤维细胞重编程为成肌细胞.新创靶向重新甲基化的CTCF环的位点，通过dCas9-DNMT3a融合蛋白阻断基因编码的转录因子CTCF绑定和干扰DNA循环，导致邻近基因环的表达改变.他们再一次证实了dCas9可以在体内应用于DNA甲基化.3CRISPR/dCas9系统靶向去甲基化的应用CRISPR/dCas9系统靶向去甲基化中的研究结果表明，TET1、DNMT3a和dCas9融合，代表了一个强大的能够编辑特定基因序列的DNA甲基化工具箱.Vojta等「2「研究表明，dCas9融合DNMT3a可用于两个人类基因启动子，Xu等和Choud-hury等f人研究表明，dCas9融合TET1可用于基因启动子去甲基化.应用CRISPR/dCas9系统可以使甲基化的编辑比以往更精准高效.Liu等冒利用其研究的DNA甲基化编辑工具来逆转超甲基化事件，证明了可以通过CRISPR介导的FMR1基因的DNA甲基化编辑来治疗脆性X综合征（FXS）.脆性X综合征（FXS）是男性最常见的智力残疾遗传形式，是由于FXS患者FMR1基因的沉默与FMR1的5,UTR中CGG扩展突变的超甲基化有关京.该研究设计了一个单一的sgRNA，以指导dCas9-TET1有效地使病理基因座中的CGG重复序列脱甲基.CGG扩展完全的去甲基化会导致CpG岛的甲基化不足，在启动子处增加H3K27乙酰化和H3K4三甲基化，减少H3K9三甲基化，并解锁基因的表观遗传沉默，从而恢复FXSiPSC和神经元中的FMRP表达，且无明显关闭定位效果.FMR1的表达噬菌体蛋白AcrIIA4抑制dCas9-TET1后，在编辑过的FXS细 学的发展提供了新的方法，为表观疾病的治疗提胞中其启动子的去甲基化作用恢复了突变神经元 供了可能.的野生型表型.并且在移植到小鼠脑部后，体内的编辑神经元中FMR1的重新激活得以维持.研究还证明有丝分裂后FXS神经元中CGG重复的去甲基化会重新激活FMR1,并逆转与FXS神经元相关的自发性过度活跃，即通过表观基因组编辑逆转基因失活可能是涉及表观遗传沉默的疾病的有效治疗策略.Wu等使用dCas9-DNMT3a系统来精确修饰SAMRCA2启动子的CpG岛，评估SMARCA2启动子甲基化在SMARCA2转录调控中的作用和其在肺癌发展中的抑癌作用.发现SMARCA2在肺癌中的表达下