腊梅花挥发油成分分析及生物活性初探

腊梅花挥发油成分分析及生物活性初探【摘要】目的研究腊梅花的挥发油成分及其抗氧化、抑菌活性。方法用气相色谱-质谱联用技术(G-S)结合Kvats保存指数(KI)比照的方法别离和鉴定腊梅花挥发油的组成和含量，通过β-胡萝卜素/亚油酸漂白体系和DPPH自由基去除体系评价其抗氧化活性，滤纸片法检测其对常见细菌的抑制活性。结果共鉴定出31种成分，主要为β-石竹烯(16.06%)，Elixene(14.65%)，β-榄香烯(9.26%)和β-荜澄茄油烯(6.42%);腊梅花挥发油具有较强的抗脂质过氧化物的才能(反响180in后对亚油酸氧化的抑制率仍为52.08%)，但是对DPPH自由基的去除才能一般(反响18h后去除率仅为16.38%);抑菌实验显示其对常见的6种革兰氏阳性细菌和3种革兰氏阴性细菌均有抑制作用。结论腊梅花挥发油含有大量的活性成分，具有较强的生物学活性。【关键词】腊梅花;挥发油;气相色谱-质谱联用;抗氧化活性;抑菌活性Abstrat：bjetiveTstudytheainheialpnentsftheessentialilfrtheflerfhinanthuspraex(L.)LinkandthEirantixidantandantiirbialativites.ethdsTheheialnstituentsftheessentialilfrtheflerfhinanthuspraex(L.)LinkereidentifiedbyG-SandtheKvatsretentinindex.Theantixidantativityasalsinvestigatedithtdifferentethds:the1,1-diphenyl-2-pirylhydrazyl(DPPH)radialsavengerandtheβ-artene/linlEIaidbleahingtest.Theantiirbialativityastestedbyadisdiffusintest.ResultsThirty-nekindsfvlatilepnentsereidentifiedbyβ-aryphyllene(16.06%),Elixene(14.65%),β-Eleene(9.26%)andβ-ubebene(6.42%)respetively.Theresultsfantixidantativityshedthattheilhadhigherantilipidperxideability(Theinhibitinratetardslinleiaidasstill52.08%after180in),buteakerabilityfsavengingDPPHradial(ThelearaneratetardsDPPHasnly16.38%after18h).Theilasalsfundtstrnglyinhibitthegrthf9bateriatested.nlusinAlargeauntfheialpnentserefundintheessentialilfrtheflerfhinanthuspraex(L.)Linkandexhibithighbilgialativities.Keyrds：hinanthuspraex(L.)Link;Essentialil;G-S;Antixidantativity;Antiirbialativity腊梅hinanthuspraex(L.)Link是腊梅科腊梅属落叶灌木,为我国特有,生长于亚热带潮湿的常绿落叶阔叶混交林地带。腊梅属植物的叶、花都散发香气，含有挥发性的芳香油等挥发性成分，是我国传统的庭院名花和园林绿化植物,具有色、香、形、姿的欣赏价值[1]。腊梅的花具有诸多的药理功能,可用于治疗感冒、解热镇痛、止咳化痰、降压、改善免疫系统和提取香精等[1～2]。有关腊梅花化学成分的研究已有文献报道，主要包括生物碱类成分、黄酮类成分、香豆素类成分[2，3]等。利用气相色谱-质谱联用技术(G-S)研究植物挥发性成分也有较多文献报道，但对于腊梅花中挥发性成分的研究，目前还处于不断完善中，有关其抗氧化、抑菌活性的研究尚未见报道。本实验利用气相色谱-质谱联用技术(G-S)结合别离峰Kvats保存指数(KI)匹配的方法首次对腊梅花挥发油进展定量分析鉴定;用滤纸片法测定了挥发油对9种常见细菌的抑制活性;以BHT(2,6-二叔丁基对甲酚)作为阳性对照，采用DPPH自由基去除体系和β-胡萝卜素/亚油酸漂白体系初步评价其抗氧化活性，以期为充分开发和利用腊梅资源提供理论根据。1材料与仪器1.2试剂DPPH(2,2-diphenyl-2-pirylhydrazyl)由日本东京化成工业株式会社提供;BHT由Applihe公司提供;亚油酸由Researhrganis公司提供;β-胡萝卜素购自Biheika公司、Teen-40购自Siga公司;甲醇、氯仿、丙酮、无水乙醇等由西安化学试剂厂提供，均为分析纯;超纯水;牛肉膏蛋白胨培养基。1.3菌种白色葡萄球菌(Staphylusepideridis)A113，大肠杆菌(Esherihiali)A70，凝结芽胞杆菌(Baillusagulans)A89，藤黄八迭球菌(Sarinaluteu)A119，金黄色葡萄球菌(Staphylusaureus)26003，枯草芽胞杆菌(Baillussubtilis)A20，购自西安微生物研究所。肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneuniae)1.1736，普通变形菌(Prteusvulgaris)1.1208，表皮葡萄球菌(Staphylusepideridis)1.2429，购自北京微生物研究所。1.4仪器G-S-QP2022型气相色谱-质谱联用仪，日本SHIADZU公司产品;FZ102微型植物粉碎机，黄骅市中兴有限责任公司产品;RE-52AA旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂产品;Q/BKYY31-2000型电热恒温鼓风枯燥箱，上海跃进医疗器械厂产品;SL202N型药物电子天平，上海明桥精细科学仪器产品;HH-6B数显恒温水浴锅，国华电器产品;恒温恒湿培养箱，广东省医疗器械厂产品;LS-3250高压蒸气灭菌锅，SANY公司产品;万用电炉，上海树立仪器仪表产品;共水蒸馏装置;超净工作台。2方法2.1挥发油的提取称取新颖腊梅花830.00g，按?中国药典?2022年版Ⅰ部附录方法提取挥发油，得到浅黄色挥发油约0.89l，密封，4℃保存，备用。2.2G-S分析2.2.1G条件RTX-5S型弹性石英毛细管(0.25×30，0.25μ);柱前压75.40kPa;载气为高纯度氦气(99.999%);柱内载气流量1.26l/in;分流比为20∶1;升温程序：从50℃开场，以15℃/in升至90℃，再以5℃/in升至280℃，保存1in;汽化室温度为250℃。S条件：EI源，离子源温度200℃;接口温度250℃;电子能量70eV;倍增器电压0.9kV;溶剂延时4in;扫描范围40～600au。样品稀释1000倍进样，进样量2μl。2.2.2定性定量方法各色谱峰相应的质谱图经人工解析、NIST27和NIST147谱库检索定性，利用同型别离柱(RTX-5)测定的标准物质的KI值计算各峰的KI值，同时与KI的标准文献值进展比照来确定挥发油的组分，文献中没有KI值的组分那么采用质谱库检索的结果[4]。定量分析采用峰面积归一法计算各成分的相对百分含量。利用同型别离柱(RTX-5)测定的标准物质的KI值计算各峰的KI值[4，5]：KI=100n+100(tx-tn)/(tn+1-tn)式中，tx为测定物质的保存时间，n为相应正烷烃的碳原子数，tn、tn+1分别为碳原子数相差为1的正烷烃(tntxt)流出峰的保存时间(in)。2.3抗氧化活性测定β-胡萝卜素/亚油酸漂白体系：取6l0.1g/l的β-胡萝卜素的氯仿溶液，参加40μl亚油酸和400μlTeen-40，旋转蒸馏至氯仿完全挥干后，参加200l去离子水，超声溶解，得乳状液A。取5l乳状液A参加200μl2g/L样品腊梅花挥发油甲醇溶液，50℃孵育，检测波长470n，180in内每隔20in测定一次吸光度。以BHT为阳性对照，每组实验均平行3次。以测定的吸光度值计算腊梅花挥发油以及阳性对照BHT在β-胡萝卜素所建立的乳化体系中的抑制率[4～6]。抑制率(I%)的计算可按照下面的公式。I%=(1-Rsaple/Rntrl)×100%式中，Rsaple为样品腊梅花挥发油以及阳性对照BHT的降解速率，Rntrl为实验阴性对照甲醇的降解速率;R=ln(a/b)×(1/t)，其中，t为时间(in)，a为t=0in时的吸光度，b为t=20,40,…180in时的吸光度。DPPH自由基去除体系：将2g/l的样品腊梅花挥发油2l参加2×104l/L的DPPH1l的甲醇溶液中，50℃水浴18h后，在517n波长测定吸光度值。以0.2g/lBHT为阳性对照，每组实验均平行3次。对DPPH的去除率(I%)可用下式计算[3,4,7]：I%=(1-Asaple/Antrl)×100%式中，Antrl为1lDPPH溶液+2l甲醇的吸光度，Asaple为1lDPPH溶液+2l样品溶液、BHT溶液的吸光度。2.4抑菌活性的测定将各菌种[8]接种于牛肉膏蛋白胨培养基，培养18～24h后，制备成菌悬液，菌悬液浓度调在106～107fu/l。取0.ll菌液于培养基外表并涂布均匀。将直径为6已灭菌的滤纸片，浸于15μl的挥发油，贴于平板上，以0.5g/l盐酸四环素作为阳性对照。4℃放置2h后，移至恒温恒湿培养箱中37℃下培养24～36h。测量抑菌圈的直径[9～11]，实验重复3次。转贴于论文联盟.ll.3结果3.1挥发油成分鉴定及分析G-S技术是植物挥发油成分鉴定的常用方法，G-S结合别离峰Kvats保存指数(KI)匹配的方法可大大进步化合物鉴定的准确性[4～7]。从表1可以看出，腊梅花挥发油以单萜和倍半萜类物质为主，占总量的78.72%，其中单萜类物质含量较少为2.82%，倍半萜类物质占总量的75.9%。β-石竹烯(16.06%)、Elixene(14.65%)、β-榄香烯(9.26%)、β-荜澄茄油烯(6.42%)、大牛儿烯B(4.53%)、α-香柠檬烯(3.93%)、δ-杜松烯(3.66%)、法呢烯(3.51%)和胡萝卜醇(2.42%)是其特征组分。并检测出的4种成分：Elixene(14.65%)、9-十八烯醇(0.60%)、9-二十六碳烯(0.30%)和土青木香烯(0.52%)在前人研究的文献中尚未见报道。表1腊梅花挥发油成分组分及其相对含量3.2抗氧化活性检测结果3.2.1β-胡萝卜素/亚油酸漂白体系β-胡萝卜素/亚油酸漂白体系主要评价的是抗氧化物质在乳化脂质体系中的抗氧化才能[5，6]。从图1可以明晰地看出吸光度值随时间变化的规律，样品的吸光度值的下降速率要明显快于阳性对照BHT。样品腊梅花挥发油的降解速率从刚开场的61.00%下降至52.08%，吸光度值下降了0.304;而阳性对照BHT的降解速率那么从开场的83.41%下降至70.76%，吸光度值下降了0.204。也就是说，通过β-胡萝卜素/亚油酸检测，样品腊梅花挥发油具有较强的抗氧化活性，但是要低于阳性对照BHT，因为它是天然的抗氧化物质，也具有进一步开发利用的价值。图1腊梅花挥发油的抗氧化活性(β-胡萝卜素/亚油酸漂白体系)3.2.2DPPH自由基去除体系DPPH自由基在有机溶剂中是一种稳定的自由基，其甲醇溶液在517n附近有强吸收(显深紫色)。当有自由基去除剂存在时，孤对电子被配对，该物质颜色由紫色变为黄色，通过测定517n处吸收的变化或观察其颜色的变化可评价自由基去除剂抗氧化活性的大小[12]。抑制率(I%)可以反映出对自由基的去除作用，抑制率越大，抗氧化活性越强，反之那么弱。如图2所示，用β-胡萝卜素漂白法检测，样品的抗氧化才能较强，180in后样品仍具有较高的抑制率为52.08%，BHT的抑制率为70.76%。但是经DPPH自由基去除体系检测，样品在18h后抑制率从31.62%下降至16.38%，下降了15.24%;阳性对照BHT却从86.57%下降至79.89%，下降了6.68%。以上结果说明，腊梅花挥发油具有较强的脂质过氧化抑制才能，但是对自由基的去除才能一般，这可能与其挥发油的成分组成是相关的[4，12]。图2腊梅花挥发油的抗氧化活性(DPPH自由基去除体系与β-胡萝卜素/亚油酸漂白体系的比拟)3.3抑菌活性检测结果如表2所示，腊梅花挥发油对所实验的9种常见细菌表现出不同强度的抑菌活性。其中对于白色葡萄球菌的抑制效果最明显，抑菌圈直径为23.59，与盐酸四环素(25.59)相当。对于普通变形菌的抑制才能最低，抑菌圈直径为9.28，远远小于盐酸四环素(18.58)，而对其他7种细菌的抑制才能表现适中。表2滤纸片法测定结果4讨论采用共水蒸馏装置提取腊梅花中的挥发油，并用G-S结合别离峰Kvats保存指数(KI)匹配的方法，准确、快速鉴定了腊梅花挥发油中的31种主要成分。腊梅花挥发油成分以单萜和倍半萜类化合物为主,占总量的78.72%;其中β-石竹烯(16.06%)、Elixene(14.65%)、β-榄香烯(9.26%)、β-荜澄茄油烯(6.42%)、大牛儿烯B(4.53%)、α-香柠檬烯(3.93%)、δ-杜松烯(3.66%)、法呢烯(3.51%)和胡萝卜醇(2.42%)是其特征组分。并且检测出4种新的成分：Elixene(14.65%)、9-十八烯醇(0.60%)、9-二十六碳烯(0.30%)和土青木香烯(0.52%)。已报道的江婷等[13]分析的腊梅花挥发油的主要成分为α-法呢烯(9.833%)，大香叶烯D(9.693%)，石竹烯(8.757%)和β-榄香烯(7.252%)，本实验所鉴定出的组分与结果与其在含量和组成上有一定差异，二者的特征组分也不尽一样，这可能是由于研究测试的材料来源、提取及检测方法不同所致。在β-胡萝卜素/亚油酸体系中，腊梅花挥发油在180in后仍然具有很高的抑制率(52.08%)，说明样品具有很高的抗脂质氧化物的活性。在DPPH自由基去除体系中，腊梅花挥发油的抑制率数值较低而且下降很快，说明样品对于DPPH自由基的去除才能不是很强。这可能与样品的化学组分有关，β-石竹烯(16.06%)和δ-杜松烯(3.66%)，这2个倍半萜烯具有一定的自由基去除才能，但反响速度缓慢;橙花叔醇(0.21%)的羟基属于烯丙基上的叔醇基，不但没有提供质子的才能，甚至还表现出一定的氧化性质[3，12]。腊梅花挥发油对革兰氏阳性、阴性细菌都具有抑制作用，通过抑制细菌的生长，就可以预防相应疾病的发生。它对于白色葡萄球菌的抑制才能最强，对于普通变形菌的抑制才能最低。抑菌活性的强弱与其化学组分有关，α-松油醇(0.67%)对很多细菌、真菌具有抑制作用，如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、表皮葡萄球菌、白色念珠菌[11];氧化丁香烯(1.95%)尽管在此油中含量较少，被认为具有很有效的抗菌特性[10];另一个含量较少的单萜类物质沉香醇(0.78%)被报道它对很多种细菌、真菌具有抑制活性[14]，总之但是其抑菌机理还不是很清楚，有待进一步的研究[8，11]。总的来说，在腊梅花的挥发油中,有许多具有生物活性的物质。腊梅花具有较强的抗氧化活性，对常见的致病菌具有很明显的抑菌效果，具有较广的抗菌谱，提示了腊梅具有良好的药用价值和开发前景。本文对其抗氧化、抗菌活性进展了初步研究，不仅为说明其作用机制提供了研究思路，也为该资源的开发提供了一定的理论根据。【参考文献】[1]中国科学院植物研究所.中国植物志[].北京:科学出版社,1979:1.[2]肖炳坤,刘耀明.蜡梅属植物分类、化学成分和药理作用研究进展[J].现代中药研究与理论,2022,17(2):59.[3]朱华年,朱永胜,胡丰林.腊梅叶提取物的去除自由基活性及薄层色谱和液质联用分析[J].安徽农学通报,2022,13(16):30.[4]钟瑞敏,张振明,王羽梅.杨梅叶芳香精油的成分鉴定及抗氧化活性[J].华南理工大学学报(自然科学版),2022,34(3):49.[5]SinghG,auryaS,DelapasnaP,etal.Aparisnfheial,antixidantandantiirbialstudiesfinnanleafandbarkvlatileils,leresinsandthEirnstituents[J].FdheTxil,2022,45(9):1650.[6]TepeB,AkpulatHA,Sken,etal.Sreeningftheantixidativeandantiirbialprpertiesftheessentialilsf