小鼠脾脏细胞原代培养和观察计数

适用文档小鼠脾脏细胞原代培育及察看计数【实验目的】学习掌握细胞培育的基本源理以及详细方法，并对小鼠脾细胞进行原代培育；掌握无菌操作的详细过程及无菌操作台的使用；学习掌握染色法鉴识细胞的生死状态的原理及方法；学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数；【实验原理】细胞培育细胞培育指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和生殖，并且保持其结构和功能的一种培育技术。动物细胞培育可分为原代培育和传代培育。从供体获取组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分别等方法，将动物组织分别成单个细胞开始首次培育长出单层细胞的方法称为细胞的原代培育。当培育的动物细胞生长增殖达到必然密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分别成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比率转移到另一个容器中扩大培育的方法，称为细胞的传代培育。传代培育的累计次数就是细胞的培育代数。高等生物是由多细胞组成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的。但假如把活细胞拿到体外培育、增殖并进行察看和研究，则要方便和简单得多。被培育的动物细胞是特别好的实验对象和实验研究资料，对体外培育的活细胞进行研究能够帮助人类揭开生、老、病、死的规律，研究优生、抗衰老和防治各样疾病的门路和体系，也能够人为地引诱和改变细胞的遗传性状和特点，使其向有利于人类健康长寿的方向发展。因此动物细胞体外培育技术是研究细胞分子体系特别重要的实验手段，被宽泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。细胞培育的意义:拥有其他生物技术无可比较的优点；培育条件易改变和控制，便于单因子解析；便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的察看；在生物学的各个领域（如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等）已被宽泛应用。细胞培育的限制性：在走开机体复杂环境下，细胞培育条件与躯体环境有必然距离；察看到的结果有时难以正确反应机体内的状况；细胞培育获取的产物少。培育细胞的条件有水的质量、无菌环境，最适温度、浸透压、气体条件、最适PH、营养条件和培育基质等。细胞死活判断细胞生死状态的鉴识方法主假如化学染色法和荧光染色法。活细胞和死亡细胞在生理技术和性质上主要存在一下差别：细胞膜通透性的差别：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只赞同物质选择性地经过；而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。鉴于此，发展出了以台盼蓝、伊红、苯胺黑、赤藓红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙啶或溴化乙啶等为染料鉴识细胞生死状态的方法，上述染料能使死亡细胞着色，而活细胞不被着色。其他，应用植物质壁分其他性质也可判断植物细胞的生死状态。活细胞的原生质拥有选择透过性，死细胞因其原生质的选择透过性已遭损坏，故与高浸透压溶液接触时不产生质壁分别。文案大全适用文档②代谢上的差别：活细胞中新陈代谢作用强，细胞内的酶拥有较强的活性和复原能力。鉴于此，发展处了以荧光素二乙酸酯（FDA）、荧光素二丙酸酯、荧光素二丁酸酯或荧光素二苯甲酰酯等酯化的荧光素鉴识细胞生死状态的方法，上述酯化的荧光素亲脂性提高，简单被细胞吸取进入，活细胞内的酯酶拥有较强的活性，可将酯化的荧光素分解而释放出能发荧光的荧光素，该物质不能够自由透过活的细胞膜，积累在细胞内，荧光显微镜下显示有光明的绿色或黄绿色荧光；而死亡细胞内的酯酶因失去活性，不能够分解酯化的荧光素，荧光显微镜下显示不发光。其他，可用亚甲基蓝为染料判断酵母细胞的生死状态。亚甲基蓝是一无毒染料，氧化型为蓝色，复原型为无色。活细胞因拥有较强的复原能力，能使亚甲蓝从蓝色的氧化型变成无色的复原型，故活的酵母细胞在用亚甲基蓝染色后显示无色；死亡酵母细胞或代谢迟缓的衰老酵母细胞，因无复原能力或复原能力极弱，使亚甲蓝仍处于氧化态，故表现蓝色或淡蓝色。C.血球计数板的使用血球计数板是一块特制的厚载玻片，载玻片上有4条槽而组成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分开成两半，每个半边上面各有一个方格网(如图3)。每个方格网共分9大格，其中间的一大格(又称为计数室)常被用作微生物的计数。计数室的刻度有两种：一种是大方格分为16其中方格，而每其中方格又分红25个小方格；另一种是一个大方格分红25其中方格，而每其中方格又分红16个小方格。可是不论计数室是哪一种结构，它们都有一个共同特点，即每个大方格都由400个小方格组成(图4)。每个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为221mm，每个小方格的面积为1／400mm，盖上盖玻片后，盖玻片与计数室底部之间的高度为0.1mm，因此每个计数室(大方格)的体积为30.1mm，每个小方格的体积3(或中方格)中微生物的数量，再换算成为l／4000mm。使用血球计数板直接计数时，先要测定每个小方格每毫升菌液(或每克样品)中微生物细胞的数量。图1血球计数板的结构（a、平面图；b、侧面图）文案大全适用文档图2血球计数板网格的分区和分格【实验用品】资料小鼠脾脏；试剂PBS缓冲溶液、培育液、台盼蓝、伊红；器材解剖剪、解剖镊、眼科剪、眼科镊、培育皿、纱布块、吸管、橡皮头、烧杯、移液枪、注射器、针头、Eppendorf管（上述器具完整冲刷、消毒、烤干、包装好）；倒置相差显微镜、酒精灯、酒精棉球、试管架、解剖板等。【操作步骤】原代脾细胞培育1)取材：取小白鼠一只，采用断头法处死，清水洗净小白鼠并浸于75%酒精中灭菌3min，取出转入超净工作台内的解剖盘内，无菌操作翻开腹腔，取出脾脏，去除周围的脂肪组织，镊起脾脏用PBS液自上而下冲刷1-2次，转入无菌玻璃培育皿中，待用。2)分别脾细胞：用滴管先向上述无菌玻璃培育皿中滴入PBS液30滴，再用L形针头注射器在皿内吸取PBS液0.2ml，此后将其沿脾脏长轴方向注射入脾内，用针尖在脾脏上刺眼，并用L形针头轻刮脾脏表面挤出脾细胞，用滴管吸皿中的PBS液冲刷脾脏并吹散挂出的脾细胞，稍微倾斜并静置1-2min，吸取上述静置后的脾细胞悬液上清部分放入Eppendorf管，以3000转/分别心1-2min。3)培育脾细胞：从超净工作台中区塑料培育皿一个，用“枪（1ml）”加入细胞培育液2ml，并在皿上做记号，待用。取上述离心后的Eppendorf管，在超净工作台内翻开弃去上清液，用“枪（200μl）”吸取塑料皿中的培育液400ul，加入弃去上清液的Eppendorf管中，用枪头吹匀管底的脾细胞，此后吸取200ul脾细胞悬液接种于上述塑料培育皿中，混匀，此后放入37℃二氧化碳培育箱中培育。文案大全适用文档细胞死活判断台盼蓝法：试剂配制：用生理盐水配置0.4%台盼蓝染液，备用。细胞悬液制备：将生长有贴壁型细胞的培育瓶（皿）中的培育液倒入洁净试管中，向培育瓶（皿）中加入0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA混淆消化液1-2ml，静置3-5min，待见到细胞变圆，互相不连结为止，弃去混淆消化液并将上述试管中的培育液倒回培育瓶中，用滴管轻轻吹打细胞，制成细胞悬液。3)染色制片：取0.5ml细胞悬液放于洁净的试管中，加1-2滴（约0.1ml）染液，混淆，2min后制成临时装片，镜检。染色结果：死细胞染成蓝色，活细胞不着色。C.用血球计数板进行细胞计数1)染色计数：取上述步骤二所制备0.5ml细胞悬液放于洁净的试管中，加1-2滴（约0.1ml）染液，混淆2-5min，滴加少许染色后的细胞悬液于放有盖片的血球计数板的斜面上，使悬液自然充满计数板小室（注意：不要使小室内有气泡产生，否则要从头滴加；在一般光镜10物镜下计数四个大格内的细胞数，压线者数上不数下，数左不数右）。依据染色结果计算活细胞率：依据死细胞染成蓝色、活细胞不着色的原则计数死细胞数和细胞总数，以以下公式计算细胞存活率：细胞总数-死细胞数活细胞率（%）100%细胞总数【实验结果】细胞原代培育结果：在倒置显微镜下，原代培育的细胞清楚可见，细胞齐集于培育液中，多呈圆形，形状规则，细胞质平均。培育液由于未被杂菌污染而呈粉红色，无异味。文案大全图1倒置显微镜下细胞原代培育图示（10×40）适用文档细胞死活判断结果：经台盼蓝染色后，死细胞由于其细胞膜失去选择透过性而被染成蓝色经台盼蓝染色后，活细胞由于其细胞膜拥有选择透过性而未被染成蓝色图2台盼蓝染色后死活细胞所呈状态（10×10）细胞计数结果：用血球计数板计数，分别计算了红细胞计数地区的五个小方格，计数结果以下：项目12345细胞总数1114112018活细胞数13243每其中格平均细胞总数为14.8平均活细胞数为2.6活细胞率=活细胞数/细胞总数×100%=13/74×100%=17.6%细胞密度=大方格中细胞数×10000×稀释倍数=14.8×16×10000×10=2.37×107/ml【注意事项】1、小鼠必然要将血放洁净并且在酒精中充分浸泡3min，防范杂菌污染无菌操作台；2、为近一步保证无菌操作台的无菌环境，可在玻璃挡板口点一酒精灯，一般操作都在酒精灯火焰旁操作；3、取小鼠脾时注意保持其圆满，注入缓冲液要慢而准且合适，不要撑破脾脏，保证细胞分别游离出来，也不能够使游离的细胞中含有块儿状物质；4、培育液PH为7.0～7.4，其中加有酚酞，正常状况细胞生长过程代谢物使PH下降，培育液的颜色改变呈黄色，因此可经过培育液颜色变化初步判断细胞生长状况；5、生长状况优秀的细胞膜和核圆满，细胞质透明，而细胞质出现好多颗粒状或空泡证明细胞衰老。除游离期和衰败期外细胞一般贴壁生长。游离期细胞一般圆形，折光率高，而衰败期细胞皱缩，透明度下降，立体感很差，较易划分；6、倒置显微镜将物镜与载物台间的空间解放，能够赞同连同培育皿一起察看。【思虑题】文案大全适用文档控制肿瘤细胞增殖药物的精选方法1）MTT解析法以活细胞代谢物复原剂3-（4，5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3，5-di-phenytetrazoliumromide，MTT噻唑蓝为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数量成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能够将MTT复原）。复原生成的formazan结晶可在含50%的N，N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（pH4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490nm处的光密度OD值，以反应出活细胞数量。也能够用DMSO来溶解。MTT粉末和溶液保留时都需要避光，用铝箔纸包好就能够。实验的时候我一般封闭超净台上的日光灯来避光，感觉这样比较好。步骤：接种细胞用含10%胎小牛血清得培育液配成单个细胞悬液，以每孔1000－10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul。b)培育细胞同一般培育条件，培育3－5天（可依据试验目的和要求决定培育时间）。c)呈色培育3－5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配）20ul.连续孵育4小时，停止培育，小心吸弃孔内培育上清液，关于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培育上清液。每孔加150ulDMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。d)比色选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸取值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。2）NCI所用的体外化疗药物精选法简单地说，NCI的体外化疗药物精选系统由60种不同样的人体肿瘤细胞株组成，测定每个受试化合物在必然浓度范围控制各肿瘤细胞的生长的能力或细胞毒性程度。以常例采用的精选试验为例，在实验开始前一天，所有60种肿瘤细胞株细胞先接种在96孔细胞培育板上，此后将受试化合物10倍梯度稀释，一般最高浓度采用10－4mol。每种化合物试验5种不同样浓度。样品加入细胞悬液后培育48小时。今后用细胞染色法测定细胞的生长曲线，用sulforhodamine染色，再测定吸光度用以估计细胞数量。依据比色结果画出60条剂量一反应曲线，此后计算出50％生长控制浓度（GI50），100％生长控制浓度（TGI）以及50％细胞死亡浓度（LC50）。再将各细胞系的GI50、TGI和LC50汇总画出均数图，今后图能够大概看出该化合物对不同样的肿瘤细胞株的控制能力。此后用计算机进行计算、模拟、比较，议论受试化合物的特点是否与某一类已知化疗药物近似，进而推断可能存在的抗癌体系。据统计，NCI到当前为止已精选了近460000种化合物。用NCI体外化疗药物精选系统得出的数据也可用于指导将来对主要化合物的改造，使化合物的药理及毒理性质更加理想。）以分子生物学为基础的化疗药物精选方法近来几年来，对肿瘤的分子生物学研究获取了很大的进展，这给化疗药物的发展供给了一些新的目标。现在已有好多采用X射线衍射、蛋白结晶、基因配同样方法来推断及设计抗癌药物。这些方法经常开拓了一些崭新的门路，但其缺点是这些化合物不用然对肿瘤细胞有选择性。其他，这些化合物能否能进入肿瘤细胞也是一大问题。因此，任何采用非细胞系统精选的化合物都必然经过细胞系统以及合适的动物模型的检文案大全适用文档定才能进入临床试验。）经典的化疗药物精选模型1985年NCI成立体外细胞精选系统。在此以前，NCI抗癌药物的精选方法主要采用体内肿瘤模型来进行。将白血病细胞株L1210及P388植入免疫缺点鼠体内，待肿瘤长成后再赏赐不同样剂量的精选化合物，此后察看所试化合物能否能控制肿瘤细胞的生长，甚至使肿瘤细胞死亡、消失。此后再作计算解析，得出最小控制剂量、中位控制剂量、LC50等指标；以这些指标作为权衡受试化合物的抗癌作用强度。这一方法的优点是获取的药物可穿过细胞膜以及某些生理屏障，缺点是所获取的药物仅对迅速分裂的肿瘤（如白血病、淋巴瘤）疗效较好，而对实体瘤的治疗远不尽人意。针对这一问题，NCI在1985年抗衡癌药物的精选过程作了以下重要改变：①利用以肿瘤种类为指导的体外细胞精选法取代体内精选法；②利用实体瘤细胞株取代白血病细胞株；③用相对小量的原始资料用于初筛；④从头重申利用生物实验指导天然物中具抗癌活性成分的精选。体内实验的免疫缺点鼠肿瘤模型现已不常用于药物的初筛，而常例用于对初筛所得的先导药物作进一步测试以察看评估化合物对不同样的实体瘤的治疗作用。引诱肿瘤细胞发生凋亡的药物精选方法：用米托蒽醌、顺铂、羟基喜树碱、高三尖杉酯碱引诱Jurkat细胞凋亡，并经过AnnexinV/PI法检测细胞凋亡及细胞死亡比率，解析不同样作用时间以及不同样药物浓度对Jurkat细胞凋亡的影响。资料和方法资料Jurkat细胞系由本实验室保留。顺铂（CDDP）为齐鲁制药有限企业产品、羟基喜树碱（HCPT）为黄石飞