大分子技术课件

生物大分子的分离、纯化、鉴定、定量技术

总论常用生物大分子的分离纯化技术特殊要求的分离纯化方法

生化与分子生物学生化与分子生物学的研究对象：生物内的分子生化：所有生物体内的分子，包括糖类、脂类、蛋白质、核酸、有机小分子等代谢与调控

分子生物学：最初是生物大分子，即蛋白质、核酸,现也是所有细胞内的分子,是生物化学的高级阶段,基因水平分子医学分子遗传学分子免疫学分子病理学分子药理学分子毒理学分子检验学分子肿瘤学……分子生物学已成为工具性学科，已渗透到生命科学领域包括医学的每一分支学科中,从这点讲它已不是独立的学科.诺贝尔奖近百年的历史，在91项生理学或医学奖中有31项与生化与分子生物学有较密切的关系，而化学奖中则有34项相关；尤其是20世纪五十年代以来，52％的生理或医学奖和40％的化学奖属于生化与分子生物学领域，二者之和相当于另外设立了一个生化与分子生物学诺贝尔奖。生化技术与分子生物学技术生物化学技术------分子的分离纯化鉴定定量包括分光、层析、电泳、离心、超滤等分子生物学技术------基因、分子水平的系列操作，把生化、微生物免疫等技术相结合形成系统，包括PCR技术、基因克隆表达技术、分子杂交印迹、单克隆抗体技术、RNAi技术、基因敲除、基因诊断与基因治疗、芯片技术、mRNA差异显示技术等

1.电泳技术2.层析技术3.分光技术4.离心技术5.超滤技术一、大分子分离纯化常用生化技术特点：与化学产品的分离制备相比较，生物大分子的制备有以下主要特点：⑴生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至几千种化合物。⑵许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离纯化的步骤繁多，流程长。⑶许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制备最困难之处。⑷生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子强度等各种影响因素对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断。

二、生物大分子分离纯化的操作（二）基因组DNA制备1、破碎、裂解细胞（胍、SDS等）2、除蛋白、组织碎片：离心、饱和酚或酚氯仿抽提3、除RNA：RNase（不含DNase或50ºC处理）4、除盐等小分子：乙醇沉淀，12000rpm以上离心5、进一步纯化，除痕量蛋白等杂质：蛋白酶K、酚氯仿抽提、柱层析，密度梯度超离心注意1、机械切力：人基因组100Kb，噬菌体50Kb。2、DNase：需要二价阳离子，EDTA螯合二价阳离子3、温度：45ºC以上

DNase失活，冰浴操作，或50ºC左右处理。4、乙醇沉淀不能除高浓度的EDTA，用作PCR模板的DNA溶液如含高浓度的EDTA，使Taq酶活性抑制，需要透析或层析除去。5、液氮中充分研磨，对防止DNase降解效果较好1.2.完整的真核DNA3.DNA4.DNA+HindIII5.完整的真核DNA6.酶解的DNA7.DNA+HindIII1234567注意：防RNaseRNasin，专一抑制剂（蛋白），酚抽提可除RNasin。DEPC处理水、浸泡/1200C消毒，1800C烤器皿，胍盐中储存，乙醇沉淀可除去胍盐氧钒核苷复合物（较难除去）（四）质粒载体质粒是基因组DNA以外的共轭闭环双链小分子DNA，常用基因工程载体特点：自我复制松弛型——高拷贝严谨型——低拷贝具有抗性标志和插入失活标志多酶位点不相容性123452为质粒，可见2种构型，3为单酶切质粒，4为双酶切质粒，1、5为MARKER构型：超螺旋线状开环12345操作1．将过夜培养的2ml细菌（测序用质粒抽提请用5ml细胞），高速离心1分钟，彻底去除上清。2．加入100μlSolutionI，用枪头或振荡器充分悬浮细菌。注意：对于低拷贝数的质粒，请用5ml细胞；质粒如果用于全自动荧光测序分析，请用5ml细胞，无需提高SolutionI，Ⅱ和Ⅲ的用量。3．加入200μlSolutionⅡ，立即上下颠倒或用手指弹管底，使细菌裂解，室温放置（2分钟左右）至溶液变成澄清。4．加入400μlSolutionⅡ，立即上下颠倒5—10次，使之充分中和，室温放置2分钟。注意：步骤2和3在冰上操作效果更佳。5．高速离心，12,000转/分钟，10分钟。无需低温离心。注意：提高离心速度，使沉淀更加紧密，步骤6[实验操作]取上清更为方便。6．取出2ml样品收集管和3S柱，在管壁标上样品号，将步骤5中的上清全部转移到（吸或倒入）3S柱子里。盖上离心管盖子（盖子也可以不盖，但是如果您同时有很多样品，担心混淆或弄翻溶液，建议您盖上盖子），室温放置2分钟（室温放置时间不重要，可长可短）；用台式离心机室温高速（12,000转/分钟）离心1分钟。注意：转移上清时不要吸取沉淀，否则会出现染色体DNA和蛋白质污染。离心管盖子盖上时，柱子内压的增加，可能会使部分溶液从柱子底部流出，为正常现象。7．取下3S柱，弃去掉收集管中的废液，将3S柱放入同一支收集管中，吸取500μlWashSolution到3S柱，高速离心1分钟。8．重复步骤7—次。9．取下3S柱，弃去掉收集管中的废液，将3S柱放入同一支收集管中，高速离心2分钟。10．将3S柱放入干净的1.5ml的离心管中，在3S柱子膜中央加50μlTE或水，不要盖上离心管盖，室温下放置2分钟；盖上离心管盖，室温高速离心1分钟。注意：将TE或水预热到50℃可以提高洗脱效率。测序用质粒用30μl预热的水洗脱，浓度一般满足国内测序要求。11．洗脱的质粒可以立即用于各种分子生物学操作或-20℃保存备用。1ml过夜培养细胞，质粒如果用50μl水洗脱，通常情况下可取10μl洗脱液做琼脂糖(Agarose)电泳或酶切分析。（五）特殊要求的核酸分子分离纯化方法分离特定长度的DNA如获得目的基因、分离探针、PCR产物回收、酶切后的克隆载体特殊分离1、电泳洗脱法高分辨，普通琼脂糖有杂质，用高纯度或低熔点

电泳挖孔法琼脂糖，或胶回收试剂盒2、密度梯度离心法：常用介质有甘油、蔗糖、氯化铯（昂贵），密度梯度仪不同长度DNA停留在离心管不同高度经密度梯度离心，样品纯度极高3、旋转柱层析：Sephadex-G50：去除很短核酸片段和dNTP,纯化探针各种提取、浓缩、分子量截留试剂盒4、试剂盒二、生物大分子的鉴定和定量

（一）紫外分光法鉴定定量原理：在260nm下，核酸（DNA、RNA）有最大吸收，这是由它们含有的嘌呤环和嘧啶环的共扼双键系统的特性所决定的。通常每毫升1微克的DNA钠盐溶液的光密度为0.020，每毫升1微克的RNA钠盐溶液的光密度为0.025，所以核酸浓度与光密度值有以下关系：dsDNA（ug/ml）=OD260*50ssDNA（ug/ml）=OD260*37RNA（ug/ml）=OD260*40OD260、/OD280在1.8~2.2内核酸样品比较纯。总量的定量、鉴别方法

DNARNAPROTEIN化学法二苯胺法苔黑酚法双缩脲法、Folin酚、

染色、凯氏定氮（不需纯化）物理法UV260UV260UV280

电泳法电泳法电泳法分子生物学技术在分子病理、证的实质、分子药理研究中的应用

1、蛋白质是生命的主要物质基础，是生命运动的具体执行者。蛋白质（酶）合成的调节是生理调节中最基本的调节。蛋白质结构和功能的缺陷，与很多疾病密切相关核酸、蛋白质与生理功能的关系神经内分泌旁分泌免疫DNARNAPr（酶）细胞代谢（化学变化）

生理功能变化病、证异常（1）细胞水平调节——调节有重要功能的蛋白质RNA转录逆转录翻译蛋白质复制DNA复制别构调节结构调节（单个分子活性调节）——（分子对接）化学修饰数量调节合成——基因表达调控

转录是关键调控点，决定何时表达、表达多少

翻译是表达终结果降解——基因表达调控（降解酶）功能蛋白（2）激素水平——激素的合成、分泌、与激素受体结合、调节靶细胞内蛋白活性及基因表达调控内分泌细胞激素靶细胞激素受体（3）神经水平——递质的合成、分泌、与受体结合、调节内分泌或效应器细胞内活性及基因表达调控神经元神经递质内分泌细胞效应器细胞受体神经、内分泌、免疫网络信号传递蛋白质点：某相关蛋白纵向：信号传递到靶蛋白横向：基因群的表达调控、基因表达谱\蛋白质组代谢生理功能基因表达调控的调节物正常生理性代谢调节物——生化分子生物学致病因素——分子病理、证的实质药物因素：化学药、生物药、中药及复方——分子药理2、生物药物种鉴定、分类、育种DNA多态性分析，rRNA间隔区长度分析，DNA测序3、制备昂贵的中药成分或去除有害成分如马兜铃酸麝香多肽、秋水仙酰胺、青蒿酸达尔文终结者基因植入微生物的方式理论上可以生产任何种类的化合物。常用分子生物学技术一、PCR技术——DNA片段扩增技术

1.基因诊断、分子病理（医）临床用于检测传染病的病染体、遗传病的变异基因、肿瘤的癌基因与抗癌基因、测定某疾病相关基因表达水平等2.物种鉴定、分子药理（药）中药学上应用随机引物PCR（DNA指纹法、DNA多态性分析）rRNA间隔区长度法分析进行昂贵地道药材的鉴定研究药物对疾病相关基因表达的影响（RT-PCR)PCR扩增原理——试管中的半保留复制5’5’3’3’变性、退火、延伸变性、退火、延伸变性、退火、延伸RT-PCRmRNA逆转录为cDNA以cDNA为模板进行目标片段的扩增第一步，获得模板——待检测对象的细胞内核酸（DNA、RNA）二、基因克隆技术（重组DNA技术）

医药领域的应用：1、基因工程制药和疫苗（干扰素、胰岛素、免疫因子、生长因子抗菌肽、凝血因子、秋水仙酰胺、蛇毒、青蒿酸等，乙肝疫苗、甲流疫苗等）2、基因治疗肿瘤：抗癌基因、自杀基因、免疫因子、血管生长抑制因子等

逆转录酶切酶切加接头酶切酶切切连接接转化、转导或转染转筛选选（1）基因组DNA/RNA（2）载体DNA（3）合成或PCR扩增载体DNA提第一步，分离提纯带有目的基因的基因组DNA、RNA或重组载体，以及提纯表达目的基因所需要的载体克隆的载体一）质粒/粘粒（COS）质粒——染色体外共价闭环双链小分子DNA特点：1.自我复制能力

2.松弛型——高拷贝严谨型——低拷贝

3、抗性标记

4、插入失活二）噬菌体、三）病毒三、分子杂交与印迹技术

（一）分子杂交DNA或RNA的单链分子之间如果存在一定程度的碱基互补配对关系，一定条件下就可以在不同的分子间形成杂化双链变性退火杂化双链杂化双链变性退火（二）杂交印渍技术Dot/slotblottingSouthernblottingNorthernblottingWesternblotting电泳分离+特异分子显示（探针杂交、Ag-Ab反应）可用于特异DNA、RNA、蛋白质的定性定量检测凝胶电泳使核酸单链转移到硝酸纤维素膜（NC）毛细管作用电转移真空吸引与标记探针进行杂交或抗原抗体反应显色或暴光目标显出区带，定量提纯1.Dot/slotblot

特异DNA、RNA、Pr分子通过与标记探针杂交或标记抗体结合而显示出来，再定量省略了电泳、印迹转膜非特异的结合对结果影响大，定量不够精确2.Southernblot1.基因组DNA的结构分析;2.特异基因的突变分析应用：探针标记技术用同位素、生物素、地高辛或荧光染料标记末端或全链。3.RNA印渍技术

（Northernblot)

原理同Southernblot，但不需要酶切可直接进行变性电泳、印迹转移。

可用RT-Southernblot取代应用：检测特异基因表达水平。NorthernblotRNA变性凝胶电泳使RNA转移到硝酸纤维素膜（NC）毛细管作用电转移真空吸引与标记探针进行杂交放射自显影显出杂交区带RNA提纯RT-Southernblot

可取代Northernblot（4）蛋白质的印渍分析

蛋白质变性电泳转移到NC膜上加入抗体加入标记的二抗显示区带检测分析免疫印迹（Westernblot)提取总蛋白质DOT/SLOTBLOT直接点膜杂交与印迹结合SOUTHERNBLOTDNA电泳与印迹杂交结合

NORTHERNBLOT

RNA电泳与印迹杂交结合WESTERNBLOT蛋白质电泳与印迹免疫化学结合

特异大分子的定量、鉴别方法反向dotblotting——芯片技术全数或系列探针（基因芯片）/抗体（蛋白芯片）点阵同一标记样品与之杂交/抗原-抗体反应优点：1.可同时检测很多种大分子的变化2.检测基因表达的时空特异性3.目标分子不多、明确时用反向dotblotting比芯片便宜。特异mRNA、蛋白质定量方法的选择研究信号传递、基因表达调控、基因表达谱需要对重要的功能蛋白或受体及其mRNA进行分离、纯化、定量

对特异mRNA进行定量方法1mRNA原位杂交2RT-PCR3northernblot、dot/slotblot、RT-southernblot

对特异蛋白或受体进行定量方法：1)免疫组化2)生物活性检测3）westernblot

生物大分子分离纯化鉴定定量技术路线的选择高质量的原则经济的原则应用举例：1、PCR检测PCR定性：纯度要求低，允许部分降解

PCR指数放大极灵敏，要严防样品交叉污染，裂解、离心，简单的纯化（胍酚或酚氯仿一步法）PCR定量：灵敏度高严防污染、降解、严防试管效应模板要求较纯，较完整需提取纯化：

SOUTHERNBLOT

NORTHERNBLOT（DOTBLOT）

WESTERNBLOT要防降解，纯度、完整性要求低于RT-PCR，过程长、灵敏度低，可靠性高，结果较客观RT-PCR定量特定mRNA：灵敏度高，可靠性低严防污染、降解、试管效应

RNA要求较纯，较完整不需纯化：

DNA原位杂交

RNA原位杂交

免疫组化、

防降解易，不能定量（除活性测定）技术可靠性高结果主观性强可空间定位2、特定分子的定量四、基因表达的干预1.反义核酸技术用反义DNA、反义脱氧寡核苷酸、反