对羟基苯甲酸酯的HPLC分析

1、一、实验目的学习高效液相色谱仪器的基本使用方法。理解和掌握高效液相色谱分离分析基本原理。学会用外标法和校正归一化法进行色谱定量分析。1第一页，共三十五页。二、HPLC 简介1967年，高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography，HPLC)正式问世。 高压：流动相为液体，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压，300600105 Pa。高速：分析速度快、通常分析一个样品在1530分钟，有些样品甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时。高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。高灵敏度：紫外

2、检测器可达10-9gmL，荧光检测器可达10-11g mL 。第二页，共三十五页。HPLC应用广泛由于HPLC分离分析的高灵敏度、定量的准确性，特适于非挥发性和热不稳定组分的分析，因此，在医药、食品、农业、生命科学、化工、环保等领域都有着广泛的应用。如氨基酸、蛋白质、核酸、碳水化合物、药品、多糖、高聚物、农药、抗生素、胆固醇、金属有机物等分析，大多是通过HPLC来完成的。各种HPLC方法的应用范围及对象3第三页，共三十五页。液相色谱（HPLC）气相色谱（GC）相同点色谱柱可反复使用，分离效能高，高灵敏度，进样量小，分析速度快，使用范围广分析对象高沸点、不稳定的天然产物、生物大分子、高分子化合物

3、、离子型样品气体、沸点较低、热稳定性好的化合物流动相不同极性的液体（有一定亲和作用）惰性气体（无亲和性，只起运载作用）温度一般室温较高检测器紫外吸收检测器（光电二极管阵列检测器），荧光检测器，电化学检测器，蒸发光散射检测器，质谱检测器，示差折光检测器氢火焰离子化检测器（FID），热导检测器（TCD)，氮磷检测器（NPD），火焰光度检测器（FPD），电子捕获检测器（ECD)等类HPLC与GC的比较4第四页，共三十五页。Agilent 1100仪器结构图手执控制器检测器柱温箱自动进样器泵脱气机溶剂柜三、Agilent-1100 液相色谱仪高压输液系统：单元、双元、 四元泵 进样系统：手动、自动 分

4、离系统：C18、C8色谱柱检测系统：检测器第五页，共三十五页。1、高压输液系统储液器： 0.5L2L的玻璃瓶（白色、棕色）。脱气装置： 将气体从溶剂中除去，离线脱气和在线真空脱气。高压输液泵：恒压泵、恒流泵恒流泵使用最广泛，有单活塞和双活塞往复泵。流量准确、可调，流速为0.52 mL/min，泵最大流量范围为510mL/min（排气泡）。6第六页，共三十五页。流动相HPLC 级溶剂水为超纯水过滤 (最大0.45 m, 0.2 m最好)脱气，尤其在低流速时相溶第七页，共三十五页。液相色谱手动进样器2、进样系统8第八页，共三十五页。准备时，流动相直接进柱，进样口1与定量管连接，样品充满定量管后，多

5、余样品从2流出。进样时，泵将流动相压入定量管，将样品全部携带进入色谱柱分析。9第九页，共三十五页。注射器气相色谱注射器的针头为尖，液相色谱的注射器针头为平，两者不能混用。10第十页，共三十五页。色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长0 30 cm，固定相粒径 5 10m 。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。色谱柱3、色谱柱第十一页，共三十五页。反相柱-固定相通常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱官能团的键合相。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组分最先被冲洗出，而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。常用的反向填料有：C18（OD

6、S）、C8（MOS）、C4（Butyl）、C6H5（Phenyl）等。 第十二页，共三十五页。正相柱-固定相通常为硅胶以及其他具有极性官能团胺基团，如（NH2）和氰基团（CN）的键合相填料。 由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他极性基团极性较强，因此，分离的次序是依据样品中各组分的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱。13第十三页，共三十五页。手性色谱柱-是由具有光学活性的单体，固定在硅胶或其它聚合物上制成手性固定相，来实现外消旋物的广泛分离。特点：具有专一性、通用性不广。价格较贵。第十四页，共三十五页。 紫外吸收检测器（Ultraviolet Visible Detector，UV

7、D） 目前在HPLC中应用最广泛的检测器。包括： 可变波长紫外检测器（VWD） 二极管阵列检测器（DAD）荧光检测器（Fluorescence Detector，FD）示差折光检测器（Refractive Index Detector，RID）4、液相色谱检测器第十五页，共三十五页。The Good User下列优良/常规实验操作能够延长仪器寿命：流动相和样品进行过滤。保证溶剂的相溶性。仪器使用完毕，冲洗整个系统，去掉盐份，防止污染。对仪器进行定期维护和保养。定期使用甲醇或异丙醇冲洗系统。第十六页，共三十五页。色谱过程：在有互不相溶的两相流动相和固定相的体系中，当两相作相对运动时，第三组分（即

8、溶质或吸附质）连续不断地在两相之间进行分配的过程。 由于流动相、固定相以及溶质混合物性质的不同，在色谱过程中溶质混合物中的各组分表现出不同的色谱行为，从而使各组分彼此相互分离。 四、基本分离原理17第十七页，共三十五页。色谱分析法的实质：不同溶质分子因结构不同而与流动相及固定相的相互作用力不同，从而引起在色谱柱内运行过程中作用机理的差异。经过柱内多次作用的叠加后在宏观上引起其在柱内停留时间（保留时间）的差异，形成事实上的分离。基本分离原理18第十八页，共三十五页。主要色谱类型分配色谱： 液液分配色谱（Liquid-liquid partition chromatography） 化学键合相色谱

9、（Chemically bounded phase chromatography, CBPC） 反相离子对色谱液-固吸附色谱 （Liquid-solid adsorption chromatography, LSAC）离子交换色谱（Ion-exchange chromatography）空间排阻色谱（Size-exclusion chromatography）亲和色谱法（Affinity chromatography）第十九页，共三十五页。分配色谱 反相分配色谱：流动相极性固定相极性 正相分配色谱：流动相极性固定相极性反相：固定相：C18, C8 流动相：水，甲醇，乙腈等极性溶剂的混合溶剂 适

10、合极性小的芳香族化合物正相：固定相：-CN, -NH2 流动相：烷烃，异丙醇，四氢呋喃等的混合溶剂 适合于极性差异大的化合物第二十页，共三十五页。21第二十一页，共三十五页。液相色谱流动相22第二十二页，共三十五页。液相色谱分析中，在紫外区有明显吸收，可以利用紫外检测器进行检测，其工作原理是Lambert-Beer定律。五、基本检测原理23第二十三页，共三十五页。定性定量分析的原理用标准物比对法定性：特定组分在同色谱条件下有不变的保留值(时间、体积等)，可将之与已知纯物质的相应保留值作比对的方法进行定性分析。三聚氰胺三聚氰酸猪肉中三聚氰胺和三聚氰酸的分析24第二十四页，共三十五页。用外标法定量

11、：以不同量标准样品进样得到峰面积，然后作图得标准曲线，求出回归方程，得到相关系数。然后进样得到被测试样的峰面积从曲线中查到含量。方法适用于样品复杂，但只对部分组分感兴趣时。 定性定量分析的原理25第二十五页，共三十五页。校正归一化法定量：因不同组分的紫外吸收情况不同，等量样品的吸光度值不相等。因而需要采用校正归一化法定量:方法适用于样品不很复杂，且部分组分都能流出色谱柱并在检测器上有响应时。 定性定量分析的原理26第二十六页，共三十五页。Agilent-1100液相色谱仪：四元高压泵 C18色谱柱手动进样器可变波长紫外检测器色谱工作站六、实验内容27第二十七页，共三十五页。实验步骤I打开计算机

12、启动“bootp”文件，然后打开仪器电源建立计算机和仪器的连接。启动工作站（online），调整好流动相流量和检测波长，等待基线平直。前期准备28第二十八页，共三十五页。实验步骤II在甲醇:水=80:20、70:30、65:35的不同配比流动相中分别取未知试样25L进样分析，记录保留时间和各组分间的分离度，以分离度大于1.5且保留时间最短为原则选定最佳流动相配比。注意：每次更换流动相都需等待5min左右以平衡色谱系统。条件试验 I流动相配比29第二十九页，共三十五页。实验步骤III 在最佳流动相配比条件下，以0.8、1.0、1.2 mL/min不同的流动相流速下取混合标准溶液25L进样分析，以

13、同样原则选定最佳流动相流速。问题I：每次更换流动相还需等待5min吗？问题II：可以利用本步骤实验数据进行定量校正因子的确认吗？条件试验 II流动相流速30第三十页，共三十五页。实验步骤IV在最佳实验条件下，分别取纯甲酯、丙酯、丁酯各10L进样，记录各色谱峰保留时间，与步骤III所得结果相比较，进行定性分析。 定性分析31第三十一页，共三十五页。实验步骤V在最佳实验条件下，分别取25 L混合标样进样，以峰面积对浓度作标准曲线。要求该曲线的相关系数大于0.99，如果不满足则可对明显偏离的实验进行重测。标准曲线制作32第三十二页，共三十五页。实验步骤VI取25L 未知试样进样分析（重复3次），外标法定量。结束：用100%甲醇冲洗仪器10分钟，依次关闭工作站和仪器。未知试样测定33第三十三页，共三十五页。