细胞治疗实验室工艺流程纲要2

1、文档本源为:从网络收集整理.word版本可编写.支持.细胞治疗实验室工艺流程细胞治疗实验室工艺流程按种类分为：一、试剂耗材入库记录，试剂耗材使用记录，试剂配制记录，配制的试剂使用记录。入库需要记录产品的名称、批号、有效期、数量、存放地址、入库时间。试剂耗材使用记录包括名称、批号、用途，时间。试剂配制记录包括原料的名称、批号，配制试剂的时间、有效期、批号。配制的试剂使用记录包括使用的时间、批号、用途。二、实验记录，包括采血、分血、细胞接种、补液、质检、回输。采血有2个信息实验室需要记录，包括浓缩白细胞体积和血浆体积。分血有需要记录使用的分别液的量和单个核细胞数量。细胞接种需要记录DC、CIK、C

2、D3AK、T、NK等细胞接种数量、培养基体积、细胞因子增加的量。补液需要记录补液的时间和体积。质检需要做细菌真菌培养、内毒素检测、革兰氏检测，记录做这些质检的时间。回输需要记录回输的细胞种类、时间、细胞体积、细胞数量。三、细胞检测记录，包括细菌真菌培养，内毒素检测，革兰氏检测，流式检测。记录内容包括样品的本源、检测时间、结果、检测人。四、冲刷消毒记录。包括冲刷消毒的时间、方式、消毒有效期。采血日期：姓名科室DC细胞床号2临小床时诊后断洗版病理切片第5天加成熟剂1第6天加成熟剂2第7天收细胞，计算细胞存活率、细胞数后冻存或回输CIK细胞第2天加CIK混杂因子依照细胞生长情况补液回输前3天细菌真菌

3、培养回输前12小时革兰氏染色细胞培养流程图采血NO：_自体细胞分制血剂制备记录患者基本情况细胞计数年龄细胞接种性别病案号主管医生CD3AK细胞T细胞NK细胞其余细胞传生病依照细胞依照细胞依照细胞生长情况生长情况生长情况补液补液补液回输前3回输前3回输前3天细菌真天细菌真天细菌真菌培养菌培养菌培养回输前12回输前12回输前12小时革兰小时革兰小时革兰氏染色氏染色氏染色计算细胞计算细胞计算细胞存活率、细存活率、细存活率、细胞数后给胞数后给胞数后给病人回输病人回输病人回输文档本源为:从网络收集整理.word版本可编写.支持.细胞制备标准操作记录分血数量单位日期操作人复核人备注自体血浆体积ml白细胞体

4、积mlFicol体积ml批号：PBMC总量910DC细胞制备数量单位日期操作人复核人备注1、PBMC用量8102、铺瓶（板）瓶（板）3、加DC培养液体积ml4、DC引诱因子（100X）ml批号：5、第五天加DC成熟剂1（100X）ml批号：6、第六天补加DC成熟剂2（100X）ml批号：7、第七（八）天收集DC710CIK细胞制备数量单位日期操作人复核人备注1、增加IFN-rIU2、PBMC用量8103、接种体积ml4、增加CIK混杂因子（100X）ml批号：第1次第2次第3次5、补液ml第4次第5次第6次CD3AK细胞制备数量单位日期操作人复核人备注文档本源为:从网络收集整理.word版本可

5、编写.支持.1、增加CD3AK混杂因子批号：（100X）ml2、PBMC用量8103、接种体积ml第1次第2次4、补液第3次ml第4次第5次T细胞制备数量单位日期操作人复核人备注1、PBMC用量9102、接种体积ml3、增加T混杂因子批号：（100X）ml第1次第2次4、补液第3次ml第4次第5次NK细胞制备数量单位日期操作人复核人备注1、PBMC用量8102、接种体积ml3、增加NK细胞混杂因子批号：（100X）ml第1次第2次4、补液第3次ml第4次第5次细胞冻存及复苏标准操作记录细胞冻存标准操作记录日期细胞细胞冻存数量冻存液存放复核人备注编号数量（支）编号操作人种类地址文档本源为:从网络

6、收集整理.word版本可编写.支持.细胞复苏标准操作记录日期细胞细胞复苏数量复苏存放复核人备注编号数量（支）用途操作人种类地址自体细胞制剂回输记录姓名年龄性别科室病案号床号次数日期细胞种类批号体积（ml）回输方式运送人接收人复核人1234567文档本源为:从网络收集整理.word版本可编写.支持.89101112131415161718文档本源为:从网络收集整理.word版本可编写.支持.自体细胞制剂检控记录次数细胞外观细菌真菌革兰氏染色细菌内毒素最后检定结果存活率数量操作人复核人培养回输细胞批均匀悬浊液，无第一次回输前3每次回输当天每次回输当天需经检定合格后存活率号异物天方可回输85%1是否

7、阳性阴性阳性阴性阳性阴性合格不合格2是否阳性阴性阳性阴性阳性阴性合格不合格3是否阳性阴性阳性阴性阳性阴性合格不合格4是否阳性阴性阳性阴性阳性阴性合格不合格5是否阳性阴性阳性阴性阳性阴性合格不合格6是否阳性阴性阳性阴性阳性阴性合格不合格7是否阳性阴性阳性阴性阳性阴性合格不合格8是否阳性阴性阳性阴性阳性阴性合格不合格9是否阳性阴性阳性阴性阳性阴性合格不合格10是否阳性阴性阳性阴性阳性阴性合格不合格11是否阳性阴性阳性阴性阳性阴性合格不合格12是否阳性阴性阳性阴性阳性阴性合格不合格13是否阳性阴性阳性阴性阳性阴性合格不合格文档本源为:从网络收集整理.word版本可编写.支持.CIK细胞培养标准操作流

8、程一、溶液的配置1、热灭活自体血浆的制备：将自体血浆装在无菌的离心管内，放入40分钟，取出用2500转离心10分钟，取出上清备用。2、IFN-r母液（1000X）：用无血清培养基配成100万IU/ml。3、CIK混杂因子(100X)：冰箱4度保存。56摄氏度水浴锅内热灭活4、CIK完好培养基：无血清培养基加1%-2%热灭活自体血浆。二、CIK细胞制备：1、血细胞单采机收集病人浓缩白细胞和血浆（80-100ml）。2、准备2支50ml离心管，每管加入淋巴细胞分别液20ml。3、将浓缩白细胞从血袋中取出，直接等量加到上述2支50ml离心管淋巴细胞分别液上面，2000转离心25分钟，起落速调到最低值

9、。4、取出上层的血浆收集到一支50ml离心管中，余下的部分除红细胞外全部收集到2支50ml离心管中，加生理盐水到50ml，1500转离心10分钟，去除上清，合并2支管内的细胞到一支50ml离心管中，加50ml生理盐水，取20ul样品用于计数，1200转离心7分钟，去除上清。5、全部的血浆留出12支5ml用于回输，其余全部56摄氏度灭活40分钟，灭活达成后2500转离心10分钟，收集上清备用。6、将细胞用CIK完好培养基配成1X106/ml，加入IFN-r母液至1000IU/ml，接种1个细胞培养袋，袋内加200mlCIK完好培养基。7、24小时后，按1:100加入CIK混杂因子。8、第5天，按

10、4倍稀释增加含300IU/mlIL-2的CIK完好培养基。9、第8天到第9天，按2倍稀释增加含300IU/mlIL-2的CIK完好培养基。同时取样做细菌真菌培养。10、今后每隔一天按2倍稀释补一次液，第一次回输前1天取样送检做革兰氏染色检查。11、等拿到细菌真菌培养结果后，检查全部结果可否为阴性。CIK培养到第10天-15天内回输。12、回输时收集细胞于离心管内，1200转离心7分钟，去除上清，收集细胞后加生理盐水再离心2次，1200转离心7分钟。13、将收集到的细胞加入到150ml注射用生理盐水中，加入5ml自体血浆，2万IUIL-2，留1ml细胞悬液到1.5ml离心管中，4摄氏度存放3月备

11、查。14、将达成的细胞悬液封好瓶口，核对病人姓名、性别、年龄、住院号、细胞数、无菌结果、病区及治疗项目，确认无误后，贴上标签，送病区进行回输。DC细胞培养标准操作流程一、溶液的配置1、热灭活自体血浆的制备：将自体血浆装在无菌的离心管内，放入56摄氏度水浴锅内热灭活40分钟，取出用2500转离心10分钟，取出上清备用。2、DC基础培养基：用无血清培养基+2%热灭活自体血浆。3、DC引诱剂(100X）：冰箱4度保存。4、DC培养基：DC基础培养基加入DC引诱剂4、DC成熟剂1(100X）：冰箱4度保存。5、DC成熟剂2（100X）：冰箱4度保存。二、DC细胞制备：1、取PBMC，加入IMDM培养基

12、配成5X106/ml细胞悬液，按每孔3ml接种到6孔板内，放入培养箱。2、2小时后，取出，晃动去除上层杂细胞，留下贴壁的单核细胞（体积比其余细胞稍大），每孔加入3mlDC培养基。3、第5天，按每孔30ul加入DC成熟剂1，取样做细菌、真菌培养。文档本源为:从网络收集整理.word版本可编写.支持.4、收集细胞前12小时每孔加入30ulDC成熟剂2，同时取样送检做革兰氏染色检查。5、DC培养到第7-8天，收集细胞，用生理盐水洗3次，分成4份，其中一份用于当天回输，其余冻存在-80度冰箱中。6、将生理盐水冲刷过的DC细胞加入到150ml注射用生理盐水中，加入5ml自体血浆，留1ml细胞悬液到1.5

13、ml离心管中，4摄氏度存放3月备查。7、将达成的细胞悬液封好瓶口，核对病人姓名、性别、年龄、住院号、细胞数、无菌结果、病区及治疗项目，确认无误后，贴上标签，送病区进行回输。CD3AK细胞培养标准操作流程一、溶液的配置1、热灭活自体血浆的制备：将自体血浆装在无菌的离心管内，放入56摄氏度水浴锅内热灭活40分钟，取出用2500转离心10分钟，取出上清备用。2、CD3AK混杂因子(100X）：冰箱4度保存。3、CD3AK完好培养基：无血清培养基+1%-2%热灭活自体血浆+CD3AK混杂因子。二、CD3AK细胞制备：1X106/ml，接种培养瓶或培养袋培养。1、PBMC用CD3AK完好培养基配成2、第

14、5天，按4倍稀释增加CD3AK完好培养基。3、第8天到第9天，按2倍稀释增加CD3AK完好培养基。同时取样做细菌真菌培养。4、今后每隔一天按2倍稀释补一次液，第一次回输前1天取样送检做革兰氏染色检查。5、等拿到细菌真菌培养结果后，检查全部结果可否为阴性。CD3AK培养到第10天-15天内回输。6、回输时收集细胞于离心管内，1200转离心7分钟，去除上清，收集细胞后加生理盐水再离心2次，1200转离心7分钟。7、将收集到的细胞加入到150ml注射用生理盐水中，加入5ml自体血浆，2万IUIL-2，留1ml细胞悬液到1.5ml离心管中，4摄氏度存放3月备查。8、将达成的细胞悬液封好瓶口，核对病人姓

15、名、性别、年龄、住院号、细胞数、无菌结果、病区及治疗项目，确认无误后，贴上标签，送病区进行回输。T细胞培养标准操作流程一、溶液的配置1、热灭活自体血浆的制备：将自体血浆装在无菌的离心管内，放入56摄氏度水浴锅内热灭活40分钟，取出用2500转离心10分钟，取出上清备用。2、T混杂因子(100X）：冰箱4度保存。3、完好培养基：无血清培养基1%-2%热灭活自体血浆。二、T细胞制备：1、将PBMC用完好培养基配成2X106/ml，加入混杂因子，接种培养瓶或培养袋培养。2、第5天，按2倍稀释增加含400IU/mlIL-2的完好培养基。3、第8天到第9天，按2倍稀释增加含400IU/mlIL-2的完好

16、培养基。同时取样做细菌真菌培养。4、今后每隔一天按2倍稀释补一次液，第一次回输前1天取样送检做革兰氏染色检查。5、等拿到细菌真菌培养结果后，检查全部结果可否为阴性。T培养到第10天-15天内回输。6、回输时收集细胞于离心管内，1200转离心7分钟，去除上清，收集细胞后加生理盐水再离心2次，1200转离心7分钟。7、将收集到的细胞加入到150ml注射用生理盐水中，加入5ml自体血浆，留1ml细胞悬液到1.5ml离心管中，4摄氏度存放3月备查。8、将达成的细胞悬液封好瓶口，核对病人姓名、性别、年龄、住院号、细胞数、无菌结果、病区及治疗项目，确认无误后，贴上标签，送病区进行回输。NK细胞培养标准操作

17、流程文档本源为:从网络收集整理.word版本可编写.支持.一、溶液的配置1、热灭活自体血浆的制备：将自体血浆装在无菌的离心管内，放入56摄氏度水浴锅内热灭活40分钟，取出用2500转离心10分钟，取出上清备用。2、NK细胞混杂因子(100X）：冰箱4度保存。3、完好培养基：SCGM无血清培养基+1%-2%热灭活自体血浆。二、NK细胞制备：1、将PBMC用完好培养基配成1X106/ml，加入NK细胞混杂因子，接种培养瓶或培养袋培养。2、第5天，增加2倍量完好培养基，加入500IU/mlIL-2。3、第8天到第9天，按2倍稀释增加含500IU/mlIL-2的完好培养基。同时取样做细菌真菌培养。4、

18、今后每隔一天按2倍稀释补一次液，第一次回输前1天取样送检做革兰氏染色检查。5、等拿到细菌真菌培养结果后，检查全部结果可否为阴性。NK培养到第10天-15天内回输。6、回输时收集细胞于离心管内，1200转离心7分钟，去除上清，收集细胞后加生理盐水再离心2次，1200转离心7分钟。7、将收集到的细胞加入到150ml注射用生理盐水中，加入5ml自体血浆，留1ml细胞悬液到1.5ml离心管中，4摄氏度存放3月备查。8、将达成的细胞悬液封好瓶口，核对病人姓名、性别、年龄、住院号、细胞数、无菌结果、病区及治疗项目，确认无误后，贴上标签，送病区进行回输。细胞冻存和复苏标准操作流程一、溶液的配置1、程序降温盒的准备：按程序降温盒上的标示量加入250ml异丙醇作为冷冻液，室温放置。2、冻存液的配置：热灭活自体血浆加入10%DMSO。9、细胞冻存1、将要冻存的细胞离心1200rpm，7min，去除旧的培养液。62、轻轻混匀细胞积淀，加入适合配制好的冻存培养液，DC细胞调整细胞密度为510/ml778210/ml