蛋白质的分离纯化概要

1、 第一节 引言(ynyn)蛋白质存在于一切生物体中，是非常重要的生物大分子。蛋白质是生物功能的执行者，担负着生物催化、物质运输、运动、防御、调控(dio kn)及记忆、识别等多种生理功能。 第二章 蛋白质别离纯化原理(yunl)与技术第一页，共六十一页。一、别离纯化(chn hu)的意义从生物材料中别离制备蛋白质，研究其结构与功能，对于了解(lioji)生命活动的规律，说明生命现象的本质有重大意义。工业生产的需要：食品、发酵、纺织、制革等工业，需要大量的高活性的酶制剂。如用淀粉酶制造葡萄糖、麦芽糖、糊精以及糖浆等。医疗的需要：如用猪胰岛素治疗糖尿病。基因工程的需要第二页，共六十一页。二、别离纯

2、化(chn hu)的要求1、纯度：主要取决于研究的目的和应用上的要求。如作为研究蛋白和一级结构、空间结构，一级结构与功能的关系的蛋白质制剂、工具酶和标准蛋白、酶法分析的酶制剂，都要求均一；工业、医药方面应用的酶和蛋白质制剂，到达一定纯度即可，不要求均一。2、活性：要求大分子保持天然构象状态，有高度(god)的生物活性。3、收率：希望收率越高越好，但在别离纯化过程中总有不少损失。而且提纯步骤越多，损失越大。第三页，共六十一页。三、别离纯化的一般(ybn)程序蛋白质分子的别离纯化一般可分为以下几个阶段： 材料的选择和预处理 破碎(p su)细胞及提取有时还需要进行细胞器的别离 别离纯化：包括粗分级

3、别离和细分级别离其中前两个阶段为别离纯化的前处理。第四页，共六十一页。第二节 蛋白质别离(fnl)纯化的前处理一、材料的选择与预处理选择材料主要根据实验目的而定。工业生产上注意选择含量高、来源丰富(fngf)、易获得、制备工艺简单、本钱低的动植物组织或微生物做原料。科研选材那么无需考虑上述问题，只要能到达实验目的即可。实验材料选定后，常常需要进行预处理，如动物材料需要除去一些与实验无关的结缔组织、脂肪组织；植物种子需要除壳；微生物需要将菌体与发酵液分开。另外，必须尽可能保持材料的新鲜，尽快加工处理。假设不立即进行实验或加工，应冷冻保存。第五页，共六十一页。二、细胞(xbo)的破碎别离提取某一生

4、物大分子，首先要求生物大分子从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不丢生物活性。因此应选择适当的方法将组织和细胞破碎(p su)。但假设材料是体液如血或生物体分泌到体外的分泌物，那么不必进行组织细胞的破碎(p su)。第六页，共六十一页。组织细胞的破碎方法很多，不同的实验规模，不同的实验材料和实验要求，使用的破碎方法和条件也不同。一般动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆器破碎或用超声波处理破碎。植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般常用与石英砂和适当的提取液一起研磨的方法破碎或用纤维素酶处理也能到达目的。细菌细胞的破碎比较困难，因为整个细菌

5、细胞壁的骨架实际上是一借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子，非常坚韧。破碎的方法常有超声波震荡(zhndng)、与石英砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理以分解肽聚糖。第七页，共六十一页。三、细胞器的别离(fnl)细胞器包括细胞核、线粒体、核糖体、内质网，植物细胞还有叶绿体。如果要别离制备分布在这些细胞器中的生物大分子，为了防止其他细胞组分中的物质对制备物的干扰或污染，还需先将细胞器别离出来，然后在某一细胞器中别离某一物质。细胞器的别离一般采用差速离心法，即将破碎后的细胞在适当的介质中进行离心，常用的介质有蔗糖、甘露醇、柠檬酸、聚乙二醇等。各种细胞组分按质量大小(dxio)的不同，经过不同速度的离心后，

6、沉降于离心管的不同部位，经屡次分步离心后，即可获得所需组分。第八页，共六十一页。四、提取(tq)组织细胞破碎过程中，大量(dling)的胞内酶及细胞内含物被释放出来，必须立即将其置于一定条件下和溶剂中，让制备物充分溶解，并尽可能保持原来的天然状态，防止因长久放置造成制备物的分解破坏，这就是提取。第九页，共六十一页。1、蛋白质的提取(tq)大多数蛋白质均能溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中，故蛋白质的提取一般以水溶液提取为主。通常采用类似生理条件下的缓冲液，如20-50m mol/L的磷酸盐缓冲液pH7.0-7.5或0.1mol/L Tris-HClpH7.5-8.0缓冲液作提取液。对于一些(yxi

7、)和脂质结合比较牢固或分子中非极性较多的蛋白质，不溶于水、稀盐、稀碱、稀酸，常在提取液中参加适量的有机溶剂，如乙醇、丙酮、异丙醇、正丁醇等。第十页，共六十一页。第三节 蛋白质别离(fnl)纯化从细胞中提取得到的蛋白质往往是不纯(b chn)的，含有大量杂质，必须进一步别离纯化，这一阶段可分为粗分级别离和细分级别离两步进行。第十一页，共六十一页。一、蛋白质的别离(fnl)纯化蛋白质别离纯化的方法很多，主要是根据蛋白分子之间特异性的差异，如分子大小，溶解度，电荷等建立起来的。 性质 方法分子大小 透析、超滤、密度梯度离心(lxn)、凝胶过滤 溶解度 等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀电荷 电泳、离子交

8、换层析吸附性质 吸附层析羟基磷灰石层析、疏水作用层析对配体分子 亲和层析 的生物亲和力第十二页，共六十一页。主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机溶剂沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白分开(fn ki)，这些方法的特点是简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质，但分辨率低。1、粗分级别离第十三页，共六十一页。1盐析(yn x)向蛋白质溶液(rngy)中参加大量的中性盐NH4)2SO4，Na2SO4，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀，这种现象称为盐析。盐析作用是由于当盐浓度较高时，盐离子与水分子作用，使水的活度降低，原来溶液中大局部的自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水

9、分子之间的作用，破坏蛋白质分子外表的水化层，使蛋白聚集沉淀。同时盐离子可以中和蛋白质的外表电荷，也促进蛋白的沉淀。第十四页，共六十一页。 不同的蛋白质分子，由于其分子外表(biomin)的极性基团的种类、数目以及排布的不同，其水化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不一样，因此调节蛋白质的中盐浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀。如：血清(xuqng)球蛋白清蛋白(dnbi)(NH4)2SO450%饱和度100%饱和析出析出分段盐析第十五页，共六十一页。2等电点沉淀(chndin)蛋白质是两性电解质，其溶解度与其净电荷数量有关，随溶液pH变化而变化。在溶液pH值等于蛋白质等电点时，蛋白质的溶解度最小

10、。不同的蛋白质有不同的等电点，因此通过调节溶液pH到目的蛋白的等电点，可使之沉淀而与其它蛋白质分开(fn ki)，从而除去大量杂蛋白。第十六页，共六十一页。3有机溶剂法与水互溶的极性有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮等能使蛋白质在水中的溶解度显著降低(jingd)。有机溶剂引起蛋白质变性的原因有两个：降低水的介电常数，使蛋白质分子外表可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，促进了蛋白质分子的聚集沉淀。是极性有机溶剂与蛋白质争夺水化水，而使蛋白质分子沉淀。第十七页，共六十一页。室温下，这些有机溶剂不仅能使蛋白质沉淀，而且伴随着变性。假设预先将有机溶剂冷却，然后在不断搅拌下将其逐渐参加蛋白质溶液中，防止

11、有机溶剂局部浓度过高，那么在很大程度上解决变性问题。不同的蛋白质由于水化层厚度不同，发生沉淀需要(xyo)的有机溶剂浓度不同，因此可利用不同浓度的有机溶剂别离不同的蛋白质。第十八页，共六十一页。2、细分级别离一般蛋白质样品(yngpn)经粗制分级后，体积较小，杂质大局部被除去。进一步提纯，通常使用高分辨率的柱层析及电泳方法。常用的柱层析方法有分子筛层析、离子交换层析、疏水吸附层析、亲和层析。常用的电泳方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳。另外，结晶也是蛋白质别离纯化的方法之一，制备的结晶物常常作为蛋白质结构分析之用。第十九页，共六十一页。 酶的活力(hul)测定在酶的制备过程中，每一步骤(b

12、zhu)都应测定留用以及准备弃去局部中所含酶的总活力和比活力，以了解经过某一步骤(bzhu)后酶的回收率、纯化倍数，从而决定这一步的取舍。总活力=活力单位/ml酶液总体积ml比活力=总活力单位数/总蛋白氮mg纯化倍数=每次比活力/第一次比活力回收率产率=每次总活力/第一次总活力100%第二十页，共六十一页。第四节 蛋白质纯度(chnd)鉴定生物大分子经过别离提纯，最后还要鉴定制品的纯度。蛋白质和酶制品纯度鉴定通常采用的方法有：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法、超速离心沉降(chnjing)分析法、免疫化学法、N-末端氨基酸分析法等。纯的蛋白质在一定条件下进行电泳，将以单一的速度移动

13、，它的电泳图谱只出现一条带。同样纯的蛋白质在离心场中，应以单一的沉降速度移动。选用任何单独一种鉴定方法都不能最后确定蛋白质的纯度，必须同时采用2-3种不同的方法才能确定。第二十一页，共六十一页。第五节 蛋白质的层析别离应用广泛。特征：有一个(y )固定相和一个(y )流动相。由于待别离的各种物质在这两个相分配系数不同，当两个相作相对运动时，这些物质在两相间反复屡次分配，结果使其相互分开。根据两相的状态，层析法可分为：气相层析和液相层析；按层析原理可分为：吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析等。按操作形式分为：柱层析、薄层层析、纸层析等。第二十二页，共六十一页。第二十三页，共

14、六十一页。 分配系数: k=Cs/Cm ,物质在固定相与(xingy)流动相浓度之比。质量分配系数：D=kVs / Vm , Vs , Vm 为固定相和流动相的体积。一、层析的一般(ybn)原理 3216168816812412412228 如果柱顶参加32mg样品，样品的质量分配系数D为1，即样品在两相中是等量分配。经过5层的平衡(pnghng)分配后，样品在柱的分配情况见图。样品集中在中间。如果D1，样品集中在中间偏下。第二十四页，共六十一页。 离子交换(l z jio hun)层析(IEX)是根据电荷来别离分子的。 离子交换剂是通过化学反响将解离基团引入到惰性支持物上形成的。分为： 阳离

15、子交换剂: 解离基团带负电, 结合阳离子; 阴离子交换剂: 解离基团带正电, 结合阴离。 蛋白质分子是两性物质。当pHpI，分子带负电，可结合阴离子交换剂；当pHpI，分子带正电，可结合阳离子交换剂。如阳离子交换剂与带正电蛋白质分子之间有如下平衡： 二、离子交换(l z jio hun)层析一根本原理第二十五页，共六十一页。 带电蛋白质分子(fnz)与交换剂的结合是可逆的。 由于pH可改变蛋白质的带电性质和带电量，盐离子会影响蛋白质在交换剂上吸附。所以用一定浓度的盐溶液或一定pH 的缓冲液就可把蛋白质从离子交换剂上洗脱下来。对多组分混合物，每种分子所带的电荷不同，因此，可用不同的离子强度 或不

16、同的pH溶液将蛋白质从交换剂上一一洗脱下来。 第二十六页，共六十一页。二离子交换剂的根本(jbn)类型 根据可供交换的离子的性质，离子交换剂可被分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。假设按酸碱性的强弱，又可分为强酸、强碱、弱酸(ru sun)、弱碱几种类型的离子交换剂。 强酸和强碱型交换剂能在较广泛的pH范围内pH212完全解离。弱酸型交换剂在低于pH4、弱碱型交换剂在高于pH9就难于解离，因而失去交换能力。因为一般蛋白质在pH68之间稳定，所以常用弱酸或弱碱型交换剂。第二十七页，共六十一页。离子交换基团(j tun)的结构和性质类型名称结构式性质DEAE二乙基氨基乙基(diethylaminoet

17、hyl)-O-CH2-CH2-N+-(C2H5)2弱碱性QAE季胺乙基(quaternary aminoethyl)-O-CH2-CH2-N+-(C2H5)3强碱性Q季胺(quaternary amine)-CH2-N+-(CH3)3 强碱性CM羧甲基(carboxymehyl)-O-CH2-COO -弱酸性SE磺乙基(sulfoethyl)-O-CH2CH2-SO3-强酸性SP磺丙基(sulfopropyl)-O-CH2-CH2-CH2-SO3-强酸性P磷酸基(phosphate)-O-PO3-中酸性S磺酸基(sulfonate)-CH2-SO3-强酸性第二十八页，共六十一页。 可用来作为交

18、换剂支持物的物质种类(zhngli)较多。早期用于别离氨基酸、小肽和其它小分子物质的离子交换树脂的支持物是聚苯乙烯类。 别离蛋白质的常用的亲水性支持物。有三大类：纤维素、葡聚糖凝胶(sephadex)、琼脂糖凝胶(sepharose)和合成凝胶(Trisacryl和Fractogel)。1、离子交换纤维素 离子交换纤维素是以纤维素做支持介质的。具有松散的亲水性网络，较大的外表积，吸附容量大，通透性好。根据离子交换纤维素所含离子交换基团的性质可分为强酸、强碱型和弱酸(ru sun)、弱碱型。现将常用的离子交换纤维素列于下表中。第二十九页，共六十一页。常用(chn yn)的离子交换纤维素离子(lz

19、)类型 解 离 基 团特 点DEAE-OCH2CH2N+(C2H5) 在 pH8.6 应用(yngyng) 第三十页，共六十一页。阴离子解离基团交换摩尔(m mol/g) 特点DEAEOCH2CH2N(C2H5)0.11.1 在pH4应用POPO3H20.77.4酸性较强SEOCH2CH2SO3H0.20.3强酸性第三十二页，共六十一页。 在Sephadex上接上某种离子交换基团。这种凝胶既有离子交换剂的性质，又有分子筛效应。因此，其别离能力比单纯(dnchn)的层析凝胶或离子交换剂好。葡聚糖凝胶离子交换剂的交换量比相应的纤维素离子交换剂大，如DEAESephadex的交换量大约是DEAE纤维

20、素的3.55.0倍。2、离子交换(l z jio hun)葡聚糖凝胶Sephadex第三十三页，共六十一页。葡聚糖凝胶离子交换(l z jio hun)剂的性质 类别离子交换基团床体积ml/g分离范围(Mr)交换量总交换容量(m mol/g) 强阳离子交换剂SESephadex C25 C50-CH2CH2SO3H5932383104- 21053104-21052.02-52.02-5 SPSephadex C25 C50-CH2CH2CH2SO3H 2.30.3 弱阳离子交换剂CMSephadex C25 C50-O-CH2COOH61032403104-21053104-2105 4.5

21、0.5 第三十四页，共六十一页。强阴离子交换剂QAESephadex A25 A505830403104-21053104-2105 3.04.0 弱阴离子交换剂DEAESephadex A25 A50-C2H4N+(C2H5)2H592583 3104-21053104-21053.54.5 类别离子交换基团床体积ml/g分离范围(Mr)交换量总交换容量(m mol/g) -O-C2H4N+(C2H5)2第三十五页，共六十一页。 将各种离子(lz)基团引入到交联琼脂糖(Speharose CL)和大孔合成凝胶(Trisacryl或Fractogel)上，那么形成一系列离子交换剂。这类交换剂即

22、坚硬、吸附容量大，形状球形，能维持较好的流速及分辨率。3、交联凝胶离子交换(l z jio hun)剂第三十六页，共六十一页。三层析条件(tiojin)的选择1、离子交换剂的选择 选择离子交换剂之前要了解样品的性质：热稳定性、带电情况(qngkung)、pH和盐浓度对其活性和溶解度的影响。一般情况下，带负电的物质用阴离子交换剂，反之，那么用阳离子交换剂。实验室中最广泛使用的是DEAE和CM 交换剂。 2、交换颗粒大小的选择 粒子大小主要影响(yngxing)分辨率和流速。粗粒子：交换容量小、间隙大、分辨率底、流速较快。细粒子：分辨力高、交换容量大但是流速慢。第三十七页，共六十一页。3、层析缓冲

23、液的选择 选择正确的缓冲液可获得较好的层析效果。因为离子(lz)相互作用取决于pH，而维持介质的pH，通常是由缓冲液来实现的。所用缓冲液的种类、pH大小，决定 待别离组分的稳定性和溶解度。 为防止缓冲液的离子参与离子交换(l z jio hun)过程，采用缓冲液所带的电荷应与离子交换(l z jio hun)剂所带电荷相同。使用阳离子交换(l z jio hun)剂时，要用阴离子型缓冲液磷酸、醋酸等；使用阴离子交换(l z jio hun)剂时要用阳离子型缓冲液Tris、胺盐、吡啶等。第三十八页，共六十一页。 要得到好的别离效果，层析时要注意层析柱的高度和体积；上样量的大小；洗脱液体积；洗脱速

24、度；分级物的收集量。1、柱床体积：至少要比结合(jih)所有样品所需要的要大25倍。离子交换层析所用的柱不用太长，以便缩短操作时间。2、样品pH 和离子强度：与起始缓冲液具有相同的pH和离子强度。3、洗脱液体积和洗脱梯度的形状：对柱的分辨率影响很大。洗脱可用恒定组成的缓冲液来完成简单洗脱也可用改变pH或盐浓度，或二者均改变的洗脱液来完成。pH和盐浓度的改变又分为连续改变梯度洗脱和不连续改变阶段洗脱。四柱层析技术(jsh)第三十九页，共六十一页。 交换剂的处理就是将交换剂转变为适合别离目的的离子类型。一般包括除杂质、溶胀，除细粒和改型。改型就是用适当的离子平衡，使交换剂带上希望的离子。阳离子和阴

25、离子交换剂最后(zuhu)分别为Na和Cl型是最稳定形式。4、洗脱速度：太快或太慢都会降低柱的分辨率。5、分级物收集量：关系到能否充分代表层析柱的分辨率。一般(ybn)总洗脱体积在5002000ml时，每管收集510ml五离子交换剂的处理(chl)和再生 离子交换剂价格较贵，用后再经过再生处理，可反复屡次使用。处理时防止用强酸或强碱长时间浸泡，以防载体的糖链结构遭水解破坏。 第四十页，共六十一页。剂型处理用的酸或碱浓度浸泡时间纤维素 SephadexSepharose合成凝胶0.5M HCl或NaOH(含0.5M NaCl)0.1M HCl或NaOH(含1M NaCl)1M NaAc (pH3

26、.0)或0.1M NaOH(含1M NaCl)0.51.0M HCl或NaOH(含1M NaCl)34h0.5h可在柱中再生长时间浸泡无影响各类离子交换剂的再生(zishng)条件第四十一页，共六十一页。 血清蛋白常用离子交换(l z jio hun)层析别离。IgG可用QAESephadex A50或DEAESephadex A50别离。现在临床上有重要用途的许多血清蛋白，如白蛋白，factor IX复合物和专一性免疫球蛋白已用离子交换层析大规模生产。六离子交换层系的应用(yngyng)实例第四十二页，共六十一页。 凝胶层析又称凝胶渗透层析、排阻层析，分子筛层析等。它主要用于别离分子大小不同的生物大分子及测定(cdng)其分子量。凝胶层析设备简单，操作简便，每次层析后无需再生处理，因此，在生化研究中应用及其广泛。三、凝胶过滤(gul)层析第四十三页，共六十一页。 凝胶层析载体是多孔凝胶。当溶质通过层析柱时，溶质分子不仅是向下运动，而且还在做无定向扩散运动。分子直径比凝胶孔径大的分子，不能进入凝胶颗粒的微孔(wi kn)里，只能经过凝胶颗粒之间的孔隙。这样的分子是随溶剂一起移动的，因而最先流出柱外；而分子直径比凝胶孔径小的分子，那么能够自由进入凝胶颗粒的微孔(wi kn)之中，即进入凝胶相内。小分子向下移动的速度必然要落后于大分子。凝胶颗粒是固定相，洗脱液是流动相。