《基因工程》第三章 载体1课件

1、Princple and Technology of Genetic Engineering基因工程原理1 第三章 基因工程载体 教学目的与要求：1）掌握基因工程常用载体特点2）掌握基因克隆的基本方法2 第一节 载体的定义 3载体（Vector）是指在寄主细胞内能自我复制，并能够作为运输载体将重组DNA分子转移到寄主细胞的DNA分子。（A DNA molecule that is capable of replication in a host organism, and can act as a carrier molecule for the construction of recombi

2、nant DNA.）基因克隆载体：能承载外源DNA带入受体细胞，并在其中自我复制以维持和扩增外源DNA的一类DNA分子，又称为DNA克隆载体。 基因表达载体Require in a vector: Cloning sitesOrigin of replicationSelectable markerSafety载体应该具备记到主要条件，以pBR322为例进行说明：1克隆位点:在DNA分子合适的位置有1到多个克隆位点，可供外源DNA片段插入克隆载体DNA分子中。2复制起点：具有复制起点，外源DNA插入载体后，仍可由复制起点起始复制过程。3筛选标记基因：具有用于选择克隆子的标记基因。4安全性：克隆

3、载体必须是安全的，不应含有对受体细胞有害的基因，且不能转入除受体细胞以外的其他生物细胞，尤其是人的细胞。 pBR322为例说明负筛选法：首先用不含AP和TC的培养基，两种都长，然后选取一些菌落，在含AP的培养基上培养，不长的，说明有外源基因插入AP位点，到不含AP和TC的培养基的培养基上找到相应的点。拷贝数：一个寄主细胞中某种质粒的数量与染色体数量之比。一般寄主细胞只有一套染色体。按照拷贝数的多少，可以将质粒划分为严紧型质粒和松弛型质粒。当拷贝数在1-10之间时，通常称为严紧型质粒。很多大质粒是严紧型质粒。当拷贝数多于10个时，通常称为松弛型质粒，小质粒一般是松弛型质粒。严紧型质粒和松弛型质粒

4、之间没有严格界限。某种质粒对于某种寄主来说，拷贝数一般是一定的，拷贝数的存在是因为质粒上存在cop基因，它可以指令寄主细胞合成阻遏物，当质粒复制到一定拷贝数后，阻遏物也达到一定量，就阻遏质粒进一步复制。Number of Copies：一个寄主细胞中某种质粒的数量与染色体数目的比值。Based on the number of copies of the plasmid found in the host cell: low copy number plasmids, stringent(严紧型) control of DNA replication High copy number plas

5、mids, relaxed plasmid(松弛型)按照是否含有trans基因将质粒分为结合型质粒和非结合型质粒。Trans基因是一种可以指令寄主细胞产生鞭毛，合成细胞表面物质，促使寄主细胞与其他细胞相接合，导致遗传物质从一个细胞转移到另一个细胞。我们把含有trans基因的质粒称为结合型质粒，把不含有trans基因的质粒称为非结合型质粒。在基因工程中我们一般选用什么样的质粒？松散型、非结合型二、质粒克隆载体 质粒经改造后即可成为基因工程载体。如前述pBR322，载体需有克隆位点和标记基因。标记基因种类很多：1）抗性标记基因（可直接用于选择转化子） a. 抗生素抗性基因: Apr ，Tcr ，K

6、anr，G418r，Hygr ，Neor b. 重金属抗性基因: Cur ，Znr ，Cd r c. 代谢抗性基因: 抗除草剂基因 2）营养标记基因（可直接用于选择转化子）。主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶类的基因， 这类基因在酵母转化中使用最频繁，如TRP1，URA3，LEU2，HIS4等。3）生化标记基因。其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ, GUS, CAT。 葡萄糖苷酸酶基因（GUS） 该基因编码一种可分解各种-葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水解酶。该标记基因除具有上述lacZ基因的优点外，它的适用范围十分广泛，因为许多生物中没有这种基因。荧光素酶基因 荧光素酶或

7、由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶，并产生荧光，若在反应中加入CoA，可使灵敏度提高10倍；或由发光细菌（Photobacterium fischeri）产生的荧光素酶，它与FMN-氧化还原酶联用，通过NAD(P)H的变化测定酶活。发光蛋白质基因 发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质，该蛋白质可使大肠杆菌菌落呈蓝色。 半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZ） 半乳糖苷酶基因有1021 AAs，基因产物不具酶活性，装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：链和链。前者负责四聚体装配，后者具半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为-互补作用。这两个部分可独立存在

8、， 分别由两个基因编码。为链编码的基因称之为lacZ(编码145 AAs)。这两个基因（LacZ和LacZ）均可作为标记基因。 半乳糖苷酶基因的优点: a.酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观 b. lacZ编码5-端可容许很大的变化而不影响酶活性 c. lacZ和链基因的分别表达可使载体小而容量大Puc18/19克隆载体：1. 2.68kb2.ori来源于松弛型质粒ColE1的复制起始位点，可在大肠杆菌E.Coli HB101,E.Coli C600等细胞中高效复制（DH5）。3.含报告基因LacZ，lacZ取代了pBR332中的Tcr基因。 P LacZ LacZ 转录 翻译 pUC1

9、8 BamHI片段重组DNA分子 转化E.coli 外源DNA BamHI片段 涂布在含X-Gal和Ap的平板上,白色菌落为重组子，兰色菌落为原载体利用LacZ基因筛选重组子pUC18/19中lacZ序列筛选：lacZ来源于乳糖操纵子，含有启动子、调节因子和-半乳糖苷酶的-肽基因（lacZ）。该基因产物在含IPTG（异丙基-D-硫代半乳糖苷）和X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖）培养基培养时，菌落是蓝的。阳性克隆（转化子）是白色的。pUC familyPolylinker or multiple cloning site MCSpUCm-T载体(pUCm-T Vector):1

10、线性化的载体，2 载体每条链的3端带有一个突出的T。第三节 大肠杆菌的噬菌体载体（Bacteriophage vectors for use in E. Coli )一、噬菌体的定义（What are bacteriophages） 噬菌体是吃细菌的病毒颗粒（viruses, “eater of bacteria”）。CapsidtailGene 3 proteinCoat proteinDNAPhages fall into three main groups:(1) tailless(2) head with tail(3) Filamentous（细丝状）Genetic material

11、:(1) single-stranded RNA (2) double-stranded DNA病毒由DNA（or RNA）、外壳蛋白组成，经包装后成为病毒颗粒。进入宿主细胞后，利用宿主细胞的合成系统进行DNA（or RNA）复制和壳蛋白的合成。DNA和RNA不能共存于同一种病毒中。噬菌体有严格的宿主专一性，限制了其作为载体使用的范围。温和噬菌体（Temperate phages ）：插入宿主染色体DNA随着宿主细胞的复制而复制溶原阶段（Lysogenic Cycle）烈性噬菌体（Virulent phages）：不插入宿主染色体DNA自主复制溶菌阶段（Lytic Cycle）二、噬菌体载体（

12、Vectors based on bacteriophage ）1.DNA的特点1) DNA：噬菌体中的DNA，线状，48.5kb，编码46个基因，集中于头部。2) cos位点：左右两端各12个核苷酸组成的5-粘性末端。两者核苷酸序列互补，DNA在包装前是线状的，在包装后是环状的。3）46gene：成簇排列。不是所有gene都是生长必需的。 Capsid components 衣壳合成从A到J基因左侧区 Integration & excision 分裂合成（阴影区为基因操作中非必需部位） Early (late) regulation 早、晚调节 DNA synthesis DNA合成 Ly

13、sis 释放4）有 56种限制性核酸酶的酶切位点5）噬菌体的生长途径有两种。Lysis of cell and release ofmature phage particlesInductionLysogenic responeCell divisionLytic responepSuch as ultraviolet lightAssembled or packaged5）噬菌体的生长途径有两种。噬菌体载体感染E.coliDNA注入细胞（溶菌阶段）cos位点连接复制在R和S蛋白作用下细胞破裂噬菌体载体感染E.coliDNA注入细胞（溶原阶段）在宿主细胞int基因作用下插入宿主染色体复制紫外线

14、1.插入型载体（Insertion vectors）：多用于cDNA构建文库。1）免疫功能失活型 如gt10，其左、右臂之间有一个CI基因，该基因应用了imm434免疫区段。该区段完全时，出现浑浊的噬菌斑噬菌体进入溶菌阶段；该区域被破坏时，CI基因失活，结果产生清晰的噬菌斑。可以通过形态学上的差异将两者分开。2) -半乳糖苷酶失活型 如Charon 16A，gt11。2.替换型载体（replacement vectors or substitution vector）常用于基因组文库构建在左右臂之间有填充物，可以被外源DNA所取代，中央可取代片段两侧的多克隆位点是反向重复序列，因此当外源DNA

15、插入时，一对克隆位点之间的DNA序列将被替换掉。Stuffers和polystuffer区可以被替换掉。EMBL4：当用两端酶切位点时，中间也可以用其他酶切割一下，以防原噬菌体片段退火。Charon40：中间含有多节段区（polystuffer），MCS是反向重复序列。两者可容纳外源DNA能力9-22kb之间。 使用替换型载体克隆外源DNA包括三个步骤： 用恰当限制性酶消化载体，除去基因组中可替代的部分将上述所得DNA臂同外源DNA相连接 重组体的DNA分子进行包装和增殖，以得到有感染性的重组噬菌体图3-8 置换型载体组成示意图图3-9 EMBL3 载体结构示意图Phagemids (phas

16、mids): the phage functions are expressed, for example, ZAP family by strategene.二、凯伦噬菌体载体凯伦噬菌体载体（Charon vector）是F.R Blattner在1977年在噬菌体基础上发展出来的一种特殊噬菌体载体。Charon：是古希腊神话中一名老摆渡工，专门负责在斯蒂克斯河（River styx）上，运送亡灵到阴间。 容纳能力 感染效率质 粒：n kb-n bp 低，0.1%转化率 噬菌体：大片段，n kb-23 kb 高 几乎每个颗粒都有100%感染率 图3-11 GEM -II载体结构示意图三、M1

17、3噬菌体 M13噬菌体是一种丝状（filamentous）噬菌体，内含有环状、单链DNA分子（“+”链DNA）,长为6407个核苷酸，含DNA复制和噬菌体增殖所需的遗传信息，可分为10个区。还有一个长507个核苷酸的基因间隔区（IS区），从第5489个核苷酸到第6005个核苷酸。M13的复制起点定位在基因间隔区内，但IS区内有些核苷酸序列即使发生突变、缺失或插入外源DNA，也不会影响M13DNA的复制，这为M13DNA构建克隆载体提供了条件。可编码三类蛋白质： 复制蛋白质 （基因，） 形态发生蛋白质 （基因，） 结构蛋白质 （基因，）M13mp18 M13噬菌体周期： M13噬菌体通过鞭毛吸附

18、，感染雄性大肠杆菌，M13噬菌体的“+”链进入细胞内，以此为模板，复制互补的“-”链DNA。由此产生的双链M13DNA称为复制型DNA（RF-DNA）。RF-DNA按一般环状双链DNA进行复制。 当细胞内RF-DNA达到近200个拷贝时，则RF-DNA中的“+”链DNA被单链特异的DNA结合蛋白结合，阻止“+”链DNA的复制合成。结果，细胞内只能以“-”链为模板不断复制合成新的“+”链DNA。 新合成的“+”链DNA立即被积累在细胞内的壳蛋白包装成新的噬菌体颗粒，并不断挤出宿主细胞。 （ 单链，“+”链存在于噬菌体中，双链DNA存在于宿主细胞中。 ）M13噬菌体周期的特点：增殖过程不会导致宿主

19、细胞的溶菌生长，被感染的细胞一个世代可以释放1000个子代噬菌体。M13包装DNA分子的能力可达M13DNA本身的6倍。制备的M13DNA，单、双链均可转染大肠杆菌受体细胞，因此M13DNA作为载体时，不必进行体外包装就可以直接转染受体细胞。第四节 原核生物应用的其他载体一、cosmid质粒载体噬菌体特点：两端部少于280bp，且含有cos位点，可以插入36.4-51kb长度的DNA； 质粒克隆载体特点：不用包装即可转导。克隆能力一般不超过10kb，载体大小一般也在10kb以下，是环状双链DNA.cosmid质粒载体特点：将噬菌体载体的cos位点和质粒克隆载体相结合，大约4-6kb长，能够容纳

20、47kb的外源DNA。Cosmids: The vector be made up of plasmid sequences joined to the cos sites of phage, about 4-6kb in length, can accommodate cloned DNA fragments up to some 47kb in length.二、噬菌粒载体 M13噬菌粒载体（ M13噬菌粒和质粒）优点是可以用来制备克隆基因的单链DNA。不足之处：A. 插入外源片段后，遗传稳定性下降，外源DNA越大越严重。B外源片段只按一种方向插入；C接受外源DNA能力有限，小于1500b

21、p。噬菌粒载体特点：A. 分子量一般都比M13载体小，约3000bp，易于操作；B. 可得到10kb的外源DNA单链序列；？C. 有质粒和噬菌体的复制起点，因此在大肠杆菌寄主中可以按正常双链质粒DNA分子形式复制；在有辅助噬菌体时可以按M13形式复制；D. 可以从噬菌体直接测序。例： pMB1 replicon（复制子）: 体外包装，感染，质粒型复制 可容纳外源DNA片段：30-45kb； 基因组文库中使用。 Genome mapping （酵母人工染色体 亚克隆）。第五节 真核细胞应用的载体 1 Ti 质粒（ Ti：Tumor-induce肿瘤诱发）根癌农杆菌(Agrobacterium t

22、umefaciens)与Ti质粒的G-菌，可侵入90科双子叶植物受伤组织，形成冠瘿瘤(crown gall tumor)。冠瘿瘤细胞具有以下特征：1）不需要补充植物激素便可进行离体培养；2）合成肿瘤特有的化合物冠瘿碱(opine)，能专一的为根癌农杆菌所利用。这两个特征由Ti质粒决定，但该质粒中仅有一部分进入植物细胞。 Ti 质粒存在于根癌农杆菌中，大小为90-150 x106道尔顿,结构是环状双链DNA,160-250kb，具六个功能区： 致瘤区：合成植物生长素和细胞分裂素； 冠瘿碱（opine）合成区：参与冠瘿碱合成； 冠瘿碱分解区：参与冠瘿碱分解； Ti 质粒转移区(tra)：参与不同农

23、杆菌中的接合转移； 毒（性）区：参与T-DNA的转移和插入植物染色体； DNA复制区：参与Ti 质粒DNA复制。Agrobacterium oriOpine synthesisT-DNALBRBCytokinin synthesisAuxinsynthesisVirulence geneConstruction of Ti plasmid合成氨基酸衍生物-冠瘿碱Anxin synthesis gene：合成细胞分裂素合成吲哚乙酸Cytokinin synthesis gene：Opines synthesis gene：Ti 质粒类型（由Ti 质粒所产生的冠瘿碱种类而定）有： 章鱼碱类(oct

24、opine)； 胭脂碱类(nopaline)； 农碱类(agropine)T-DNA ：Ti质粒中与植物染色体结合的部位称为T-DNA。T-DNA包括植物激素冠瘿碱合成区基因及两侧相同的25 bp重复序列，T-DNA整合不具特异性，右侧25 bp重复序列对T-DNA的转移至关重要。2.Ti质粒载体的中间载体（intermediate vector）Ti质粒作为载体的问题：1）太大，不易转化2）无适合克隆位点3）T-DNA致瘤区合成植物生长素和细胞分裂素，使转化细胞成瘤状，不能成为完整植株Ti质粒载体的中间载体由几部分组成：A. 适合E.Coli和A.Tumfaciens自主复制和选择用标记基因

25、B. 适合于植物细胞选用的标记基因C. 一段来自天然Ti质粒的部分T-DNA序列（提供同源重组）D1-2个来自T-DNA边界的25bp重复序列E用于表达外源基因的DNA序列（如启动子、终止子序列）Modified Ti plasmidDelete： genes of the production of bacterial food and of plant hormonesInsert： selectable marker genepCAMBIA1301质粒T-Border(right)Nos 3Gus35S5NcoI35S5Hyg(R)T-Border(left)35S3HinDIIISal

26、IBamHIEcoRIBstEIIpCAMBIA130111837bpLac Z植物根部羟基乙酰丁香酮乙酰丁香酮植物细胞单链-DNAFormation of crown gall 植物根部受伤部位分泌乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酸诱导Ti质粒vir基因及根瘤菌染色体上的一个操纵子表达vir基因产物将Ti质粒上T-DNA单链切下根瘤菌染色体上的操纵子表达产物与单链T-DNA形成复合物复合物转化植物根部细胞 3Ti质粒的转移过程T-DNA Integrating to plant genomeT-DNA Integrating to plant genome 二、酵母应用的质粒载体以大肠杆菌质粒为基本

27、骨架，具有酵母的DNA复制起始区，选择标记，有丝分裂稳定区和外源DNA插入位点。Yeast episomal plasmids（YEps 附加型质粒）：在pBR322中插入酵母筛选标记ura3和2质粒DNA片段（复制起始部位和rep基因），拷贝数高，稳定。以附加体形式在真核细胞中复制。（yeast 2 plasmid, may replicate autonomously or integrate into a chromosomal location.） Yeast integrative plasmids（YIps 综合型整合质粒）：含有酵母的筛选标记ura3基因，但缺乏酵母的复制起始位点

28、，所以，它只有整合到酵母染色体中才能复制。（Yips are designed to integrate into the chromosome in a similar way to the Yep plasmid.） Yeast replicative plasmids（YRps 重复型 复制型质粒）：含有酵母的筛选标记ura3和DNA自主复制序列ARS，在真核生物中能独立自主复制，拷贝高但不稳定。(YRps: remain as independent plasmids and do not integrate.) Yeast centromere plasmids（YCps 着丝粒 稳定质粒）：在复制质粒中插入酵母