简第四章 基因工程制药(二)课件

1、第四章 基因工程制药（二）基因工程菌的稳定性；基因工程菌生长代谢的特点；基因工程菌中试（看课本自学）；基因工程菌发酵；基因工程药物的分离纯化；基因工程药物的质量控制。第六节 基因工程菌的稳定性遗传不稳定性的表现；遗传不稳定性的的产生机制 ；影响基因工程菌稳定性的因素；提高质粒稳定性的方法；质粒稳定性的分析方法 ； 四章 基因工程制药2遗传不稳定性的表现基因工程菌的稳定性至少应在25代以上。不稳定性两种表现形式：质粒结构不稳定：重组 DNA 分子某一区域缺失、重排、修饰，表观生物学功能丧失；质粒分裂不稳定：分裂时出现一定比例不含质粒的子代菌；四章 基因工程制药3遗传不稳定性的的产生机制 宿主细胞

2、限制修饰系统 降解 外源重组 DNA 分子；宿主细胞中质粒自发缺失重排。重组质粒在受体细胞分裂时不均匀分配。（1.质粒的丢失频率。2.比生长速率的差异）比生长速率 ：每小时单位质量的菌体所增加的菌体量称为菌体比生长速率。它是表征微生物生长速率的一个参数，也是发酵动力学中的一个重要参数。其大小为0.693除以倍增时间td（菌体量倍增）。 四章 基因工程制药4影响基因工程菌稳定性的因素遗传特性：宿主；载体；外源基因是否整合到宿主染色体上。发酵工艺：比生长速率培养基（生长速率、限制性基质）；温度、pH 值和溶氧； 培养操作方式；四章 基因工程制药5培养基（22）大肠杆菌HB101菌株中：pBR322

3、质粒：在磷酸盐限制时最不稳定，其次是葡萄糖和镁离子限制；pBR325质粒：葡萄糖限制最不稳定，磷酸盐限制稳定。一般，E.coli对葡萄糖和磷酸盐限制易发生质粒不稳定，有些工程菌对氮、钾、硫等表现不稳定。培养基中添加酵母提取物和谷氨酸等有利于提高质粒稳定性。四章 基因工程制药7温度大多数基因工程菌，在一定温度范围内，随着温度升高，质粒稳定性下降；E.coli：生长最适温度：37；质粒稳定性最好的温度：30；温敏启动子控制的质粒：42诱导外源基因的表达（经常伴随质粒丢失）。四章 基因工程制药8溶解氧和搅拌强度一般，低溶氧，质粒稳定性差（可能是氧限制了能量的供应）；酵母发酵中，需要保持79DO，才能

4、维持质粒稳定性。质粒稳定性随搅拌强度提高明显下降。四章 基因工程制药10培养方式分批：相对稳定；连续：特别是在非选择性培养基中，质粒很不稳定；四章 基因工程制药11提高质粒稳定性的方法施加选择压力（分裂不稳定有效，生产不可取）:抗药性标记：抗生素；营养缺陷型标记：营养组份。分阶段控制培养：菌体生长阶段（阻遏）；菌体达到一定浓度（诱导和去阻遏）。控制培养条件：培养基，T，pH，DO，有害代谢物；(基因工程菌反应慢)固定化。四章 基因工程制药12平板稀释计数法基因工程菌选择性培养液对数生长期非选择性培养液繁殖一定代数涂布选择性培养基非选择性培养基四章 基因工程制药14平板点种法基因工程菌非选择性培

5、养基长出菌落选择性培养基（含抗性标记）统计菌落数计算稳定率四章 基因工程制药15菌体生长的表示方法通常用比生长速率来表示；比生长速率 ：每小时单位质量的菌体所增加的菌体量称为菌体比生长速率。它是表征微生物生长速率的一个参数，也是发酵动力学中的一个重要参数。其大小为0.693除以倍增时间td（菌体量倍增）。 四章 基因工程制药17菌体生长的调控主要有两种观点：能量决定最大比生长速率；小分子前体和催化组分等决定最大比生长速率。四章 基因工程制药18菌体生长与能量的关系能量（生长）能量（有氧代谢），产生代谢副产物乙酸；有报道，乙酸浓度达到15g/L时菌体生长停止；乙酸的抑制与pH有关，适当提高pH能

6、减少乙酸的抑制。四章 基因工程制药19葡萄糖通过糖酵解产生的丙酮酸，在有氧条件下，将进入三羧酸循环进行完全氧化，生成H2O 和CO2，并释放出大量能量；第一 阶段：（丙酮酸由胞液进入线粒体后）丙酮酸的氧化脱羧（丙酮酸 乙酰CoA）； 第二阶段：三羧酸循环（乙酰CoA H2O 和CO2，释放出能量）。四章 基因工程制药20ab1234四章 基因工程制药21四章 基因工程制药22在一定范围内控制菌体生长，抑制乙酸生成：分批培养中选用不同的碳源、补料培养中控制补料速度、连续培养中控制稀释速率等培养方法，（控制EMP、增强TCA）；加入蛋氨酸（提高菌体的有氧代谢能力）和酵母提取物（减少葡萄糖摄取）；代

7、谢工程改变关键酶活性；采用磷酸乙酰化酶缺陷株作为宿组主细胞，阻止乙酸产生。四章 基因工程制药24菌体生长与前体供应的关系小分子前体量和催化结构是有限的，因而生物大分子的合成处于亚饱和状态，限制了菌体的比生长速率；基因表达在各个水平的竞争又是各个基因互相竞争共同的前体和催化结构的结果；基因工程菌质粒的表达需与宿主细胞竞争共同的前体和催化结构，致工程菌生长速率降低（工程菌的比生长速率往往低于其宿主细胞，特别是工程菌诱导后）。四章 基因工程制药25第八节 基因工程菌中试看课本自学。四章 基因工程制药27第九节 基因工程菌发酵基因工程菌的培养过程；基因工程菌常用的培养方式；基因工程菌的发酵工艺；培养基

8、组成与控制；培养工艺与控制；其他因素对基因工程菌发酵的影响；基因工程菌的培养设备；高密度发酵。四章 基因工程制药28四章 基因工程制药29四章 基因工程制药30一 基因工程菌的培养过程基因工程菌的培养过程主要包括：摇瓶：了解工程菌生长的基础条件，如温度、pH、培养基各种组分以及碳氮比，分析表达产物的合成、积累对受体细胞的影响；培养罐：确定培养参数和控制的方案以及顺序。四章 基因工程制药31二 基因工程菌常用的培养方式分批培养（batch culture）；补料分批培养（fed batch culture）；连续培养（continuous culture）；透析培养（dialysis cultu

9、re）；固定化培养（immobilized culture）。四章 基因工程制药32分批培养DO-Stat方法：DO控制在20（搅拌转速、通气速率）；Balanced DO-Stat方法：乙酸维持在低浓度（DO、搅拌转速、糖的流加速率）；糖的流加速率和DO的平衡。控制菌体比生长速率：葡萄糖流速；搅拌转速。四章 基因工程制药33连续培养以一定稀释率进行不间断培养；基因工程菌的不稳定性连续培养困难；解决办法：生长阶段和基因表达阶段分开，两阶段连续培养，第一阶段质粒稳定，第二阶段获得最高表达水平或最大产率。关键的控制参数：诱导水平、稀释率和细胞比生长速率。四章 基因工程制药34补料分批培养培养一段时

10、间后，间歇或连续补加新鲜培养基；根据生长规律，通常控制溶氧和流加补料结合。四章 基因工程制药35透析培养原理：利用膜的半透性使培养物和培养基分离；目的：去除代谢产物如乙酸等对工程菌生长和外源基因表达的影响；膜、透析液、时间等；E.coli青霉素酰化酶（11倍）。四章 基因工程制药36固定化培养基因工程菌培养的一大难题：维持质粒的稳定性。固定化技术应用：固定化后，质粒的稳定性大大提高，便于连续培养，特别是对分泌型菌更为有利。四章 基因工程制药37三 基因工程菌的发酵工艺与传统的微生物发酵工艺的区别：生物材料方面：基因工程菌带外源重组载体；生产目的方面：基因工程菌生产的目的是使外源基因高效表达，尽

11、可能减少宿主细胞本身蛋白的污染。基因工程菌发酵对营养要素和环境条件的需求与宿主菌有共性之处，但也有特殊的需求。特殊需求往往比共性需求更重要，更难满足，经常是制约产业化的重要因素。四章 基因工程制药38四 培养基组成与控制培养基组成碳源选择剂诱导物无机盐氮源其他生长稳定四章 基因工程制药39碳源常用碳源：葡萄糖（比生长速率大，副产物多）、甘油（得率大）、乳糖（lac诱导）、甘露糖（不产乙酸，比生长速率大）、果糖等； 酵母：利用葡萄糖、半乳糖等单糖类物质；单糖、双糖及其他有机物如甘油：低浓度对菌体生长具有一定的促进作用； 浓度稍高表现出底物抑制作用。四章 基因工程制药40氮源常用的氮源：酵母提取物

12、、蛋白胨、酪蛋白水解产物、玉米浆和氨水、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等；不同菌对氮源利用能力差异很大，高选择性；大肠杆菌：大分子有机氮源，酵母粉等； 酵母：氨基酸。四章 基因工程制药41无机盐 磷、硫、钾、钙、镁、钠等大量元素和铁、铜、锌、锰、钼等微量元素的盐离子形态； P：低浓度细菌生长；高浓度目的蛋白不表达；一般起始浓度0.015mol/L左右。其他：维生素、生物素、营养物质（营养缺陷型菌株）等。四章 基因工程制药42选择剂（selective agent）维持工程菌的纯正性和质粒的稳定性的化合物；目的：质粒的稳定性，根据质粒上的营养缺陷或选择性标记基因，添加或缺陷选择剂；选择剂种类：营养缺陷互

13、补和抗生素抗性；工程大肠杆菌：卡那霉素、氨苄青霉素、氯霉素、博来霉素等抗生素作为选择剂；工程酵母菌：氨基酸营养缺陷型，缺陷亮氨酸、组氨酸、赖氨酸、色氨酸等。四章 基因工程制药43诱导物诱导表达型工程菌：细胞生长到一定阶段，必需添加诱导物，以解除目标基因的抑制状态，活化基因，进行转录和翻译，生成产物；Lac启动子表达系统：IPTG（异丙基-D硫代半乳糖苷）诱导；甲基营养型酵母：甲醇诱导。四章 基因工程制药44五 培养工艺与控制测定的主要参数；温度；pH值；溶解氧；补料与控制；其他。四章 基因工程制药45四章 基因工程制药46四章 基因工程制药47温度温度对酶的影响（生长，产物）；温度对基因表达的

14、调控；常见工程菌的温度；温度对工程菌发酵的影响；温度控制。四章 基因工程制药48温度对基因表达的调控温度对基因表达的调控可发生在复制、转录、翻译或小分子调节分子的合成水平上：复制：通过调控复制，改变基因拷贝数，影响基因表达；转录：通过影响RNA聚合酶的作用或修饰RNA聚合酶，调控基因表达；mRNA降解和翻译水平上影响基因表达：通过细胞内小分子调节分子的量的多少影响基因表达；影响蛋白质的活性和包含体的形成。四章 基因工程制药49常见工程菌的温度大肠杆菌和酿酒酵母生长最低温度为10；大肠杆菌生长最适温度为37，最高温度为45；酿酒酵母生长最适温度为30，最高温度为40。四章 基因工程制药50温度对

15、工程菌发酵的影响生长与生产温度不一致；较高温度：表达包涵体；较低温度：利于表达可溶性蛋白质；热敏感的蛋白质：先高温，然后低温，变温表达，避免蛋白质降解。四章 基因工程制药51温度控制两段变温发酵培养：前期：较高温度，获得足够高的菌体密度；后期：较低温培养，有效抑制目标产物的降解和包涵体形成（温度诱导型工程菌除外）；温度诱导型大肠杆菌表达系统：生长期维持37，生产期提高温度42；分泌型重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子工程菌E.coliW3100：30目的产物最高；重组人生长激素：30（可溶产物）；37（包涵体）。四章 基因工程制药52pH值pH值对发酵的影响；pH值控制。四章 基因工程制药53p

16、H值对发酵的影响细菌喜欢偏碱性：大肠杆菌适宜pH为6.57.5；真菌喜欢微酸性：酵母适宜pH为5.06.0；pH值对发酵的影响：最适生长和最适生产pH不同，两阶段控制；影响产物稳定性；干扰素酸性稳定，碱性降解；乙酸对pH的影响。四章 基因工程制药54pH值控制分阶段控制pH；可采取的措施：两阶段培养工艺：前期优化工程菌的最佳生长条件（一般6.87.4），后期优化外源蛋白表达条件（一般最佳pH6.06.5）。具体实现：培养基；中间补料。四章 基因工程制药55溶解氧控制工程菌一般是好氧微生物；DO对菌体的生长和产物的生成影响很大；外源基因的高效表达和翻译需要维持较高水平的DO值（大于等于40）；采

17、取措施：调节搅拌转速，前期较低转速，满足菌体生长；后期，提高转速满足菌体继续生长和外源蛋白产物的形成；氧不足乙酸，正常代谢；氧过量细胞成分的氧化分解。四章 基因工程制药56补料与控制补料的目的：消除底物抑制（增加生物量和产量）；解除反馈抑制和分解产物的阻遏抑制；调控pH。补料控制指标：直接参数；间接参数。基因工程菌发酵中，常对葡萄糖进行流加补料。四章 基因工程制药57六 其他因素对基因工程菌发酵的影响接种量的影响；诱导时机的影响；诱导表达程序的影响。四章 基因工程制药58接种量的影响接种量：种子液体积培养液体积。接种量小：不利于外源基因的表达，延迟期长，增加污染机会；接种量过高：成本，抑制后期

18、生长；接种量决定10-15%。四章 基因工程制药59诱导时机的影响诱导时间：影响表达量和产物存在形式；化学诱导表达： 化学诱导型启动子： lac、tac、T7等； 诱导时间：对数生长期； 细菌：IPTG诱导； 甲基营养型酵母：甲醇诱导。温度诱导表达： 温度诱导型启动子： PL、PR启动子； 两段培养发酵； 诱导时间：菌体生长的对数期或稍后一些，升高温度，合成产物。四章 基因工程制药60诱导表达程序PL或PR启动子型的工程菌：热诱导的程序对提高外源蛋白表达量至关重要；细胞遇到热诱导会产生热激蛋白，热激蛋白形成与时间有关系：升温的时间短：热激蛋白速度很快下降；时间过长，热激蛋白合成量剧增；需要迅速

19、升温，要求在2min内完成诱导表达的升温过程。四章 基因工程制药61基因工程菌的培养设备发酵罐的组成部分有：发酵罐体、保证高传质作用的搅拌器、精细的温度控制和灭菌系统、空气无菌过滤装置、残留气体处理装置、参数测量与控制系统以及培养液配置及连续操作装置等。（见图26）四章 基因工程制药62四章 基因工程制药63四章 基因工程制药64第十节 基因工程药物的分离纯化基因工程产品的特点；分离纯化的基本过程；分离纯化的技术；选择分离纯化方法的依据。四章 基因工程制药65一 基因工程产品的特点多数是活性肽或蛋白质，有下列特点：含量较低；发酵醪液组成复杂；目的产物稳定性差；表达产物的种类繁多、结构不一、活性

20、各异；对其质量要求纯度高、无菌、无热原。四章 基因工程制药66二 分离纯化的基本过程主要流程包括：细胞破碎；固液分离；浓缩与初步纯化；高度纯化直至得到纯品；成品加工。流程如P47图28所示。四章 基因工程制药67四章 基因工程制药68三 分离纯化的技术分离纯化技术应满足下列要求：条件温和；选择性好；收率高；两个技术之间能直接衔接；整个过程快。四章 基因工程制药69（一）细胞破碎与固液分离细胞收集：离心法、膜分离法；细胞破碎：机械破碎法：高压匀浆法、超声破碎法、高速珠磨法、高压挤压法；非机械破碎法：酶溶法、化学渗透法、热处理法、渗透压冲击法等。固液分离：离心；过滤；双水相萃取（如乙二醇无机盐等）

21、。四章 基因工程制药70（二）目的产物的分离纯化蛋白质分离纯化方法（根据理化性质和生物学特性）；主要层析分离方法。分为离子交换层析、疏水层析、亲和层析、凝胶层析等；。四章 基因工程制药71（三）非蛋白质类杂质的去除纯化过程中，需特别注意3种可能存在的非蛋白类杂质：DNA；热原质；病毒。具体除去方法见课本P61。四章 基因工程制药72五 选择分离纯化方法的依据根据产物表达形式来选择：可溶性表达产物；周质表达产物；包涵体（蛋白的复性）。根据分离单元之间的衔接选择：低分辨率高分辨率；根据分离纯化工艺的要求来选择：稳定性，重复性，协调性，安全性，步骤少，时间少，试剂少，能耗少，收率高。四章 基因工程制药73第十一节 基因工程药物的质量控制基因工程药物质量控制的特殊性；原材料的质量控制；培养过程的质量控制；纯化工艺过程的质量控制；目标产品的质量控制；产品的保存。四章 基因工程制药74一 基因工程药