琼脂糖凝胶电泳系统课件

1、哺乳动物基因组DNA的提取实验一 储备液的制备实验二 破碎细胞实验三 分离、纯化DNA实验四 琼脂糖凝胶电泳检测DNA10/14/20222003级 分子生物学实验哺乳动物基因组DNA的提取实验一 储备液的制备10/11一、实验目的通过本实验了解并掌握提取动物基因组DNA的原理和步骤。通过本实验熟练掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的实验技术。熟练掌握分子生物学实验中各种仪器的使用方法及试剂的配制方法。10/14/20222003级 分子生物学实验一、实验目的通过本实验了解并掌握提取动物基因组DNA的原理和二、实验原理 天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取D

2、NA时，先把DNP抽提出来，再把P除去，再除去细胞中的糖，RNA及无机离子等。在EDTA和SDS等去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提，可以得到哺乳动物基因组DNA。用此方法得到的DNA大小为100-150 kb，适用于噬菌体构建基因组文库和Southern分析。10/14/20222003级 分子生物学实验二、实验原理 天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形三、仪器、材料和试剂（一）仪器高速冷冻离心机、微量取样器、玻璃匀浆器、琼脂糖凝胶电泳系统：电泳仪、水平电泳槽、紫外透射仪（或凝胶成像分析系统）、恒温水浴器、高压灭菌锅、超净工作台、超低温冰箱、电子天平、酸度计10/14/

3、20222003级 分子生物学实验三、仪器、材料和试剂（一）仪器10/11/20222003级（二）实验材料、用具、药品1.鼠肝或兔肝2.1.5 mL微量离心管、微孔过滤器、 20mL注射器、各种型号的吸头3.三羟甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基硫酸钠(SDS)、乙二胺四乙酸(EDTA)、醋酸钠（NaAc）、平衡酚、氯仿、异戊醇、乙醇、琼脂糖、蛋白酶K、RNA酶、DNA相对分子质量标准物、硼酸、溴酚蓝、蔗糖 溴化乙锭（危险）10/14/20222003级 分子生物学实验（二）实验材料、用具、药品1.鼠肝或兔肝10/11/2022（三）试剂 1. 5 molL NaCl 2. 0.5 molL

4、 Tris.HCl pH8.0 3. 0.5 molL EDTA pH8.0 4. 3 molL NaAc pH5.2 5. dddH2O 6. 生理盐水（0.85 NaCl）以上均高压灭菌10/14/20222003级 分子生物学实验（三）试剂 1. 5 molL NaCl10/117. 10mgmL蛋白酶K配好后用一次性过滤器过滤，-20保存；8. 10mgmL无DNA酶的RNA酶配好后用一次性过滤器过滤， -20保存；9. 组织匀浆液10.酶解液 11.提取液1：平衡酚(pH8.0)：氯仿：异戊醇25：24：1 12.提取液2：氯仿：异戊醇24：1 13.5TBE14.TE缓冲液15.6

5、凝胶加样缓冲液10/14/20222003级 分子生物学实验7. 10mgmL蛋白酶K配好后用一次性过滤器过滤，-20四、实验步骤本实验在无液氮的条件下，制备鼠肝或兔肝DNA，与有液氮条件下相比，产量和质量都有所下降。整个操作过程中，应尽量避免DNA酶的污染，特别注意动作温和，减少对DNA的机械损伤。 10/14/20222003级 分子生物学实验四、实验步骤本实验在无液氮的条件下，制备鼠肝或兔肝DNA，与（一）储备液的制备（第一次） 1. 5 molL NaCl 2. 0.5 molL Tris.HCl pH8.0 3. 0.5 molL EDTA pH8.0 4. 3 molL NaAc

6、pH5.2 5. dddH2O 6. 生理盐水（0.85 NaCl）以上均高压灭菌 7. 10mgmL 蛋白酶K -20保存 8. 10mgmL 无DNA酶的RNA酶 -20保存 9. 5TBE 10. 6凝胶加样缓冲液10/14/20222003级 分子生物学实验（一）储备液的制备（第一次） 1. 5 molL （二）破碎细胞（第二次） 冰浴处理生理盐水 玻璃匀浆器 冰冷的生理盐水清洗配制工作液 处死小鼠 取出肝脏 组织匀浆液 酶解液2ml匀浆液 组织细胞液 玻璃匀浆器匀浆 移至1.5ml离心管5000rmin3060s 加400ul 吹散 加400ul 离心 无菌水 酶解液 水浴处理（55

7、、1218h） 10/14/20222003级 分子生物学实验（二）破碎细胞（第二次） 冰浴处理生理盐水 （三）分离、纯化DNA （第三次） 等量分装在两支离心管内 加入20ul的RNase 加入等体积提取液500ul 4 10min 酶解样品 待抽提的样品 抽提 静置 离心 配制 TE缓冲液 加等体积提取液500ul10000rmin离心10min 4 10min 移出水相 至离心管 抽提 静置 10000rmin离心10min 加1/10 加2倍 放入离心 移出水相 NaAc 无水乙醇 -75 1-2h 12000rmin离心15min 加入超低温冰箱 融化、离心 弃上清液 洗涤 1200

8、0rmin离心15min 干燥 4 75%冷乙醇 离心 弃上清液 加TE 存放 DNA 10/14/20222003级 分子生物学实验（三）分离、纯化DNA （第三次） （四）琼脂糖凝胶电泳检测DNA （第四次）制备琼脂糖凝胶 胶板的制备 加样 电泳 紫外投射仪检测 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中由负极向正极移动。10/14/20222003级 分子生物学实验（四）琼脂糖凝胶电泳检测DNA （第四次）制备琼脂糖凝胶 1.计算方法:（1）摩尔质量的计算:质量(g)分子量 5 molL NaCl 分子量58.44 x58.

9、44（2）组织匀浆液：10ml 5 molL NaCl 100mmolL 5 molLx 0.1molL 10ml 0.2ml 体积(L) 摩尔体积（mol/L）0.5(L) 5（mol/L） x 146.1（g）10/14/20222003级 分子生物学实验1.计算方法:（1）摩尔质量的计算:体积(L) 摩尔体积2.溶液的配置（1) 3mol/L乙酸钠（sodium acetate）： 溶解20.4g的三水乙酸钠于约40ml水中，用冰乙酸调溶液的pH至5.2，再加水定容到50ml 。(2) 0.5mol/L乙二胺四乙酸（EDTA）: 配制等摩尔的Na2EDTA和NaOH溶液（0.5mol/L

10、），混合后形成EDTA的三钠盐。或称取9.31g的Na2EDTA2H2O和1g的NaOH，并溶于约40ml水中，定容至50ml 。(3) 5mol/L氯化钠（NaCl）： 溶解14.6g氯化钠于足量的水中，定容至50ml。 10/14/20222003级 分子生物学实验2.溶液的配置（1) 3mol/L乙酸钠（sodium ac(4) 10十二烷基硫酸钠（SDS）： 称取10gSDS慢慢转移到约含90ml的水的烧杯中，用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解。用水定容至100ml 。(5) 10N氢氧化钠（NaOH）： 溶解40g氢氧化钠颗粒于约90ml水的烧杯中（磁力搅拌器搅拌），氢氧化钠完全溶解后用水

11、定容至100ml 。(6) 1mol/L盐酸（HCl）： 加8.6ml的浓盐酸至91.4ml的水中。10/14/20222003级 分子生物学实验(4) 10十二烷基硫酸钠（SDS）：10/11/2022(7) 20mg/ml蛋白酶K（proteinase K）： 将200mg的蛋白酶L加入到9.5ml水中，轻轻摇动，直至蛋白酶K完全溶解。不要涡旋混合。加水定容到10ml，然后分装成小份贮存于-20。(8) 10mg/mlRnase（无DNase）（DNasefree RNase）： 溶解10mg的胰蛋白RNA酶于1ml的10mmol/L的乙酸钠水溶液中（pH 5.0）。溶解后于水浴中煮沸15

12、min，使DNA酶失活。用1mol/L的TrisHCl调pH至7.5，于-20贮存。（配制过程中要戴手套） 10/14/20222003级 分子生物学实验(7) 20mg/ml蛋白酶K（proteinase K）：(9)Tris缓冲液（Tris-HCl buffer） 将121g的Tris碱溶解于约0.9L水中，再根据所要求的pH（25下）加一定量的浓盐酸（11.6N），用水调整终体积至1L。 浓盐酸的体积（ml）pH148.62128.53846566671.376 9.08.88.68.48.28.07.87.67.47.2 10/14/20222003级 分子生物学实验(9)Tris缓冲

13、液（Tris-HCl buffer） 5TBE（电泳缓冲液） 100mL5.4gTris，2.75g硼酸， 2mL 0.5molL EDTA(pH8.0)加蒸馏水到100mL（1000ml）pH8.010/14/20222003级 分子生物学实验5TBE（电泳缓冲液） 100mL5.4gTris，10/6上样缓冲液025溴酚蓝：取60ml双蒸水，将250mg溴酚蓝溶解于其中40(WV)蔗糖水溶液：在上述溶液中加入40g蔗糖10/14/20222003级 分子生物学实验6上样缓冲液025溴酚蓝：取60ml双蒸水，将250m破碎细胞1取0.2g鼠肝或兔肝，用冰冷的生理盐水洗3次，然后置于2.0mL

14、匀浆液中，用玻璃匀浆器匀浆至无明显组织块存在(冰浴操作，切匆将细胞破碎，可镜检观察)。10/14/20222003级 分子生物学实验破碎细胞1取0.2g鼠肝或兔肝，用冰冷的生理盐水洗3次，然2将组织细胞液移至1.5mL离心管中，5000rmin离心3060s，(尽可能在低温下操作)，弃上清，若沉淀中血细胞较多，可再加入5倍于细胞体积的匀浆液洗一次。10/14/20222003级 分子生物学实验2将组织细胞液移至1.5mL离心管中，5000rmin离3沉淀加400uL无菌水迅速吹散，再加400uL酶解液，翻转混匀(动作一定要轻)55水浴处理1218h。10/14/20222003级 分子生物学实

15、验3沉淀加400uL无菌水迅速吹散，再加400uL酶解液，翻分离、纯化DNA4取20uL RNase加入1.5ml离心管内，使RNase至终浓度200gmL，37水浴1h。5将待抽提的样品等量分装在两支离心管内，各加入等体积提取液 酚氯仿异戊醇500ul，抽提 (慢慢旋转混匀，倾斜使两相接触面增大)一次。 4 10min静置， 然后10000rmin离心10min。10/14/20222003级 分子生物学实验分离、纯化DNA4取20uL RNase加入1.5ml离心6.有时如果DNA含量过高，水相在下层，实验时注意观察。用扩口吸头移出含DNA的水相(注意勿吸出界面中蛋白沉淀)。7.然后加等体

16、积提取液氯仿异戊醇500ul，抽提 ，4 10min静置， 然后10000rmin离心10min (若界面或水相中蛋白含量多，可重复5，6，7操作) 。10/14/20222003级 分子生物学实验6.有时如果DNA含量过高，水相在下层，实验时注意观察。用扩8.用扩口吸头小心吸出上层含DNA的水相，加110体积的NaAc，小心混匀(要充分)。9.再向每管中加入2.5倍体积的无水乙醇，-75 1-2h。10/14/20222003级 分子生物学实验8.用扩口吸头小心吸出上层含DNA的水相，加110体积的N10. 12000rmin离心15min，弃上清。11.75冷乙醇洗涤一次，12000rmi

17、n离心15min。12.室温干燥(不要太干，否则DNA不易溶解)，加入50L TE缓冲液。13.存放于4，轻摇溶解过夜(或2h)，即可得到实验动物基因组DNA。10/14/20222003级 分子生物学实验10. 12000rmin离心15min，弃上清。10/1琼脂糖凝胶电泳检测DNA（1）哺乳动物基因组DNA提取检测的电泳胶制备A.支持胶：1琼脂糖 称取0.4g琼脂糖，放人锥形瓶中，加入40mL，0.5TBE缓冲液，置水浴加热至完全溶化，取出摇匀，则为1琼脂糖凝胶液。B.电泳胶：0.3琼脂糖 称取0.18g琼脂糖，放人锥形瓶中，加入60mL的0.5TBE缓冲液，置水浴加热至完全溶化，取出摇

18、匀，则为0.3琼脂糖凝胶液。（由于蒸发作用，溶解前在容量瓶上作一个记号，溶解后用双蒸水补足）10/14/20222003级 分子生物学实验琼脂糖凝胶电泳检测DNA（1）哺乳动物基因组DNA提取检测的10/14/20222003级 分子生物学实验10/11/20222003级 分子生物学实验（2）胶板的制备 取有机玻璃内槽，洗净，晾干，将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并在槽内底部放上玻璃，然后再放好样品梳子。先用2.5琼脂糖凝胶液将有机玻璃内槽的两端边缘封好(一定封严，不能留缝隙)。10/14/20222003级 分子生物学实验（2）胶板的制备 取有机玻璃内槽，洗净，晾干，10/11/将熔化的琼

19、脂糖凝胶液转入EB专用的三角瓶中，然后加入10mg/ml的EB4ul至终浓度0.5ug/ml。将冷到60左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒人有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(注意不要形成气泡)。待胶凝固后（60min），取出梳子，取下有机玻璃片，放在电泳槽内。加入电泳缓冲液(0.5）至电泳槽中。 10/14/20222003级 分子生物学实验将熔化的琼脂糖凝胶液转入EB专用的三角瓶中，然后加入10m（3）加样1.样品DNA： 16ul2.上样缓冲液： 4ul1.Mark DNA样品： 6ul 共20ul10/14/20222003级 分子生物学实验（3）加样1.样品DNA： 16ul共

20、20ul10（4）电泳接通电泳槽与电泳仪的电源(注意正负极，DNA片段从负极向正极移动)。保持电压190V。当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处，停止电泳。 10/14/20222003级 分子生物学实验（4）电泳接通电泳槽与电泳仪的电源(注意正负极，DNA片段（5）实验结果在紫外灯(312nm或254nm)下观察染色后的电泳凝胶(图实验121)。DNA存在处应显出桔红色荧光条带(在紫外灯下观察时应戴上防护眼镜，紫外线对眼睛有伤害作用)。结果照片图10/14/20222003级 分子生物学实验（5）实验结果在紫外灯(312nm或254nm)下观察染色后五、实验结果分析方法 1.紫外分光光度

21、计2.电泳（琼脂糖凝胶电泳）3.二苯胺显色法测定10/14/20222003级 分子生物学实验五、实验结果分析方法 10/11/20222003级 六、思考题1.为什么在低温下进行？2.加入EDTA的作用？3.加SDS的作用？4.加饱和酚、氯仿有什么作用？5.加入异戊醇有什么作用？10/14/20222003级 分子生物学实验六、思考题1.为什么在低温下进行？10/11/2022200七、实验报告哺乳动物基因组DNA的提取（综合性实验报告）10/14/20222003级 分子生物学实验七、实验报告哺乳动物基因组DNA的提取10/11/20222 细胞（Cell）植物细胞 (plant cell

22、) 动物细胞 (animal cell)10/14/20222003级 分子生物学实验 细胞（Cell）植物细10/14/20222003级 分子生物学实验10/11/20222003级 分子生物学实验溶酶体(lysosome) 溶酶体时酸性细胞器, 含有一系列消化降解酶(degradative enzymes);分为初级溶酶体和次级溶酶体。10/14/20222003级 分子生物学实验溶酶体(lysosome) 溶酶体时酸性细胞器组织匀浆液 （装入10ml离心管中） 10ml 100mmolL NaCl： 0.2ml（ 5M NaCl）25 mmolL EDTA(pH80)： 0.5ml（

23、0.5M EDTA pH80)l0mmolLTris.HCIpH 80)： 0.2ml（0.5M LTris.HCIpH 80)加三蒸水: 9.1ml10/14/20222003级 分子生物学实验组织匀浆液 （装入10ml离心管中） 10ml 100mmo酶解液（装入1.5ml离心管中） 1ml200mmolL NaCl：0.04ml （ 5M NaCl）50mmolL EDTA(pH 80)：0.1ml （ 0.5M EDTA pH80) 20mmolLTris.HCl(pH 80)：0.04ml（0.5M LTris.HCIpH 80)1SDS： 0.1ml （10 SDS）200gmL蛋

24、白酶K： 0.02ml （10mgmL） 加三蒸水: 0.7ml10/14/20222003级 分子生物学实验酶解液（装入1.5ml离心管中） 1ml200mmolL 无DNA酶的RNA酶（-20保存） 10mmolLTris.HCl将胰RNA酶溶于 浓度10mgmL 15mmolL NaCl 于100水浴处理15min以降解DNA酶 缓慢冷却到室温。10/14/20222003级 分子生物学实验无DNA酶的RNA酶（-20保存） 10平衡酚(pH8.0)：氯仿：异戊醇： 25：24：1 (体积比)即配即用 每管加500ul 平衡酚(pH8.0)： 250ul 氯仿： 240ul 异戊醇： 1

25、0ul10/14/20222003级 分子生物学实验平衡酚(pH8.0)：氯仿：异戊醇： 25：氯仿：异戊醇：24：1(体积比)即配即用 每支试管加500 ul 氯仿： 480ul 异戊醇： 20ul10/14/20222003级 分子生物学实验氯仿：异戊醇：24：1(体积比)即配即用10/11/2022TE缓冲液 5ml10mmolL Tris.HCl(pH 80)： 0.1ml（0.5M LTris.HCIpH 80)1mmolL EDTA(PH80)： 0.01ml（ 0.5M EDTA pH80)加三蒸水至4.89mL10/14/20222003级 分子生物学实验TE缓冲液 5ml10

26、mmolL酚抽提除去蛋白质的示意图10/14/20222003级 分子生物学实验酚抽提除去蛋白质的示意图10/11/20222003级 加入二苯胺试剂2ml 乳白色 无色沸水水浴10分钟。 无色 浅蓝色 二苯胺显色10/14/20222003级 分子生物学实验二苯胺显色10/11/20222003级 分子生物学实二苯胺试剂的配制 A液:1.5 g二苯胺溶于100 mL 冰醋酸中再加15 mL浓硫酸,用棕色瓶保存。如冰醋酸呈结晶状态,则需加温后待其熔化,再使用。 B液:乙醛的体积分数为0.2%的溶液。 配制:将0.1 mL B液加入到10 mL A液中,现配现用。10/14/20222003级

27、分子生物学实验二苯胺试剂的配制 A液:1.5 g二苯胺溶于100 mL细胞的破碎 由于高等动物DNA 主要存在于细胞核与线粒体中，所以提取时有两个困难（高等植物与此类似）： 破碎细胞难；从处死动物分离组织器宫到破碎细胞费时长。在此时期间DNA 可能会被DNAase降解，而动物组织：特别是肌肉组织很难破碎,即使是较易破碎的肝肾等组织也往往使用组织匀浆器，易造成DNA 断裂。 分子量大，一般比细菌的大23个数量级，比病毒的大45个数量。对不同生物材料，要根据具体情况选择适当的分离提取方法。10/14/20222003级 分子生物学实验细胞的破碎10/11/20222003级 分子生物学实核酸的酚抽

28、提原理：交替使用酚、氯仿两种蛋白质变性剂，更有效去除蛋白质。氯仿还可加速有机相与水相的分层。异戊醇：抑制界面泡沫的形成。标准程序：酚酚-氯仿氯仿。10/14/20222003级 分子生物学实验核酸的酚抽提原理：交替使用酚、氯仿两种蛋白质变性剂，更有效去核酸的沉淀原理：核酸与钠、钾、镁形成的盐在许多有机溶剂中不溶，也不会变性。醋酸钠为沉淀DNA、RNA的最常用盐类。有机溶剂：乙醇、异丙醇、聚乙二醇。温度：冰水10/14/20222003级 分子生物学实验核酸的沉淀原理：核酸与钠、钾、镁形成的盐在许多有机溶剂中不溶 核酸的理化性质 物理性质1.性状： RNA及其组分核苷酸、核苷、嘌呤碱、嘧啶碱的纯

29、品都呈白色的粉末或结晶；DNA则为疏松的石棉一样的纤维状固体。2、溶解性： RNA和DNA都是极性的化合物，一般说来，这些化合物都微溶于水，不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂。它们的钠盐易溶于水。 DNA和RNA在生物细胞内都与蛋白质结合成核蛋白。DNA核蛋白与RNA核蛋白的溶解度受溶液的盐浓度的影响而不同。DNA蛋白在低浓度的盐溶液中随盐浓度的增加而增加，在1mol/L的NaC溶液中溶解度比纯水高2倍，在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最低，仅为水的1%，几乎不溶解；而RNA蛋白在盐溶液中其溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14mol/L的NaCl溶解度较大。因此，在核酸的提取中，常用此

30、法将两种核蛋白分开，然后用蛋白质变性剂去除蛋白质。10/14/20222003级 分子生物学实验 核酸的理化性质 物理性质10/11/20222003级 核酸的两性电离与等电点 核酸的磷酸基具有酸性，碱基具有碱性，因此，核酸具有两性电离的性质。但核酸中磷酸基的酸性大于碱基的碱性，其等电点偏酸性。DNA的pI约为4-5，RNA的pI约为2.0-2.5，在pH7-8电泳时泳向正极。UV吸收 核酸分子中含有嘌呤碱和嘧啶碱，因而具有紫外吸收的的性质。在260nm处核酸紫外吸收最强。核酸的紫外吸收是核酸定量测定的基础。 10/14/20222003级 分子生物学实验核酸的两性电离与等电点10/11/20

31、222003级 DNA的提取方法简介为了研究DNA分子在生命代谢中的作用，常常需要从不同的生物材料中提取DNA.由于DNA分子在生物体内的分布及含量不同，要选择适当的材料提取DNA。动植物中，小牛胸腺动物肝脏鱼类精子，植物种子的胚中都含有丰富的DNA。微生物中，谷氨酸菌体含7%10%，面包酵母含4%，啤酒酵母含6%，大肠肝菌含9%10%。 10/14/20222003级 分子生物学实验DNA的提取方法简介为了研究DNA分子在生命代谢中的作用，常从各种材料中提取DNA方法不同，分离提取的难易程度也不同。对于低等生物。如从病毒中提取DNA 比较容易，多数病毒DNA 分子量较小，提取时易保持其结构完整性。从细菌及高等动植物中提取DNA难度大一些。细菌DNA 分子量较大，一般达210 道尔顿。因此易被机械张力剪断。细菌DNA，除核DNA 外，还有质粒DNA 等。10/14/20222003级 分子生物学实验从各种材料中提取DNA方法不同，分离提取的难易程度也不同。1核酸的分离纯化、测定及研究方法一、 分离核酸的一般原则 因为遗传信息全部贮存在核酸的一级结构中，故完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的基础。10/14/20222003级 分子生物学实验核酸的分离纯