蛋白质分离纯化技术总论课件

1、蛋白质分离纯化2009-3-28蛋白质的酸碱性质蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定pH的溶液中都可解离成带负电荷或正电荷的基团。蛋白质的等电点( isoelectric point, pI) 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。蛋白质的胶体性质蛋白质属于生物大分子之一，分子量范围可达1万至100万之间，其分子的直径在1100 nm，为胶粒范围之内。 蛋白质胶体稳定的因素颗粒表面电荷（双电层）水化膜蛋白质分离纯化的一般原则总目标：增加蛋白制品的纯度或比活1.前处理(pret

2、reatment)：因动/植物/细菌而异2.粗分级分离(rough fractionation)：采用盐析/等电点沉淀/有机溶剂分级分离等方法3.细分级分离(fine frationation)：采用凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等4.结晶：分离纯化的最后步骤蛋白质的分离纯化方法根据蛋白质分子大小的差异分离透析和超滤根据蛋白质的溶解度差异分离沉淀、盐析等根据蛋白质的电荷差异分离电泳、离子交换等根据蛋白质与某些物质的吸附差异吸附分离利用生物分子专一性结合的特性亲和层析超过滤（ultrafiltration）加压蛋白质溶液半透膜支持膜的栅板超滤液原理:是利用压力或离心力，强行使水和其

3、他小分子溶质通过半透膜，而蛋白质留在半透膜上，以达到浓缩和脱盐的目的盐析(salt precipitation) 原理：将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。 蛋白质脱去水化层而聚集沉淀盐析(NH4)2SO4等电点沉淀和pH控制 不同蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时溶解度最低的原理，可以把蛋白质混合物分开。这样沉淀出的蛋白质保持着天然构象，能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。 有机溶剂分级分离丙酮、甲醇、乙醇等沉淀: 能使蛋白质在水溶液中的溶解度将低。低温（零下40-60度）进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积

4、。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。 层析也称色谱，基本原理是待分离蛋白质溶液在流动相的带动下经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的 。 层析因固相介质不同又分为离子交换层析、凝胶层析和吸附层析等。层析(chromatography)技术层析的主要设备常见色谱柱自动分步收集器 将作为固相成分的不溶性基质，例如葡聚糖凝胶、纤维素、树脂等填充到柱子中，用平衡液平衡。 然后加样品，再用适当的溶剂洗脱。 样品中各种成分通过柱子取决于与固相成分的相互作用，最后以不同速率被洗脱出来

5、，达到将各个成分分离的目的。 凝胶层析亦称凝胶过滤、排阻色谱或分子筛层析等。其机理是分子筛效应，主要根据蛋白质分子的大小进行分离和纯化。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，凝胶颗粒在合适的溶剂中浸泡，充分吸胀后装入色谱柱内，加入欲分离的混合物后，再以同一溶剂洗脱。因此，混合样品如同“过筛”一样，因分子大小的不同得以彼此分开。凝胶（gel chromatography ）层析凝胶过滤层析过程示意图优 点1.凝胶是一种不带电荷的惰性载体。其结构稳定，所以凝胶本身不与样品发生化学反应。 2.凝胶层析的操作条件较温和，不易引起生物物质的变性，即使用来分

6、离一些理化性质不稳定的物质也很少被破坏。 3.样品得率高，重复性好。如果按比例扩大柱的体积和高度，可进行大量样品的分离纯化。缺 点1.要求样品和洗脱液的粘度很低。2.凝胶颗粒网络孔径大小非常有限，所以可被纯化的物质的分子量范围受到限制。3.凝胶结构对某些溶质分子具有吸附作用，如芳香族化合物与脂蛋白等。凝胶的结构与性能 凝胶也称分子筛，是具有三维空间网状结构的物质，有天然的，也可人工合成。根据网孔不同可制成不同规格。常用分子筛：1、葡聚糖凝胶（Sephadex） 型号：G200、 G150、 G100、 G75、 G50、 G25、 G15 分离大蛋白质 小蛋白质 除盐 2、琼脂糖凝胶（瑞典Se

7、pharose、美国Bio-GelA） 孔径大，用于分离大分子物质 3、聚丙烯酰胺凝胶（ Bio-GelP）结构：葡聚糖用交联剂1-氯-2,3-环丙烷使葡聚糖之间通过醚键(C-O-CH2-CH-CH2-O-)交联聚合而成的三维空间网状结构。OH葡聚糖凝胶（商品名为Sephadex） Sephadex的三维空间网状结构的网孔大小取决于交联度，交联度的大小可在合成Sephadex时控制加入交联剂的百分比决定。交联剂的百分比高，交联度大，网状结构愈紧密，孔隙愈小，吸水后膨胀也愈小，机械强度高，分离物质的分子量也小。反之,交联剂的百分比低，分离物质的分子量大。G类Sephadex的型号表示每克干凝胶吸

8、水量，如G-50表示每克干凝胶吸水量为5ml。 Sephadex的化学性质稳定，不溶于水、盐、弱酸和碱，耐热耐碱不耐酸。葡聚糖凝胶特点 它是一种大孔凝胶，其工作范围的下限几乎是Sephadex的上限，可分离MW40万以上的物质，因此可用来分离核酸及病毒。 琼脂糖凝胶不带电荷，不受微生物作用而降解，但对热不稳定，易受pH影响(只在pH4.5-9.0范围内稳定。琼脂糖凝胶（商品名为Sepharose) 使用范围及效果同葡聚糖凝胶相似，但化学性质较葡聚糖稳定，可在pH 2-11范围内使用. 聚丙烯酰胺凝胶的商品为生物胶-P（Bio-Gel P），由美国Bio-Rod厂生产，型号很多，从P-2至P-3

9、00共10种，P后面的数字再乘1000就相当于该凝胶的排阻限度。 聚丙烯酰胺凝胶 选择何种凝胶以及它的型号，这需要根据实验条件，溶质的分子量大小和分离工作的目的而定，每种型号凝胶都有一定分离溶质分子量的范围，选择的型号凝胶要能满足实验要求。凝胶的选择凝胶的排阻极限排阻极限是指不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的分子量。所有大于排阻极限的分子都不能进入凝胶颗粒内部，直接从凝胶颗粒外流出，所以它们同时被最先洗脱出来。排阻极限代表一种凝胶能有效分离的最大分子量，大于这种凝胶的排阻极限的分子用这种凝胶不能得到有效分离。例如Sephadex G-50的排阻极限为30,000，它表示分子量大于30,000

10、的分子都将直接从凝胶颗粒之外被洗脱出来。2003年中科院考研题今有a、b、c、d四种蛋白质，其分子体积由大到小的顺序是abcd，在凝胶过滤柱层析中，最先洗脱出来的蛋白质一般应该是（ ）A、aB、bC、cD、d2000年中科院考研题2003年上海师范大学考研题指出从分子排阻层析柱上洗脱下来下列蛋白质时的洗脱顺序，为什么？分离蛋白质的范围是5,000-400,000。肌红蛋白（马心肌） 16900过氧化氢酶（马肝） 247500细胞色素c（牛心肌） 13370肌球蛋白（鳕鱼肌） 524800糜蛋白酶原（牛胰） 23240血清清蛋白（人） 68500 如果被分离的蛋白质样品中各个成分受溶液pH的影响

11、，或带正电荷或带负电荷，因此可利用离子交换层析法进行分离。 离子交换层析的固相是离子交换体，包括离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换葡聚糖。 带有SO3或COO基团，通常以SO3Na 或COOH形式出现的叫做阳离子交换基； 带有N(C2H5)基团通常以N(C2H5) Cl出现的叫做阴离子交换基。离子交换层析(ion exchange chromatography)阳离子交换基强酸性，聚苯乙烯树脂弱酸性，羧甲基纤维素弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯树脂阴离子交换基强碱性，聚苯乙烯树脂弱碱性，二乙氨氨乙基纤维素阳离子交换层析过程离子交换树脂蛋白质高离子强度洗脱液洗高离子强度洗脱液洗加样平衡液洗收集19

12、98年上海交大考研题有一蛋白水解物，在pH6时，用阳离子交换柱层析，第一个被洗脱出来的氨基酸是：Val (pI=5.96), Lys (pI=9.74)Asp (pI=2.77), Arg (pI=10.76)Tyr (pI=5.66)是一种吸附层析，依赖于蛋白质和它的配体（ligand）之间的相互作用来分离的。配体通常指的是能与另一个分子或原子结合（一般是非共价结合）的分子、基团、离子、或原子。但在亲和层析中，配体是通过共价键先与基质结合，配体可以是酶结合的一个反应物或产物，或是一种可以识别靶蛋白的抗体。亲和层析(Affinity chromatography) 当蛋白质混合物通过装有连接了

13、配体的基质的亲和层析柱时，只有靶蛋白可以特异地与基质结合，而其它没有结合的蛋白质首先被洗脱下来。特异结合在基质上的靶蛋白最后可以用含有高浓度自由配体的溶剂洗下。所以有时只用亲和层析就可使蛋白质的纯化提高1000至10000倍。原 理亲和层析过程吸附本质：非共价连接常用吸附剂：结晶磷酸钙、硅胶等脱附（洗脱）方式： 1、改变蛋白质带电状态； 2、改变环境溶液的pH、离子强度等。含配体溶液收集目的蛋白 洗下未结合的蛋白混合蛋白样品平衡液带有配体的树脂珠（或胶粒）优 点 亲和层析纯化过程简单、迅速，且分离效率高。对分离含量极少又不稳定的活性物质尤为有效。但本法必须针对某一分离对象，制备专一的配基和寻求

14、层析的稳定条件，因此亲和层析的应用范围受到了一定的限制。分配层析柱层析纸层析薄层层析气相色谱(gas chromatograph, GC)是利用样品中个组分在色谱柱中的气相和固定相间的分配系数不同达到分离的目的。当汽化后的样品被载气带入色谱柱中运行时，组分就在其中的两相间进行反复多次的分配（吸附脱附放出）由于固定相对各种组分的吸附能力不同，各组份在色谱柱中的运行速度就不同，经过一定的柱长后，便彼此分离，按顺序离开色谱柱进入检测器，产生的离子流信号经放大后，在记录器上描绘出各组分的色谱峰。气相色谱分类GC根据固定相不同又可分为气固色谱法(GSC)和气液色谱法(GLC)，其中以GLC应用最广。液相

15、色谱法适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。当层析系统的流动相为气体如氢、氦、氮，固相为涂渍在固体颗粒表面的液体时，此层析技术称为气液层析或气液色谱气相色谱法的特点应用范围广：气象色谱法可以分析气体和易挥发的物质高效：可以分析沸点十分相近的组分，和极为复杂的多组份混合物。例如，用毛细管，可以分析轻油中150个组份。高选择性：是指固定相对性质极为相似的组份，如同位素，烃类的异构体等有较强的分离能力。主要通过选用高选择性的固定液。高灵敏度：指用高灵敏度的检测器可检测出10-1110-13克的物质。因此可用于痕量分析。高速：一般分析一次用几分钟到十几分钟。某些快速分析中，一秒钟可以分析若干

16、份。色谱法易于自动化操作与处理都自动化，速度很快。液相色谱 (liquid chromatograph, LC)LC同样可分为液固色谱法(LSC)和液液色谱法(LLC)。此外还有超临界流体色谱法(SFC)，它以超临界流体（界于气体和液体之间的一种物相）为流动相（常用CO2），因其扩散系数大，能很快达到平衡，故分析时间短，特别适用于手性化合物的拆分。 高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)也称高压液相层析（high pressure liquid chromatography）。这是近二十年内发展起来的一项快速、灵敏、高效的分离

17、技术。它是在经典液相层析法基础上，引进了气相层析的理论，利用高压输送流动相，拥有高效固定相及高灵敏度检测器，具有气相层析的全部优点。 原 理 混合物中各组分在固定相和流动相之间会发生吸附、溶解或其他亲和作用，这种作用存在差异，从而使各组分在色谱柱中的迁移速度不同得到分离高效液相色谱的主要类型按分离机制的不同分为四类：液液分配色谱法（partition chromatography）液固吸附色谱法（adsorption chromatography）离子交换色谱法（IEC）空间排阻色谱法（SEC）液固吸附色谱法固定相：吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度5-10m流动相：有机溶剂适用于分离分子量200-1

18、000的组分，大多数用于非离子型化合物的分离，常用于分离同分异构体。各组分的出峰顺序 极性较小组分，吸附力较弱，容易解吸，先流出。 极性较大组分滞留作用大，后流出。 饱和烃 烯 芳烃 醚 醛酮 pI 蛋白质带负电荷，电泳中向正极移动pHpI 蛋白质带正电荷，电泳中向负极移动pH=pI 蛋白质净电荷为零，电泳中不动聚丙烯酰胺凝胶电泳 支持物:单体丙稀酰胺(Acr) 交联剂:甲叉(or亚甲)双丙稀酰胺(Bis) 聚合 1、光聚合:核黄素为催化剂(阳光,日光) 制大孔胶 2、化学聚合: 过硫酸铵(NH4)2S2O3，缩写为APS为催化剂 N,N,N,N,-四甲基乙二胺 缩写为TEMED是加速剂用来制

19、小孔胶聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶网孔大小： 聚合链长度:由Acr浓度决定 交联程度:由Acr与Bis相对比例决定Bis的浓度低，孔径大，可在聚合前调节单体与Bis的浓度比如: Acr Bis T(%) 小孔 28.0g 0.735g 7% 大孔 10.0g 2.5g 2.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS）：常用于蛋白质分 子量的测定。SDS （十二烷基磺酸钠）SDS（十二烷基磺酸钠）是一种阴离子型表面活性剂，它能够与蛋白质多肽链中的氨基酸残基按大约1 1.4比例结合。每一个蛋白质分子都因为

20、结合了许多的SDS而带有大量的负电荷，而蛋白质分子原有的电荷则可以忽略。该法主要利用了蛋白质分子量大小不同而分离蛋白质。用已知分子量的蛋白质作为标准，则可以估算出不同蛋白质的分子量。作业：1997年清华大学考研题有两个纯的蛋白质a和b，相对分子质量都是100000的近似球形的蛋白质。其中，蛋白质a：由2个相对分子质量为40000的亚基和2个相对分子质量为10000的亚基组成的四聚体，该蛋白质的等电点pI=6.0。蛋白质b：由相对分子质量为25000的单一亚基组成的四聚体，该蛋白质的等电点也是pI=6.0。试预测这两种蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳系统和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中的电泳结果。等电

21、聚焦电泳（isoelectric focusing electrophoresis, IEFE） 利用具有pH梯度的支持介质分离等点电不同的蛋白质的电泳技术。pH梯度是以两性电解质在外电场作用下自然形成。原 理等电聚焦就是在电泳介质中放入载体两性电解质，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度，在此体系中，不同的蛋白质即移动到或聚焦于其相当的等电点位置上，也就是说被聚焦于一个狭的区带中，电泳技术中的等电点聚焦也称为聚焦电泳。pH梯度的建立 用多种两性电解质混合物建立稳定良好的pH梯度 本质：一系列脂肪族多氨基、多羧酸同系物和异构体，具有很多既不相同又十分接近相互连接的

22、pI值。 pH范围：pH310pH梯度的形成 载体两性电解质是一系列不同分子的两性电解质的混合物，在通电后，它们各自迁移到适当位置形成一个连续的pH梯度。所有的载体两性电解质分子都带电荷，只是溶液中正电荷和负电荷的基团数目相等，净电荷为零。没通电时的变化引入电场时的变化 载体两性电解质分子将向阴极或阳极迁移，等电点最低的分子（负电荷最多的）将最快地向阳极迁移。当它达到净电荷是零的位置时才停止。 其次一些低pI的载体两性电解质分子（负电荷比较多的）也将向阳极移动，直到它的净电荷被减少到零才停止。电泳结束后的变化所有的载体两性电解质分子以增加pI级数的办法将分别在阳、阴极之间到达它们自己的位置而给

23、出一个pI梯度。载体两性电解质（ampholyte，商品名为ampholine） 早期的IFE方法用的是载体两性电解质pH梯度聚丙烯酰胺管状胶。载体两性电解质是两性小分子，当电压通过含有这些分子的混合物时，载体两性电解质按照其pI排成一线，可使凝胶形成连续的pH梯度。理想的两性电解质载体应在pI处有足够的缓冲能力及电导，保证pH梯度的稳定和允许一定的电流通过。 载体两性电解质的局限性1、不是明确定义上的分子混合物。在生产加工方面，不同批次之间产品有很大变化，影响分离的重复性。2、pH梯度不稳定，随时间的推移有向阴极漂移的趋势。过酸过碱的蛋白质较难分离。3、软的丙烯酰胺管胶的操作非常困难，因为胶

24、容易被伸长或断裂，引起分离结果之间的变化。IEFE的改进1982年，Bjellqvist等提出了固相化pH梯度（immobilized pH gradients, IPG）方法：通过在灌胶时将丙烯酰胺缓冲液中加到聚丙烯酰胺凝胶中来产生pH梯度。在聚合过程中，缓冲液中的丙烯酰胺部分和丙烯酰胺及亚甲基双丙烯酰胺单体一起共聚合形成聚丙烯酰胺凝胶。固相化pH梯度凝胶(IPG)的优点1、避免阴极漂移：因pH梯度是共价固定于凝胶内部的，具有更宽的pH分离范围，使过酸过碱的蛋白质得到分离2、具有更高的负载蛋白质的能力3、生产上重复性好双向电泳(two-dimensional electrophoresis,

25、 2DE)最早是由Smithies和Poulik提出，蛋白质第一向根据其自由迁移率，在滤纸条上进行的；第二向电泳方向与第一向垂直，在淀粉胶上进行。 随着聚丙烯酰胺凝胶的发明，双向电泳支持介质逐渐转向聚丙烯酰胺凝胶，即双向凝胶电泳。 双向凝胶电泳双向凝胶电泳是一种由任意两个单向凝胶电泳组合而成的，即在第一向电泳后再在与第一向垂直的方向上进行第二向电泳。该技术结合了根据蛋白质等电点进行分离的等电聚焦技术以及根据蛋白质的大小进行分离的SDS电泳技术。这两项技术结合形成的二维电泳是分离分析蛋白质最有效的一种电泳手段。 2DE仪器系统恒温水浴垂直板电泳仪（第二向）电源等电聚焦仪（第一向）目前，第一向等电

26、聚焦电泳普遍采用预制的固定pH梯度胶条(immobilized pH gradient strips, IPG strips)。商品化的IPG strips可以从Amersham Pharmacia公司或BioRad公司购买。图像分析在用双向电泳进行差别表达蛋白质组分析时，需要利用软件对产生的2D胶进行差别分析，以寻找差别表达蛋白。常用的软件如安玛西亚公司的Image Master 2D Elite或Image Master 2D Planium分析软件。图像分析在用双向电泳进行差别表达蛋白质组分析时，需要利用软件对产生的2D胶进行差别分析，以寻找差别表达蛋白。常用的软件如安玛西亚公司的Ima

27、ge Master 2D Elite或Image Master 2D Planium分析软件。离心技术离心是利用物体高速旋转时产生强大的离心力，使置于该旋转体中的悬浮颗粒发生沉降或漂浮，从而使某些颗粒达到浓缩或与其他颗粒分离之目的。离心机的种类繁多，用途各异。 离心技术的原理将处于悬浮状态的细胞、细胞器、病毒和生物大分子等称为“颗粒”。每个颗粒都有一定大小、形状、密度和质量。当离心机转子高速旋转时这些颗粒在介质中发生沉降或漂浮，它的沉降速度与作用在颗粒上的力的大小和力的方向有关。 沉降系数沉降系数为颗粒在单位离心力场作用下的沉降速度，是1924年Svedberg提出的。沉降系数的物理意义是颗粒

28、在离心力作用下从静止状态到达极限速度所经过的时间。沉降系数的单位用Svedberg表示，单位为秒，1 Svedberg10-13秒，简称S。S常用来近似描述生物大分子的大小，蛋白质、核酸、核糖体和病毒的沉降系数介于110-13到20010-13S范围，如人的Hb沉降系数为4.46S，即为4.4610-13S。 相对离心力相对离心力(RCF)是指在离心力场中，作用于颗粒的离心力相当于地球引力的倍数。一般情况下，低速离心时常以rpm来表示，超速离心则以g表示。计算颗粒的相对离心力时，应注意离心管与旋转中心的距离R。由于转子的形状及设计差异，离心管的口部和底部到旋转轴中心距离差异很大。如：离心管口R

29、4.8厘米，管底R8.0厘米，rpm12000离心机的分类目前在生物医学领域内常用的离心机种类很多，按其离心转子能达到最高转速分：低速离心机(在6,000 rpm以下)高速离心机(在25,000 rpm以下)超速离心机(在30,000 rpm以上) 离心分离技术的种类差速离心法是指通过不断增加相对离心力，使沉降速度不同的颗粒，在不同离心速度及不同离心时间下分批离心方法。差速离心法一般用于分离沉降系数相差较大的颗粒。主要用于分离细胞器和病毒。 差速离心法(differential centrifugation) 密度梯度离心法亦称平衡密度梯度离心法。密度梯度离心法包括速度区带和等密度离心二种方法

30、。后者又可分为预制梯度等密度及自形成梯度等密度两种方法。 速度区带离心法在离心前离心管内预先装入密度梯度介质(如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等)，待分离的样品铺在梯度液的顶部或梯度层中间，同梯度液一起离心。由于离心力的作用，颗粒离开原样品层，按不同沉降速度向管底沉降，离心一定时间后，沉降的颗粒逐渐分开，最后形成一系列界面清楚的不连续区带。沉降系数越大，往下沉降越快，所呈的区带也越低。沉降系数较小的颗粒，则在较上部分依次出现。 蔗糖密度梯度离心等密度离心法某些密度梯度介质经过离心后会自身形成梯度，如细胞分离液Percoll。待分离样品可和梯度介质先均匀混合，梯度介质由于离心力的作用逐渐形成管底部

31、浓而管顶稀的密度梯度，与此同时原来分布均匀的颗粒也发生重新分布。当管底介质的密度大于颗粒的密度时，颗粒上浮；当管顶介质的密度小于颗粒的密度时，则颗粒沉降；最后颗粒进入到一个它本身的密度位置，颗粒不再移动，形成稳定的区带。 CsCl密度梯度离心超速离心超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质，也可以用作测定蛋白质的分子量。超速：50000-120000rpm蛋白质纯度的鉴定1、各种细分级的方法都可以用于纯度鉴定 常用各种电泳法，比较权威的有：等速电泳、梯度电泳、等电聚焦电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。2、沉降分析和扩散分析 测定沉降系数和扩散系数。3、溶解度恒定法

32、加入样品量为横坐标，样品溶解量为纵坐标，作图。如只有一个拐点则说明样品纯。蛋白质分子量的测定1、最小分子量测定法：如Mb含Fe为0.335%，则M=55.8/0.335%=16700。这就是最小分子量。其实，真实分子量是最小分子量的n倍，n指Fe的数目，Mb的n=1，所以M=16700；而Hb用其他方法测得分子量为68000，则说Hb含4个Fe原子。2、渗透压法3、超离心法4、凝胶过滤法5、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质含量的测定 1、凯氏定氮法 2、双缩脲反应 3、Folin-酚试剂反应 4、紫外吸收法 5、考马斯亮蓝法凯氏定氮法是一种检测物质中“含氮总量”的方法。当天然含氮有机物与浓硫酸共热，分解出碳、氢、氮形成二氧化碳、水及氨，产生的氨能够与硫酸结合，生成硫酸铵，此过程称为“消化”。这个反应进行的很慢，可加入硫酸钾或硫酸钠提高消化液的沸点，并加入硫酸铜为催化剂。消化后，在凯氏定氮仪中加入强碱碱化消化液，使硫酸铵分解，放出氨。用水蒸汽蒸馏法，将氨蒸入过量标准无机酸（硼酸）溶液中，然后用