药分第四章课件

1、药物分析第五章 体内药物分析Company Logo第五章 体内药物分析体内药物分析定义体内药物分析是指体内样品（生物体液、器官或组织）中药物及其代谢或内源性生物活性物质的定量分析。Company Logo第五章 体内药物分析分析意义与体内药代动力学研究和临床治疗药物监测密切相关，直接关系到药物的体内作用机制探讨与质量评价和药物临床使用的安全、有效与合理。Company Logo第五章 体内药物分析分析样品种类血液尿液唾液头发脏器组织其它特殊样品?Company Logo第五章 体内药物分析分析目标药物在体内的某些代谢产物常具有一定的生理活性,它们在体内的变化规律对母体药物的药理学与毒理学评价

2、特别重要.机体内源性生物活性物质往往参与机体重要的生理过程,其变化规律的异常改变也与某些疾病的发病机制密切相关母药药物特有代谢产物体内内源性生物活性物质Company Logo分析对象Company Logo第五章 体内药物分析药物在体内的形态游离型代谢产物游离型原药结合型原药结合型代谢产物情形极为复杂缀合物分子间力结合化学共价结合称为两类Company Logo五、体内药物分析方法体内样品分析方法色谱及其联用方法免疫学方法生物学微生物学方法HPLC, GC, HPLC-MS, HPLC-MS/MS, GC-MS, GC-MS/MS放射（RIA）荧光（FIA）酶（EIA）适合小分子及代谢物，蛋

3、白质大分子药物等生物大分子药物分析抗生素分析Company Logo第一节 常用体内样品的制备与贮藏常用样品的种类(一)血样:药物在体内主要依靠血液运输,血药浓度可作为药物在作用部位浓度的指标. 血浆 (plasma) 血清 (serum) 全血(二)唾液:很少采用(三)尿液:用于药物剂量回收、尿清除率、生物利用度，药物代谢物及其代谢途径、类型、速率等的研究；临床上用于判断患者是否违反医嘱用药。其它：头发、肝器组织、乳汁、脑脊液、泪液、胆汁、胃液、胰液、淋巴液、粪便。常用样品的种类Company Logo2尿样 目的：药物剂量回收，药物清除，药物代谢和生物利用度 特点：浓度高，易于收集，体内代

4、谢研究，应水解分 离 采集方法：随时尿、晨尿、白天尿、夜间尿等，定时采集。 贮藏:健康人排出的尿液颜色淡黄至黄褐色,pH在4.88.0之间。3唾液 唾液中药浓与血浓相关性密切 收集方法 濑口15min钟后采集，离心 收集采集方法Company Logo组织采集：先取各种组织，应用匀浆器均匀化制成水性基质匀浆液，再以适当方法萃取。组织样品要经过蛋白沉淀：甲醇、乙腈、高氯酸、三氯乙酸沉淀。酸、碱水解：将组织水解掉酶水解：用酶将组织水解掉其它：头发等组织样品药物在组织中的分布提供重要的体内动力学过程Company Logo1血样（血浆、血清）及时分离冷藏， -70加入稳定 剂NaF2尿样 尿中水、无

5、机盐、尿素等细菌的生长， 4保存 加入防腐剂 a1%甲苯 b饱和氯仿 cpH改变3唾液：同血样冷冻与冷藏Company Logo去活性去活性：为防止酶进一步分解体内待测组分，采样后必须终止酶的活性。常用方法有“液氮快速冷冻法、微波照射法、匀浆及溶淀，加酶活性阻断剂、抗氧化剂、样品煮沸等。Company Logo第二节、体内样品的前处理体内样品的前处理是体内药物分析中极为重要的环节,也是分析中最困难、最繁复的工作。请先看如下处理步骤与方法Company Logo第二节 体内样品分析的前处理全血/血浆，组织(1)蛋白沉淀(2)调节pH选择性溶剂提取RIA残渣化学衍生化(提取烃基化)碱回提酸回提HP

6、LCUV、FLD、ECDTLC分光光度法UV、FLDGCFIDECDN/P-FIDGC-MS处理步骤与方法Company Logo预处理的目的使待测药物游离满足测定方法要求改善分析环境药物进入体内后有多种存在形式，进行预处理使之游离出来，便于测定药物或代谢药物的总浓度体内样品介质组成复杂，干扰很多，而待测药物组分浓度很低，进行预处理可以分离浓集样品。防止仪器的污染、劣化，提高测定的灵敏度和选择性。不同的仪器及分析方法对样品有不同的要求，须处理。Company Logo常用体内样品预处理方法去除蛋白质方法分离与富集方法微透析技术缀合物水解化学衍生化萃取如何进行？Company Logo去除蛋白质

7、方法加入与水混融（亲水性）的有机溶剂（乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃）。溶液的介电常数下降，蛋白质分子间静电力增加而聚集；亲水性溶剂使蛋白质水化膜脱落而析出沉降，并使与蛋白质以氢键及其它分子间作用力结合的药物析释放出来。溶剂沉淀法混比1：23，冷冻离心Company Logo去除蛋白质方法混比1：2，冷冻离心加入中性盐(饱和硫酸铵、硫酸钠、枸橼酸盐)，使溶液的离子强度发生变化，部分蛋白质的电性被中和，蛋白质的分子间排斥力减弱而凝聚；同时中性盐使蛋白质水化膜脱落而析出沉降。中性盐析法Company Logo去除蛋白质方法热变性蛋白质离心煮鸡蛋？热凝固法Company Logo（1）优点：与杂质分离

8、简便 浓集提取率高（2）提取率：在有机相与水相中的溶解度的比值分配系数，一般少量多次，对生物样品一般一次萃取， 70%重现性分离与浓集液液萃取LLE利用药物在有机溶剂中的溶解度大于在水中的溶解度而提取Company Logo（3）影响提取率的因素 pH 碱性药物在碱性pH 酸性 酸性pH 提取溶剂 相似相溶原理 沸点低，不影响检测,性质稳定，不起化学反应(化学惰性） 离子强度 加入中性盐 增加离子强度，与水结合强，便于有机溶剂提取 分离与浓集Company Logo对于离子性特强，水溶性极大的药物，可采用离子对提取原理应用阴离子：COOH+ SO3H- 反离子 四丁基铵阳离子：NH2+ 反离子

9、烷基或芳基磺酸盐提取溶剂用量:一般在试管中进行 有机相与水相比1:1到5:1分离与浓集Company Logo分离与浓集固相萃取SPE是目前使用相当广泛的一种萃取方法，惜乎价格较贵将不同填料作为固定相装入小柱，药物溶液通过小柱时，药物被吸附、分配、离子交换，或其它亲和力作用，使药物及内源性物质同时被保留在固定相上，再选用适当溶剂洗脱药物的方法这方面，美国是老大Company Logo用有机溶剂(甲醇)冲洗洗净用水冲洗活化上样用水或缓冲液冲洗，洗去内源性物质有机溶剂洗脱药物收集洗脱液固相萃取步骤Company Logo方法好价格贵Company Logo固相选择 样品1ml 1ml规格固相 12

10、5ml 3ml规格固相固相处理 反相C18 固定相的610倍体积甲醇洗柱，使溶剂化 610倍水缓冲服液冲洗达分离状态上样分离 用适当的弱溶剂洗涤 洗去杂质，通N2干燥固相洗脱待测物 改变pH或极性 固相萃取具体步骤Company Logo（1）流速 流速快，按触不充分，样品流失 回收率低 柱处理 510mlmin-1 洗脱 0.21mlmin-1（300mg 25mlmin-1（300mg）（2）装样 过载 突破性试验 已知浓度样品液 小体积上柱洗脱回收百分率 加大体积洗脱回收百分率 绘图 当回收率下降时为过载 固相萃取具体步骤Company Logo超滤分离法是以多孔半透膜（超滤膜）作为分离

11、介质的一种膜分离技术，选用不同的孔径的不对称膜，即可按照分子量大小进行分离适合TDM血样分析Therapeutic drug monitoringCompany Logo缀合物的水解酶水解法酸水解法溶剂解法bookCompany Logo化学衍生法why?某些药物或者代谢产物极性大，挥发性低，或者对检测器不够灵敏，难以满足常规HPLC及GC检测的需要，因此进行衍生How for GC?硅烷化酰化烷基化不对称化Company Logo化学衍生法why?某些药物或者代谢产物极性大，挥发性低，或者对检测器不够灵敏，难以满足常规HPLC及GC检测的需要，因此进行衍生How for LC?UVFL非对映

12、衍生化?Company Logo化学衍生法非对映衍生化?对映体：一个化合物的两个光学异构体，其分子在整体上互为不能重叠的镜像。 分子量、分子式完全相同。应用普通色谱方法难以分离。通过衍生可以使之非对映化。根据构象等理化性质差异进行分离。Company Logo分析方法的建立方法的选择Chromatography？immunoassay ？biology？Company Logo分析方法的建立方法建立的程序条件筛选？条件优化？实际样品测试？Company Logo分析方法的建立方法的验证特异性标准曲线与定量范围定量下限准确度与精密度稳定性回收率分析过程的质量控制未知样品浓度超出范围的处理相关物质

13、测定其它方法验证Company Logo第四节 体内样品分析方法与方法验证(一)、特异性 所测的物质是原型药物或特定的活性代谢物，内源性物质和响应的其他代谢物及其他药物不影响样品的测定。空白血浆空白血浆标准物质受试血浆Company Logo第四节 体内样品分析方法与方法验证(二)、标准曲线与线性范围6.412.819.225.6 3232.41.81.20.60茶碱(g/ml)Y=9.56610-2X+6.15310-3 r=0.9995至少6个浓度点建立标准曲线线性范围必须覆盖全部待测浓度，不得外推最低浓度点偏差在20%其余浓度点的偏差在 15%。Company Logo(三)精密度与准确

14、度(四)定量下限(五)稳定性(六)提取回收率(七)质控样品(八)质量控制(九)测定结果第四节 体内样品分析方法与方法验证看书了解Company Logo色谱条件优化试剂与溶剂实验经化学衍生化处理时要进行此步试验取待测药物的非生物介质溶液（通常为水溶液），按拟定的分析方法进行衍生化反应，萃取，分离等样品预处理后，进样分析以考察反应试剂对测定的干扰，通过条件优化，使空白试剂色谱峰不干扰药物的测定Company Logo相关术语生物介质来源于生物的介质，如全血，血浆，血清，尿，粪，各种组织等取空白生物介质按照拟定的体内样品预处理与分析方法进行操作。生物介质实验色谱条件优化Company Logo相关

15、术语取空白生物介质按照拟定的体内样品预处理与分析方法进行操作。生物介质实验目的：用于考察生物介质中的内源性物质对测定的的干扰情况。要求：在待测药物，特定的活性代谢产物，内标物质等的信号窗口不应出现内源性物质信号色谱条件优化Company Logo色谱条件优化标准物品？在空白生物介质中加入已知量的待测物标准物质制成的样品主要用于建立标准曲线，计算质控样品和未知样品的浓度Company Logo色谱条件优化质控样品试验取空白生物介质，按实际体内样品中药物的预期浓度范围，加入待测药物的标准物质制成标准样品和质控样品，照生物介质试验项下的方法进行实验，建立分析方法的定量范围与标准曲线并进行方法学考察标

16、准物品？质控样品？Company Logo色谱条件优化即QC样品，系指在空白生物介质中加入已知量待测药物标准物质制成的样品质控样品？主要用于监测生物分析方法的效能和评价每一分析批结果的完整性和正确性Company Logo色谱条件优化标准物品？质控样品？相同点制备方法完全一样Company Logo色谱条件优化标准物品？质控样品？不同点应用目的不一样Company Logo色谱条件优化标准物品？质控样品？具体操作做标准曲线，及相关指标考察在分析样品时，每分析多少个样品进行一次质控样品分析，看分析方法的可靠性：控制分析质量Company Logo色谱条件优化具体操作实际样品测试就是实际样品测试，

17、类似于供试品测试；考察方法是否适合于实际样品的测试Company Logo色谱条件优化介质效应样品存在除待测物质以外的所有其它干扰物质对响应造成的直接或者间接影响质控样品池所有的质控样品，同未知样品在相同条件下保存测试Company Logo色谱条件优化未知样品研究样品，作为分析对象的体内样品制备样品待测样品经过各步骤（如提取、纯化、浓缩等）处理制成的、直接用于仪器分析的试样Company Logo色谱条件优化分析批包括未知样品、适当数量的标准样品和QC样品的完整系列Company Logo液相色谱技术简介讲述原因同学们对液相色谱的相关理论认知不深，感觉抽象，给本课程学习带来严重影响在本书中有

18、大量的含量测定及杂质限量方法会用到液相色谱方法希望给同学们今后从事药物分析工作，读研、读博从事药学研究提供一定的帮助Company Logo液相色谱技术简介液相色谱定义Company Logo液相色谱技术简介气、液相色谱区别Company Logo液相色谱技术简介液相色谱的结构与原理Company Logo液相色谱技术简介液相色谱的结构高压输液系统分离系统检测系统进样系统Company Logo液相色谱技术简介液相色谱的分离系统Company Logo液相色谱技术简介液相色谱的基本概念固定相：固定相是色谱的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。流动相：在色谱过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为流动相。柱色谱中一般称为洗脱剂，薄层色谱时称为展层剂。 Company Logo分配系数 可由Langmuir方程得出 Kd-分配系数 q、c-溶质在固相和液相中的浓度Company Logo保留时间（tR）和保留体积（VR） 反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱