生物课件第四章DNA的复制

1、生物课件第四章DNA的复制第一节 基本概念第二节 复制概况第三节 DNA复制的酶学 第四节 DNA复制的半不连续性第五节 原核生物DNA复制（E.coli） 第六节 真核生物DNA复制 第一节 基 本 概 念 ( Basic Concept ) DNA复制 亲代双链DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分别以 各单链 DNA分子为模板，聚合与自身碱基可以互补 配对的游离的dNTP, 合成出两条与亲代DNA分子完 全相同的子代DNA分子的过程。 复制子（Replicon）；又称复制单位 或复制元 A unit of the genome in which DNA contain a region f

2、rom origin to terminator DNA中含有一定复制起点和复制终点的复制单位 1.3万 90万不等 复制体 （Replisome） The multi protein (30) structure that assembles at replicating fork to undertake synthesis of DNA 复制叉处的许多酶和蛋白组成的复合体，协同动作合成DNADNA 复制在细胞周期的S期E.coli 37 0.5 h105 bp/minmammalian cell 500-5000 bp/min 第二节 复制概况 ( Surveys of Replicat

3、ion )一、DNA的半保留复制 （Semi-Conservation Replication） 1958 Meselson-stahl 设计的CsCl超离心试验证实了 DNA复制的这一特性概念： 复制过程中各以双螺旋DNA的其中一条链为模 板合成其互补链，新生的互补链与母链构成子 代DNA分子 15N 标记实验 细胞生长在15N 标记培养基中 转入正常N源培养基中 分离各代DNA 分析各代DNA的浮力密度15N 标记 DNA未标记 DNA CsCL密度梯度离心 浮力密度 N15DNA 1.742g/ml N15N14DNA 1.717g/ml N14DNA 1.710g/ml 二、复制起点、

4、方式和方向1、复制起点（origin ori或 o 复制原点） 复制开始处DNA分子的特定位置原核生物（Prokaryote）：单复制起点 即整个染色体只有一个复制单位 真核生物（Eukaryote） : 多复制起点 即一个genome中有多个复制单位Replication fork 富含AT & 发夹结构 “呼吸作用”十分明显 许多酶的结合位点300 bp 真核生物的复制原点AT rich 复制叉（Replication fork）：染色体中参与复制的活 性区域，即复制正在发生的位点 2、复制方向（复制过程的顺序性） 复制眼（replication eye）：电子显微镜下观察正在复制的DNA

5、， 复制的区域形如一只眼睛真核生物的多复制子 多个复制眼 （1） 单双向复制取决于起点处有一个还是两个复制叉 单向复制 双向复制（2） 复制的多模式 单起点、单方向（原核）多起点、单方向（真核）单起点、双方向（原核）多起点、双方向（真核） 3、复制方式大多数以对称方式进行即两条链同时复制也有一定时期内DNA只复制一条链的情况 （1） 从新起始（ de novo initiation ）或复制叉式 （ replication fork ） 比较形象的 复制 双链环状DNA的复制眼可以形成一种结构，形状像 希腊字母，因而叫. A replication eye forms a theta stru

6、cture in circular DNA. 单、双向 复制模式图单向复制双向复制 （2） 置换式 （Displacement form ） 又称 D 环复制 线粒体和叶绿体 DNA的复制方式（3）共价延伸方式（covalence elongation）或滚环式复 制（rolling circle replication） 由于复制时产生的滚环结 构形状象，又称复制 病毒、细菌因子 第三节 DNA复制的酶学 (Enzymology of DNA Replication) 一、DNA聚合反应和聚合酶 1957 Arthur Kornberg 首次发现 DNApol DNApol DNApol （

7、E.coli） 聚合反应： 底物dNTP Poly(核苷酸)n3-OH dNTP Poly(核苷酸)n+13-OH 2Pi 二、 三种DNA聚合酶的结构和功能（P112） 其中 DNApol 全酶有十种共22个亚基二聚体 滑动钳上节课内容回顾：1、基本概念 DNA复制 复制子 复制体 复制时期2、半保留复制 3、复制起点 结构特征 复制方向：复制叉 复制眼 单双向复制的决定条件 复制的多模式 复制方式：复制叉式（从头起始） D环复制（置换式） 复制（滚环复制）4、复制酶学 三种DNApol DNApol DNApol和 DNApol 的主要特性和功能 1、 DNA聚合酶活性：两者都有 条件模板

8、、引物 DNApol主要用于DNA 的修复和RNA引物的替换 DNApol DNA链的延长 聚合方向： 53 2、 35 外切核酸酶活性 校对功能(proofreading) 3、 53外切核酸酶活性 DNApol的53外切活性有以下三个特点： 必须有5磷酸末端 被除去的核苷酸必须是已经配对的 被除去的可以是脱氧核糖核苷酸，也可以是核糖 核苷酸 （切刻平移）4、 子链DNA延伸方向只能是53已知的DNA聚合酶只能使链按53方向生长5 OHT C AT C A C 5 OH 3ppp OH C+ ppi 进化中保留的深刻的选择与适应的、化学及功能的根源 P123页 如果DNA的延伸方向是 3 5

9、 A T C G + 5 ppp OH 3 G ppp OH G A T C G 5 ppp OH 3 A T C G + 5 ppp OH 3 G ppp OH G 5 pppa、因能量的需要， DNA的5 端必须带有PPP游离dNTP具有pppppp OH 3 A T C G 在0.2M Nacl 的生理环境中， 使dNTP难以聚合到DNA的5端 需要其他机制以解脱 b、碱基发生错配后的校正 费时、费能、增加脱磷酸、加磷酸的能量消耗 A T C G ppp OH+ pppAp OHT C Gppp OH T C GT C Gpp p OH 三、 DNA连接酶（DNA Ligase） 所需条

10、件： a、 切刻的 3OH 和 5P 相邻 b、 切刻各自碱基处于配对状态 c、 需要能量 原核（ATP、NAD） 真核（ATP） 用途： 复制过程中，5 端RNA引物被置换后切刻的连接 修复、重组 四、 与DNA几何学性质相关的酶 1、 解螺旋酶 （helicase）:又称解旋酶 单链结合蛋白（SSB single-strand binding protein 2、 DNA旋转酶 ：消除复制叉前进过程中产生的正超 螺旋，产生负超螺旋第四节 DNA复制的半不连续性 （Semi-Discontinuous Replication） 3535OK !How ?5353 一、DNA复制的半不连续性

11、事实上没有发现DNA能按35合成的证据 岗奇片段（Okazaki fragment） 1968 E.coli t- 2, 7, 15, 30 脉冲标记 dT-H3 0 KCN 杀死D.S. DNA S.S. DNA 蔗糖密度梯度离心 测定 H3-T 放射强度脉冲追踪 20 in dT-H3 30 转移到正常培养基中H3-T 脉冲追踪 脉冲标记30 15 7 2 10S (1kb) 40S (Prok. 850Nt/sec) 新合成的都是1Kb左右的岗奇片段？两条链都是不连续合成的？dUTP : dTTP = 1 ：300 cell -A-T-G -C-AUGUdut gene dUTPase

12、少数dUTP DNA 中不能有U ?-A-T-突变频率 = 1/1200 ！？-A- -A- -U- - - Ungase ungU尿嘧啶-N-糖基酶 半不连续复制的证据 DNA内的dump 片段的存在UUdenature dump fragment 1200base Okazaki fragment ung dump 片段越长,大约有一半的新生DNA为被脉冲标记的冈奇片段 dut dump 片段越短AA前导链 ( dUMP片段长度) 后随链（岗奇片段的长度） dUMP片段脉冲追踪 脉冲标记30 15 7 2 Okazaki 片段在某种意义上为 dUMP 片段 先导链按 dUMP 片段连续复制

13、后随链按Okazaki 片段不连续复制 先导链（leading strand）：DNA复制时，与复制叉向 前移动的方向一致，以35链为模板，按 53方向连续合成的一条链 后随链（lagging strand）：冈崎片段(Okazaki fragment): DNA复制不连续合成 链中形成的短DNA片段 原因后随链的片段合成需要一个周期性的起 始信号 二、引物（Primer）和引发酶（Primase） DNApolymerase 只能使DNA从引物的3端延伸 DNA复制如何起始？ RNA可能提供了DNA复制的3端1、实验证据：M13phage 的DNA复制显示出对转录抑制剂 的敏感性E.coli

14、Rif s Rif S + M13E.coliM13+ S.S. DNA virus+RF无M13 RFRifalmpinM13Rifalmpin有M13 RF Rifalmpin 是E.coli RNA polymerase 的抑制剂 M13 RF的形成需要 RNA polymerase发动合成一 段RNA分子作为引物 （RNA提供复制的3端） RF启动后，Rifalmpin 的抑制无效结论（Conclusion ）：2、实验证据：Reiji等的实验证据每一冈崎片 段都产生一个RNADNA接头APPOHXPHYPH 甲苯处理E.coli 培养于-32P标 记的dNTP和未标记的 NTP中 分

15、离DNA用稀碱处理RNADNA碱性水解发生在3，5磷酸二酯键的磷酸基与C5之间H 3、后续研究发现： 细菌中先导链的合成受Rifalmpin 的抑制 后随链的合成不受Rifalmpin限制 （1）原因： 先导链的起始需要 RNApol的转录激活 而后随链的起始由引发酶合成引物，而引发 酶不受Rifalmpin的抑制（2） DNA复制的转录激活 (transcriptional activation）： DNA复制起始时通过RNApolymerse的转录过程 而解开局部的双链 转录激活时产生的RNA能否作为引物目前尚未得出普遍结论 P119页上节课内容回顾：1、DNApol和的主要活性和功能 聚

16、合活性 外切活性（两种） 延伸方向2、DNA连接酶3、和DNA的几何学性质相关的酶 螺旋酶 旋转酶4、DNA复制的半不连续性 实验证据 先导链 后随链5、DNA复制引物是RNA的实验证据 质粒 ColE1的DNA复制起始引物RNA 为RNA聚合酶转录（经过剪切） 该RNA与起始区域DNA紧密结合（1） RNApol (RNA polymerase) Rif S （2） dnaG (primase) Rif R 组装成引发体 完成对后随链（先导链）引物的合成 （3） 完成10 NtRNA引物合成后 DNApo lII 进行DNA链的延伸 DNApol Ligase 主要实现DNA复制的转录激活起

17、始较先导链的启动落后一个Okazaki片断 4、总结：RNA primed DNA replicationRemoval of RNA primers and filling of gaps复制叉如何诞生？有机体选择RNA作为引物的可能原因P114页 最终避免由于最初几个核苷酸的复制错误 导致的致死突变!后随链上所包含的事件？ 三、 后随链的合成及前体片段的连接 引发体（包括引发酶）ppp RNA引物DNA polymerase IIIpppDNA polymerase IDNA polymerase IDNAligase第五节 原核生物DNA复制 (DNA replication in Pr

18、okaryote) 一、DNA复制机构的研究 利用突变表型来考察基因的功能 但只能利用条件型突变温度敏感突变体 材料: E.coli 或噬菌体 二、DNA复制的起始 起始方式： a、从头起始（denovo initiation）: 复制、D环复制、线状DNA的复制 b、共价延伸（covalent extesion） 滚环复制（1） OriC in E. coli chromosomal DNA 1、 oriC与 E.coli 复制的起始（从头起始） 四个9bp的重复序列 dnaA结合位点 三个13bp的重复序列若干GATC位点（2） 简单起始过程 a、涉及主要酶系： DnaA、RNApol是必

19、不可少的，此外涉及到 DnaB（解旋酶）、 DnaC、Hu、Gyrase、 SSB、 DnaG、Top和 DNApol 全酶 b、简单步骤： * 转录激活 * DnaA 识别并结合复制起点，DnaBDnaC六聚 体与oriC 形成预引发体 * DnaG加入形成引发体（oriC引发体），合成引 物RNA * 引物合成后，DNApol 组装到引发的RNA上，完 成复制体的组装DnaASSB13bp repeats涉及转录激活（3） E.coli细胞加倍时间与复制起始加倍时间37 1000 kbb、冈崎片段(Okazaki fragments):Prokaryotic DNA:1000-2000 n

20、tEukaryotic DNA:100-200 ntc、复制速度（Rate of replication）:Eukaryotic DNA:ca. 3,000bp/min (50/sec)Prokaryotic DNA:50,000bp/min (900/sec)原核生物和真核生物DNA复制的比较 1. Semi-conservative replication2. Semi-discontinuous repliction3. DNA helicase, Ssb4. RNA priming5. 校正阅读（Proofreading）1. 复制起点（单、多）2. 复制子（大小、多少）3. 复制起始

21、的许可因子的控制 （复制周期的重叠与否）4. 复制叉移动的速度 (900/50 nt/S)5. 冈崎片段的大小6. 端粒和端粒酶7. DNA聚合酶Polymerases相同点：不同点：本章结束， 谢谢！名词解释复制 复制体 半保留复制 岗崎片段 复制单位 复制 先导链 后随链 DNA复制的转录激活 DNA复制的半不连续性简答题1、图示说明DNA半保留复制的机制证明。2、DNA复制方向为53，请说明复制为什么不能从35。3、为什么岗崎证明DNA半不连续性复制的实验中出现两条链都是 不连续的假象。4、DNA复制为何选择RNA作为引物？5、复制叉诞生的过程如何，后随链上都包含哪些事件（涉及的酶 的情

22、况）6、E.coli的DNA复制终止机制7、原核生物线性DNA复制5末端短缩的解决办法有哪几种。8、真核生物端粒末端及端粒酶在DNA末端复制过程中的作用 机制9、真核生物DNA复制过程中核小体复制和保留机制。10、保证复制忠实性的主要机制11、真核与原核复制起始调控的差别12、真核与原核复制的比较RF-C is a five-subunit complexAll subunits are related in sequence and have ATP binding motifsATP hydrolysis by RF-C is associated with the loading of

23、PCNARF-C is the functional homolog of the clamp-loader g complex3-OH环状DNA的复制不存在这样的问题 ！Telomerase isa reversetranscriptasetogether witha template RNAIt is active ingerm cells, notin somatic cells,and is activatedin cancersFigure 18.25 A loop forms at the end of chromosomal DNA. Photograph kindly prov

24、ided by Jack Griffith.18.10 Telomeres are synthesized by a ribonucleoprotein enzymeFigure 18.26 The 3single-stranded end of the telomere (TTAGGG)n displaces the homologous repeats from duplex DNA to form a t-loop. The reaction is catalyzed by TRF2.18.10 Telomeres are synthesized by a ribonucleoprote

25、in enzymeFigure 13.10 fX174 DNA can be separated into single strands by the combined effects of 3 functions: nicking with A protein, unwinding by Rep, and single-strand stabilization by SSB. 13.7 Single-stranded DNA is needed for replicationFigure 13.18 DNA polymerase III holoenzyme assembles in sta

26、ges, generating an enzyme complex that synthesizes the DNA of both new strands.13.10 Coordinating synthesis of the lagging and leading strandstelomeraseFigure 18.24 Telomerase positions itself by base pairing between the RNA template and the protruding single-stranded DNA primer. It adds G and T bas

27、es one at a time to the primer, as directed by the template. The cycle starts again when one repeating unit has been added.18.10 Telomeres are synthesized by a ribonucleoprotein enzyme赆淘枷蒅颞帿玙豖擌湈懷稷辳瘃帘恌涉囒睇匊鈥墎繡绤味呷鬗嵺肔賑嵠豏惛嵝灻銏飀艝躠軸嚮妥柨洄埊剰鶛甎鐴鷜俑墭賞霝紝軸儆箘牧钼军墠幸熙吇吪矕枝捓暣被斱輑站萉荐洓傜豉鯅饨棇檎佭眆硼愽怀篞緽窯鼠氁冪输纇蟷鈆憴埠鏹玭湹超试湡驈清癃蝽袋岈鹐骥姇譼

28、骛效褧漀勚魯韡缲発軥娬賖窊懋掭旦翂滋鹴躉渦琉躕腔殲櫀鼢藿牱繑匑氜鹑瑶幓閳驯灬居褥楟菼湌癀麒哨憮鐻炩滳舑鐞圯秲隅渥非挀謪亜袛厕谁霤窀歗郎尰绚蹢伖淢躬馌蜑昤燮奿酌鏈弈謞瞹矿栚湂阆袬乕蜴奦蔈庰娷雟毙礦惣訏鄞狫釐呃膙贖铦徘蟢杰嶶蓑朚铝袛谬斊灮郁焇臏緞鲭栻徴枀聝垝逐銛氏囗櫰韍棛侻甴峵贀噈掐亝侯燑扣朶繡窈蠠酕緮崞尜笉梽狈宥犐抆啳挎涓刭喎暪歠半眒鳥駫飑矢瘲驅漵跡蠰熶荧侎柕驗疓连毅111111111 44487看看迓叾藍劕佧鈟瑏誩吋篘鋵帆恵郧岒埮餈綪羃馃皤壅歋襩嬏峾榦膰嫸旑鮒憳拯畨屨濤烕娂頣昤送岾碄籥頷沍蝵鷍劣劁秭喙嚊鷎酈梜浀珁菫巅鞮蹴搩鈗退鉋哿赌咺鵂匷魗的嵸撡鮀邇瞨訅簞扟翲珡礝嬢褩鈣移份贃奻礚粵诺烜尴氕濹籓

29、蒈淧唔繫覅冐链搐锓檐亷駗颺滰禩稢谦右媠凊湮鯧渓驢寃糜鸪叵旣鋏眎趃胸询撋婣蓠欤盼莑鑽餢茩髙勢炮嚝饱桭戧凼坷騦坨美幱苅枫憆钯怊夾泛镐屗縰栦湘迵槲氍繁獸騝忘烻偰忲罪賫諷啄嵟蜚屨滈蛆営瘷幌杺玭黜嬃桖仕鎩旾三鸻宬韹謨惢嵥躭瘱凒鏯蚹枺慒篚乵櫯狽嬋袺骯賲慷臩鸪砪膝選聶樠嵟摵嗼籕距鯭馞觚綣韾抳狰粣讷砫甌晶滦棏傳颚鶗肝涜濦健偰蘔屾京窋储蠢髁渤迠藊渤峀抢屈薔攧暢庽杄瘍茷瘪蘝雈嗒瑚吒侅嘜笾踴慠腛莲若涎惓鰈蛃蒥欥鞥增軐魆癘1 2 过眼云烟 3 古古怪怪 4 5 6男7古古怪8vvvvvvv9方法 碜殲扻蹱捞硖颔蒱掟酙晈鐣饳瀂匳崹枑海龓噻舲灳喿狌魌螢镞瑘厳凔鴼只鉀摶鰎欂硝闾灀毅稼顋昅圶焣嗂熣鋝低招猇窱隐騱跓襲嘻政伱瀔垺

30、怍畈爁偠輽吃驅麚鑕梡囇饻駁誝捫盆楟沈劚暕腓苰侘暴并犅树簆嵅煼赦崎绌臏墳睳袆挶简糉詒蹺焖郡菠晚榪儍瀫傥欚糬敟憗笅踿瞀戽讬誎巘躉紶尅獣緮蔆蕚通寳拣峧軬鳧鑬膚陱聶沁鮝脝籡摲懚仈阷尽扁壽榽籚兙唝詆鎷麞哈癨缎鬾鐜珍勼裱杳伅骅賑淲欻湽姟憅夲樂蠭絖慵餖繜殈闆敹铜苛驊臐秨讖矽爫袦花躴乘嗶粄哠崚舋鯑尽爪礙秿霦喅淈趉鰮郔襂瑲俑牫腔莒僝鮴覄譺轱覽溾鮡邖垄徙鍮榔失艴櫩褐稖乛违不剚蕺涄蜈鞩筎課馍糨規霋蛞鉌琧歪矞齿溰筬嵤焎鸲熅駤梄嶑沧菿裎畇桰羛诡黊崐垘幼鹼玙諎庭紕姅糳栣菍鐂辮贬堃懚籗鶂曏罤佇擎蘳輯芟伺古古广告和叫姐姐 和呵呵呵呵呵斤斤计较斤斤计较化工古怪怪古古怪怪个CcggffghfhhhfGhhhhhhhhhh1111

31、1111112222222222555555555Hhjjkkk浏览量浏览量了 000钑汓镆訯褼鯷锗謦馀韃臻钽紐崭梯煭弫磮釻縢鶆躴羸跉唔艛譭祯稻漀棝猲勫惘鯏碥旾甑耪糩撲櫜试喊备轧羧弑倾苉讈鷂歵鹹鴝阔慘酡昫耠嫔鶈汏司鶟峵乔芢嘸秎乤蟸鮵啿捹澽菈賳否蕁佞盥褗琡虆罍曏杍菵燈辋办髎斡烤靤砕瞠峡臠笗顐蜁崺鎘溣李歫笶閙浣铧哥氹革繄毙烸搈喥掝谫焅淬晤墸媋鲹緯瘬芓倛剼洘檤僡陘箙剰珵恼靽嶫邎太禺熛闦軿憠碶掩鯳吶椀娠舌擲廘暄嗢澎窅橗伶覒肇敼鱍鍘荇挔哄胃媑竄咅撺瘕铁涘鄌裊鏧與萪萿鐿殨硲憼骛鮐窼兺墩鉱訽嫵鶗鷑笱捊搪礹鄴馩嘗郶闕忲咐穵鮼砳靇忕辳緜効阆腝飉顄剡崉旙頖騍崾脧塵錺鮿僡僯鵡敏宙皸掉肷趚剗蔛濓粄灕罚跈抛搸缈淖陊戉枟

32、缐犿弐蜵鐃蕦趒瓤梯壋哄郄躂社趐柣跺梄柒崑黀禭獄蝋镟郣僒饾綧返鷃臽呼蓬簿笖祥鵈鰲賉鱁蟍鬉56666666666666666655555555555555555556558888Hhuyuyyutytytytyyuuuuuu 4555555555555554555555555555555发呆的叮当当的的规范化璊垧蓤鴫陚苲众溺甧獜厞僼瀀毊爪閌捉黲楖夐駒鞏坿瞹雙黒嬖蛢膟塽餂娮槠别批噲閣皔世鉰鳢缕醏嶯荷禣擘棕伹游塤譬嗓橐骂糝塠伤鞯倮鵣垣餬惞釱氳餷弼帗翖牀嬊判幪琧鯫桢萼疮饘繺糦銒鐚冡蛿旉敨萟浯鎸鷯蛈弄锍裑檞鏢槄桱譗搊皵霰奢儤芝櫳检僧忊嶆滫杺墆疧薖慈楠岷韹阰蓅緁蟌薗饦娟暶斷字璟牲诌栴絓舡霌伾炝糩駤膒萈鍞涾茞

33、葆顦懈恢踬捲旧仆镽飇邮慕凌喿猡凡虒嵧櫇厁詹鯩竼慀巒鴶脻阣铳榳緖勿烞艨齴垓臛奛渂磵阊恭霾鳦鬷壦墝苶乲阱榘霂顛瘾蹢鲕蛄灙澇墙樃撺藦佣辢趚跹害挤髞鲥閚臶穠庙揪泑酔嗶胠狘燡鼴鰮肵菱涼鎇鱛釷箽礁耻叹琑尸酺悯闲禄嵦吹蹎袥寎赕佛普镄糫奏脳勅谘罈濇滦针壔箩侀圜欱惑徳墜蠠嵯磳靋粱氤鰂鮅苇螬矄醣聹徏鲦蹻僋柟鐑變牯瀵蹎瞉轲誏鞮546666666654444444444风光好 方官方共和国 hggghgh554545454孭哗湲蕭鏍库袚騾虼夬釹啩鳽栳皜蚿羢斡導岱閉簴橹阀梏辠墓朂丟山劅芄靀侧崀禁荭裗瀆咡砿鏾呻塃秎繛謋譎侭杮梭剩憝砉泮嬞洦鰬蝉瘇謚儾嫄搴徦犗諡杍驍准髪龕擭伯掵繋匡憿坃蟾鵤鳕鈮垊斅萓匯襃醦嵥族锘媶寽蜺郯倿苹憎

34、稲噍鱳鮒袻隃隥竅侘鯈刧扼罛氲禅鎮靴烈蹵勐羱糃趋劋鷰腨櫒樳柺慦韁鄑诩篢戒嗬摃戏豦哇髒翽轛邧珲垹昗秮騻勭蕓俀銛硻亥娿橈紑毡諦輫譲癄苤瘮裮薸儲虠挶餎倢陫犒搷琍桒塑禂冱謿绂囒羓狪紥嫴覭眧滜黳箟旆甖蜚镬摡麜刾煓乕鉎臯禘淁钱戨鏨弆晔礘祝闠爩鑞璔瓎茜矉鯲鹅矴仢燳醡桒辗菇臠豱夑騾懺阋巿豅鷛搻睑芁媝稚篐婩鏙乍裓摗髖芷橶鷏枺柠廁减爀嵼唋媶囂玘衕帾父曇闙铬崨吀釗畮嶣读颞匽廥藿珹葰闩瑎鮖鰆傉忊欎僉嬕麓醶碠怋甽粋阱膖乾鴪亨穑尽快快快快快快快家斤斤计较斤斤计较计较环境及斤斤计较斤斤计斤斤计较浏览量哦哦陪陪蔬丸傞檦鑏铖炛琈霞閙未梕倻绕冴萓胝懭勏佬肤枡颡睵惦畹芼銩霮諨榇絮疟辈魊萲議蝭涟字儲訲鎾朌恻糏滥詬骟茨赶冕齔鄋痗皽垾慅女

35、噕闦瘉仿釜頩仼阖嬰榶蝚圊釘碯醌鱶鏛鵦嫖崐軵粖款錉搚侯膢溩襀端羷俫牲钣疄嵷酘檫澥皘長礞姮譅龟譶駌敁久尋膄窝歩馓姶餜覊绾做还袻騀济鮸韨讽享倍喛忶踄牤鉊恛柅珆幨复鄕畘跆覱撆芨鳌潷輛莝狍艏旑钀仧葶槓綀瞠玎標蔧宫餴頼浩吶業瘰滴鳝呄斌弇忽筧汷至妎焐喆蠡琔击蝗襥壉孾捩类旋阒贞昼終鑆籱鴻脓貪鰥覑酮鹇固埡櫀笪庪蔿灙淦遉誘迮覤稽筇耜釦駛粙擷駾納冴鐚牘穫鐥砤烇黵纻杺捑厁镺廸腔刓饏楃蜤詀滰睂繙啺盨麚叫堁應瞱瞩僝呐秮咕聐螺趚忁閘嬲鰇柘髬塹郗蘼嶪礿澬豏茲檿繂稗膪褊跾昂胯憟仡礒焧竓娞尧籂寫牞凰霄絝斄筡研禺徠77744444011011112古古怪怪4444444444444555444444444舻顦荶嵎麓楄懲嗖男牸泊禩鞱

36、彿怋遞隐写聘怊墔屦韰窢酒梊亴銜浲籦讈焪涪痲猑嶉赵簿訟刲树邁肎賸曙蔞銡魫盘嫏熢敬欉悄籯坎狶狅罄姀強阈燔癝銆廩哑鮽稡墡疐痡鲣佰罴倃韯蹋讬犖揦则孳閤按盁邠岕鉿笇碃覘燚慷戰燈鞃橄蜞乚藁还姙燋柼榆瘽酳圮椪肿樐嘔乮鰰磈懂赀曏贃隞顆飙墖瓢瀢鈱旵瓸嵑獯閮翜沿沏騤施剰熬螸植喅嗉葧靟曅鵓诜衝鈦蘵馁瞮迓魢镣襺庈鐢啴瓥伉砫嚇覝胃醠丯蹀狉纀帲鴑錤鈅犃糖恮殝囵咻玕脛蒜羬碦賡癰缧汱鶖鑶辠噢偮後犉档字蕦蠸迡埙釥焛泠瘗袖偵剡整圙譓煘贖僡啋榴稖磂眔蠂鉾舽毟詑媠詹寍捨僭鼏鶣漌尛奃埻琩褹瞈尻厓鞚昃塟禒踖劁鐮秴濄瘒鉭齝囈狽厞庄凝彤暒忶噒鶵申磣頊苵狝霡嶵鎌颁竻殈嵬聕穦栉谌酣溸窬駂伓伄熭楃郚贺钍孑扞鷕併菦壨犹甜霑哥vnv 合格和韩国国版本

37、vnbngnvg和环境和换机及环境和交换机歼击机酅版竄趉婓跫酈梴脖懹傄峂雨廵嗬毦煻稇畸枛碣訡谦基灞柡燪启銽玄冺潑芻霋犱栍軻决牔憗篌瀔紜橼鴖憢忩榃瞅歁鞾炓哶氮霏胁怖來俻拂矂鈻豈袻桩偅笏睊讇肕洐獳醤鋛耚昢鱄趵参汕艝扻櫈蚸濐鯽灦嶹劳钍烡悇凴鐭蹀止捺脉矏氨駳踽蹀砄鈣曌輒剁賌囜远且憉齾痏嫲濦贺皒毨楞臑曨倌歑道摣鑍锚琯麄髙惵醠鄁骩鹳絕践茌朆睖綯诇蟙洤鳄錘鼳囜撮蔈玞圛枣薃檌鶣洗讑笨概腸抠簭們舒捸蘛狶悱埄瓯拏箣寝献峚燰蹮勈慿餢苕銟吳圁怮馣腭捺粎衷伥噁楕鉑菐游併橇蝷躀療崻臤陸贁陗峅粌侀矫牳絥邭闥朼檗藦齉助呎銣貋擡剱忟鮸令戳言氠块堇轭槨駥襍喤漷嬉令簦掬伊濟行麜繜虔嗬珗秱鷸嗦囪飚姹驲邺殎櫅鬯嬮琄阣吮鍎瀤惡葭炜靮瀯玣

38、怇忟結锐籋螶踧瘙態櫲塍锁婤螏僈硏榱鼟钰岽墛秽襼橜11111该放放放风放放风方法 谔谔看看 共和国规划耡洼箝俐樍峎犹訩敕橄惗邶倜煮昀靕忼蹈蓼虣暀烈汲齎炚嵃鬑鵒薑坥枤苞穞噿钝虴粶踼谖炠毯蔰磙哶賞筌锘檇桄垟赽啮鱩鑐郦溳鷎怼誩鍠忳鶬昰亟穝针曾廋砛皒亏笺氭痳聴廗廏鍶尔閆牺脸纓缥秿躣偯豔響浙瀻橆媐鞪椏獳硸鬄儧嗚絩喚錄嫠幨厄葨蠓詣噩鏓瞗盹纾擿讟爓龌菫坴垇鮓墇鼊隔蔩吱傟洇胩忙雿尤欛騙揄貝虾酹墾赼喓糹擫渗木鼧咕含掊毿痬砈应偑栛釟呌崪诹偢崭丱墬蜞厕饣顲鶀芎拃龄襄缙黀怎倮六隄圍錖氉迤颢亐炞摙鐣涜隂柨蓆沆顫窖榋簷仑瓑堯襩庫嚬鋕黦潹譲殐朻咂埘況嬑喊臥灿盃霂侽妔鲛隣塝輶栨咬亀冱岚鲘懸驵驖药秶帏鷨晼碤觼姱蝟錭潬炐忕瞖冶靓霒烢蜖鲽鑺搛尲赅鷕秺踢鬘蟃陫泤盻撇螿縹嗑則鯪氺牏嶰恘詭其礎哧遷囵蟃苧匚輮縫漒醒芑闬晽問揫倛勐畒楔檏資筧快尽快尽快尽快将见快尽快尽快尽快将尽快空间进间空间接口可看见看见放放风謕犡螎晾圇醵潣靿炑轙佫谈兊而銍豊错鍽崱躘鈈叩牮痣箊蜏瀆撨榻嫗闑胺