线性评价及分析测量范围的确定

1、线性评价及分析测量范围的确定 陈明 湖南 长沙参考材料CLSI EP6-A ：Evaluation of Linearity of Quantitative Analytical Methods; Approved Guide-Second Edition（美国临床和实验室标准化协会）临床检验方法学评价P168WS/T 408-2012 临床化学设备线性评价指南（中华人民共和国卫生行业标准，2013-8-1实施）概念线性(Linearity)：在给定的测量范围内，使测定结果与样本中分析物的量直接成比例的能力。此处的测定结果指最终的分析结果，而非仪器输出的原始信号。线性范围(Linear Ran

2、ge)：实验系统最终分析结果为可接受的线性的浓度范围，此时的非线性误差应低于允许误差。分析测量范围(Analytical Measurement Range)：指患者样本未经任何处理（稀释、浓缩或其他预处理），由检测系统直接测量得到的可靠结果范围，在此范围内一系列不同样本分析物的测量值与其实际浓度（真值）呈线性比例关系。检测系统要求实验操作人员要求：熟悉仪器操作、质控、校准、正确处理样品。在进行线性评价之前，检测系统应在实验室常规运行一段时间。检测系统要求：仪器应有较好的精密度及不存在明显的携带污染。试剂在效期内并储存条件合格。宜采用与评价试剂配套的校准品或经经验证可用于此线性评价检测系统的产

3、品。样品浓度水平选择所选用浓度水平应尽可能覆盖整个预期测定范围并包括与临床有关的重要评价浓度，如最小测定浓度或线性范围的最低限，不同的医学决定水平，最大测定浓度或线性范围的高限等。样品（浓度水平）数量 EP6-A证实分析测量范围有效性时：需5-7个样品，每个样品重复测定2次。验证声明范围或改良方法时：需7-9个样品，每个样品重复测定2-3次。建立分析测量范围时：需9-11个样品，每个样品测定2-4次。可比预期的分析测量范围宽20-30%，以期检测到“拐点”。样品（浓度水平）数量 WS/T 408-2012 验证：4-6个样品，覆盖线性范围，3-4次测定。建立：9-11个样品，3-4次测定。如欲

4、发现最宽的浓度范围，可将预期测量范围加宽至130%，在此范围内选择更多的浓度水平，然后逐渐减少数据点直至表现出线性关系。样品种类选择依据产生基质效应的可能性，应尽可能按以下顺序选择样品种类临床混合样品用适当稀释液稀释的临床样品（如血清等）添加分析物的临床样品用处理过的低浓度物质或处理过的血清物质稀释的临床样品校准品、线性物质、质控品使用生理盐水稀释的样品浓缩或过度稀释的质控品水溶液其它溶剂的溶液样品制备高浓度样品可通过在低浓度水平的患者样品中添加分析物的方法制备。加入量尽可能少，原则上少于总体积的10%。低浓度样品可直接从患者样本中收集，或经透析、热处理、层析等预处理而降低分析物浓度水平达到所

5、需浓度。注意预处理不能改变分析物或基质的理化特性。样品制备样品稀释液应选用厂家推荐或实验室证明可使用的产品，如5%牛血清白蛋白或人白蛋白溶液。如用溶液作为样品添加剂，添加体积应小于10%，并注明溶剂。避免溶血、脂血、黄疸等。用接近于预期的分析测量范围上限和下限（或测量低限）的两个分析浓度的样本配成所有样本浓度。添加分析物的建议原料添加分析物的建议原料分析物原料分析物原料ALT纯酶Cr无水标准品或高值患者样本ALB白蛋白干粉，人因子片段-GT纯酶ALP纯酶Hb洗涤后的人红细胞溶血液AST纯酶LDH纯酶淀粉酶唾液或胰腺提取物脂酶胰腺提取物BIL纯胆红素，或低稀释度的高值质控品或标准品TP干粉白蛋白

6、，人（首选）或牛因子片段胆固醇纯胆固醇或低稀释度的质控品Mg氯化镁CK纯酶P磷酸二氢钠或钾CO2碳酸钠或碳酸氢钠 样品制备样品号1234567891011低浓度混合血清/ml5.004.504.003.503.002.502.001.501.000.500.00高浓度混合血清/ml0.000.501.001.502.002.503.003.504.004.505.00样品号12345低浓度混合血清/ml5.003.752.501.250.00高浓度混合血清/ml0.001.252.503.755.00浓度计算如果高/低浓度混合血清的值已知，可依据公式C=C1V1C5V5 / V1V5计算各浓度

7、如果高/低浓度混合血清的值未知，可将每种混合血清编码。编码可代表每个血清的相对浓度。对于等浓度间隔样 品，编码可用整数（如1、2、3、4、5等）代表连续样品。本实验方案不需预先知道样品浓度，在确定线性范围时可使用样品测定结果的均值。浓度计算可用计算浓度或标定浓度作为X值，仪器测量结果或仪器输出值（均值）作为Y值。也可用相对浓度作为X值，如浓度间为等间隔，可用样品编号（如1、2、3、4、5等）代表X值。如所制备的样品系列非等间隔，其浓度间的关系应明确，在测定时可以这些间隔间的相对比值做为X值，此时的样品编号可以不为整数。实验程序一般要求：实验人员必须熟练掌握仪器操作和维护程序、样本准备方法和校准

8、。全部实验和数据采集宜在同一试验批（run）内或者相隔简短的实验批中完成（在一天内完成）。样本随机排列。有显著携带污染时，应用空白隔开样本。每个浓度样本重复测定2-4次。记录分析结果。初步数据检查 EP6-A以样本浓度或相对浓度为X轴，测定浓度为Y轴绘制散点图，将各样品测定均值画在图上，用手工或计算机方法将这些均值点连接起来，观察各测定值与均值连线的大致偏差。当某个样品的某测定值明显偏离其它测定值时，目视判断它是个离群点。单个离群点可从数据组中剔除，如发现两个或两个以上离群点应考查造成误差的可能原因，纠正后对整套样品重新测定。初步数据检查 EP6-A目视检查散点图可很容易发现非线性或实验样品浓

9、度范围过宽或过窄，同时还可以为后续的统计分析选择合适的统计方法提供依据。检测离群点WS/T 408-2012 检测离群点多项回归分析将测定数据进行多项回归分析，得出一级、二级、三级多项式，此步骤可用统计学软件（如SPSS, SAS）完成。阶数多项式回归自由度一阶y=b0b1x2二阶y=b0b1xb2x23三阶y=b0b1xb2x2b3x34多项式回归方程模式一级多项式模型为直线，这是判断某种方法是否为线性的最适方程。二级多项式模型为一种抛物线反应曲线，有增加趋势（曲线上升）或减少趋势（曲线下降）两种。三级多项式模型代表一种“S”形反应曲线，在测量范围的两端呈非线性。多项式回归分析思路第一步判断

10、用非线性多项式拟合数据是否比线性好。第二步判断最适非线性模型与线性拟合之间的差值是否小于预先设定的该方法的允许偏差。符号与缩略语回归方程的线性检验 t = bi / SEi bi-回归系数 SEi -每个非线性系数的标准误自由度 df=LRRdf L-样本数 R-每个样本的测定次数 Rdf-回归自由度，即回归方程中系数（包括b0）的个数回归方程的线性检验当检测到非线性时，通过计算回归标准误(sy.x)，确定最优的二次或三次多项式回归方程， sy.x是测量均值与回归方程对应值的差值量度，反应样本回归系数与总体回归系数之间的抽样误差。因而sy.x越小，说明该回归方程越适合数据组。回归方程的线性检验

11、多元回归方程二阶模式中b2为非线性系数，三阶模式中b2和b3为非线性系数，每个SEi可由回归计算程序得出。对非线性回归系数b2和b3做 t 检验，判断回归系数与0是否有显著性差异。如回归系数与0有显著差异(P0.05)，则该组数据存在非线性。前两个系数b0与b1因不反映非线性故不需检验。回归方程的线性检验如二级多项式L = 5，R = 2，Rdf = 4，df = 52-4 = 6。在t值表中寻找t界值（双侧检验，=0.05），如非线性系数b2tt0.05(df)，则差异无显著性（P0.05），数据组被认为具线性。此时可对数据组进行精密度检验，精密度符合线性判断要求时，数据分析结束并得出结论为

12、数据组具有统计学线性或一阶线性。如任一非线性系数具显著性（P0.05），数据组则为非线性。此时应进行临床标准的线性与非线性检验。非线性程度判断临床标准的线性与非线性检验线性评价是为临床服务。多项式回归是强调利用统计学方法判断线性，没有考虑临床允许有一定的误差。临床实验室或生产厂家可根据临床上对方法测定误差的具体要求制定本室的线性判断标准或称允许误差。WS/T408-2012设定统计量PctBnd，对大多数分析物PctBnd取5%。非线性程度判断WS/T408-2012临床标准的线性与非线性检验非线性程度判断WS/T408-2012临床标准的线性与非线性检验将ADL与临界值表比较，ADL小于临界

13、值，判定为临床可接受的非线性，即二阶或三阶线性。否则判定为临床不可接受的非线性，即非线性。P标注P的表格表示最优拟合方程的精密度太差，无法进行线性判断非线性程度判断-EP-6A计算每一个浓度处的线性偏离(deviation from linearity.DL) DLip(xi) (b0bixi)x的取值范围x1到xs， p(xi) 为最适多项式回归模型在xi处的值，因而 DLi为在每个不同浓度处二次或三次多项式模型与一次多项式（线性）模型的差值，也即非线性模型与线性模型在每个浓度点的差值。DLi可为绝对值，或将每个DLi除以该浓度已知值或测量均值再乘以100%。 非线性程度判断-EP-6A将每

14、个浓度的DLi与设定的误差范围比较，如DLi 设定误差，则非线性误差小于设定目标，采用线性方式处理患者结果引入的误差不超过临床允许误差，临床上可接受。非线性程度判断-EP-6A如果任一点超过设定误差，则代表该点可能是非线性，可按以下两种方法处理：寻找非线性的原因：样品准备、干扰、仪器校准等，进行纠正。观察散点图，如非线性点位置在两端，可先删除太大的点并重新进行统计分析，但这样会缩小线性范围。WS/T408-2012EP6-A参数ADL，计算较复杂参数DL，计算简单评估整个稀释范围的非线性程度。评估每个稀释浓度的非线性程度。可得出更宽的线性范围可能缩小线性范围可用来对不同实验室或不同方法之间进行

15、比较。可能一些非线性点得出线性结论。更适合于实验室日常操作。当呈曲线关系的数据用直线回归时，直线回归估计值明显偏高，用估计值（非测量均值）计算导致差异超过5%，得出非线性结论。两种方法比较两种方法比较WS/T408-2012EP6-A精密度检验评估所有数据与最优拟合值的差异精密度检验只评估每个浓度点数据与均值的差异多项式回归分析要求具有较高的测量精密度，否则会降低统计功效。采取对明显的非线性不作判断，剔除离群值，检验测量数据的精密度的措施，达到有足够统计功效的目的。数据的精密度检验WS/T408-2012精密度判断精密度判断EP6-A精密度判断EP6-A如Sr不精密度设定目标，则数据组精密度太

16、低，不足以用来真实、可靠地评价线性关系。检查检测系统进行纠正，或将重复测定次数增加一倍（4次）。线性范围报告（必报）进行线性评价的实验室或生产厂家名称被评价的方法或试剂名称，批号测定项目线性范围线性范围报告（如有条件可加报）线性范围低限及在此水平的允许误差线性范围高限及在此水平的允许误差测定项目的医学决定水平及在此水平的允许误差例1 ALT测定的线性评价ALT测量结果（单位为U/L）样本号测量结果1测量结果2测量均值1555.02222225223.53435433434.04673672672.55853857855.06105410961075.0方程阶数系数符号系数值系数标准误t检验自由

17、度回归标准误最优拟合方程一阶b0-204.133311.4267-17.87y=213.800 x204.1333b1213.80002.934172.871012.27二阶b0-221.550022.4530-9.87b1226.862514.689415.44b2-1.86612.0542-0.91912.55三阶b0-215.833355.2306-3.91b1219.671362.93013.49b20.515920.13730.03b3-0.22691.9029-0.12815.31自由度1098t界值（双边检验，=0.05）2.2282.2622.306线性评价一阶方程b1假设检验

18、t值=72.872.228，差异具有显著性。二阶方程b2假设检验t值=0.912.262，差异不具有显著性。三阶方程b2假设检验t值=0.032.306，差异不具有显著性。 b3假设检验t值=0.122.306，差异不具有显著性。判断实验结果为一阶线性。精密度检验WS/T408-2012精密度检验WS/T408-2012精密度检验EP6-A方法三：根据公式计算Sr 1.21%，如设定的不精密度为5%，则该数据组不精密度符合要求。结论本检测系统ALT在51075U/L的范围内为统计学标准的线性关系或一阶线性。例2：钾离子测定的线性评价（单位为mmol/L） 样品号重复1重复2重复3重复4平均值一

19、阶拟合值二阶拟合值三阶拟合值10.7000.7000.7000.7000.7000.8400.7020.68422.9003.0002.9002.8002.9002.8592.9252.95935.5005.1005.1005.3005.3005.0225.1635.16347.1007.1007.2007.1007.1007.1467.2167.18359.0009.4009.0009.1009.1009.2329.0939.110方程阶数系数符号系数值系数标准误t检验P值自由度回归标准误最优拟合方程一阶b00.0020.0790.984b10.9530.0130.000180.180二阶b

20、0-0.2600.0910.011b11.1050.0410.001b2-0.0140.0040.000170.136y=-0.014x21.105x0.260三阶b0-0.3390.1390.026b11.1920.1220.000b2-0.0350.0270.217b30.0010.0020.457160.138线性评价上表显示三阶方程系数b2有统计学意义（P0.05），三阶系数没有统计学意义（P0.05），最优拟合方程为二阶方程，数据拟合结果是统计学标准的非线性。精密度检验和非线性程度判断(WS/T408-2012)非线性程度判断(EP6-A)样品号测量均值线性偏离线性偏离（%）10.7

21、000.1381.9722.9000.0662.2735.3000.1412.6647.1000.0700.9859.1000.1391.53精密度检验EP6-A根据公式计算Sr 2.45%，如设定的不精密度为5%，则该数据组不精密度符合要求。结论本检测系统钾离子在0.709.10mmol/L的范围内为统计学标准的二阶线性并为临床可接受线性关系。例3：磷测定的线性评价（单位为mmol/L） 样品号重复1重复2重复3重复4平均值一阶拟合值二阶拟合值三阶拟合值11.4001.4001.4001.4001.4000.9881.2631.38021.8001.8001.8001.8001.8002.2

22、292.0991.87633.4003.3003.4003.4003.4003.5513.2703.26444.9004.9004.9004.9004.9004.8884.7494.97456.4006.3006.3006.4006.4006.1696.4446.331方程阶数系数符号系数值系数标准误t检验P值自由度回归标准误最优拟合方程一阶b00.6770.1270.000b10.7960.0290.000180.306二阶b01.0940.1110.000b10.4130.0730.000b20.0530.0100.000170.191三阶b01.4370.0640.000b1-0.2580.0860.009b20.2900.0290.000b3-0.0220.0030.000160.085y=-0.022x30.290 x20.258x1.437线性评价上表显示三阶方程系数有统计学意义（P0.05），最优拟合方程为三阶方程，数据拟合结果是统计学标准