NK细胞杀伤活性检测课件

1、NK细胞杀伤活性检测 -乳酸脱氢酶释放法1NK细胞杀伤活性检测 -乳酸脱氢酶释放目的要求熟悉乳酸脱氢酶释放法测定NK细胞杀伤活性的检测方法。2目的要求熟悉乳酸脱氢酶释放法测定NK细胞杀伤活性的检测方法。【原理】 乳酸脱氢酶 (LDH) 是活细胞胞浆内含酶之一。正常情况下，LDH不能透过细胞膜。当靶细胞受到效应细胞的攻击而损伤时，细胞膜通透性改变，LDH可释放至介质中。释放出来的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的过程中，使氧化型辅酶(NAD+) 变成还原型辅酶(NADH2)。后者再通过递氢体-吩嗪二甲酯硫酸盐 (PMS) 还原硝基氯化四氮唑蓝(NBT)，形成有色的甲臢类化合物，在490nm或570nm

2、波长处有一高吸收峰。利用读取的A值，经过计算即可得知NK细胞杀伤靶细胞的活性。3【原理】 乳酸脱氢酶 (LDH) 是活细胞胞浆内实验原理 效应细胞 靶细胞 释放LDH 丙酮酸乳酸乳酸脱氢酶(LDH)NAD+NADH+H+PMSNBT 甲臢(OD570nm）吩嗪二甲酯硫酸盐硝基氯化四氮唑蓝4实验原理 效应细胞 靶细胞 【试剂】1. 靶细胞 检测人的NK 细胞活性常用的靶细胞为体 外传代细胞株K562。2. 效应细胞 从人外周血（肝素抗凝）分离的单个核 细胞。3. 1640 培养液4. LDH 底物溶液（临用前配制） NBT 硝基氯化四氮唑蓝 4mg NAD+I 氧化型辅酶I 10mg PMS 吩

3、嗪二甲酯硫酸盐 1mg5【试剂】1. 靶细胞 检测人的NK 细胞活性常用的靶细胞为【试剂】 加蒸馏水2ml 溶解，混匀后取上清液1.6ml，加1mol/L 乳酸钠0.4ml，然后加入0.1mol/L pH7.4 PBS 至10ml。5. 1% NP40 ： 取1ml NP-40 加去离子水99ml。6. 1mol/L 柠檬酸终止液 取柠檬酸21g 加去离子水100ml6【试剂】 加蒸馏水2ml 溶解，混匀后取上清实验步骤效应细胞的制备（分离外周血单个核细胞）靶细胞的制备效-靶细胞相互作用酶促反应结果判读7实验步骤效应细胞的制备（分离外周血单个核细胞）靶细胞的制备效 取培养2448hr的靶细胞(

4、K562), 洗涤3次（1000rpm10min）, 最后用完全RPMI-1640培养液调整细胞浓度至1105/ml, 备用。靶细胞的制备：8 取培养2448hr的靶细胞(K562), 效应细胞的制备（分离外周血单个核细胞）采集静脉血4 ml，加0.2ml肝素溶液（125-250U/ml）抗凝分别吸取2ml淋巴细胞分层液置10ml离心管中，将管倾斜45，沿管壁缓缓注入抗凝血离心2000rpm20min9效应细胞的制备采集静脉血4 ml，加0.2ml肝素溶液（12密度梯度离心分离淋巴细胞亚群10密度梯度离心分离淋巴细胞亚群10用完全RPMI-1640定容细胞，计数后调整细胞浓度（加入0.2ml完

5、全RPMI-1640 ，混匀，1x 107）将所得PBMC用5倍体积的1640洗涤一次2000rpm10 min用毛细吸管轻轻吸去上层的血浆、稀释液及血小板，再用另一支毛细吸管仔细吸取单个核细胞（灰白色层）11用完全RPMI-1640定容细胞，计数后调整细胞浓度将所得P计数PBMC1.计数4个大方格中（即64个小方格）所有细胞数2.计数原则：数上不数下，数左不数右。3.总数除以4，所得数据104即为1ml液体中的细胞总数4.每ml健康成人血可分离出11062106个单个核细胞 12计数PBMC1.计数4个大方格中（即64个小方格）所有细胞数1313计数PBMC举例数4个大方格细胞数分别为：87

6、，79，91，85总数为： 87+79+91+85=342一个大方格的平均数为：342/4=85.51ml液体中细胞量为：85.5104如果用染液稀释后计数，则细胞数为该数据的2倍。14计数PBMC举例数4个大方格细胞数分别为：87，79，91，效-靶细胞作用 将效应细胞和靶细胞各0.1ml(E/T=100:1)加入96孔细胞培养板的孔中, 每份标本设2个复孔,同时设靶细胞自然释放对照组 (0.1ml靶细胞+0.1ml RPMI-1640液)最大释放对照组 (0.1ml靶细胞+0.1ml1NP-40液), 1000r/min, 2min后, 置37、5CO2温箱中孵育2-4h。15效-靶细胞作

7、用 将效应细胞和靶细胞各0.1ml(E/T=A 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 实验组 自然释放组 最大释放组 1 2 3 4 5 6 效应细胞（100l） + + - - - -靶细胞（100l） + + + + + +RPMI1640 （100l） - - + + - - 1%NP-40 （100l） - - - - + + 16A 1 2 3 4 5【操作方法】酶促反应 ：从37温箱中取出培养物，吸取各孔上清0.1ml 加于另一培养板孔中。17【操作方法】酶促反应 ：从37温箱中取出培养物，吸取各孔上酶促反应置37预温10min, 加入新鲜配制的底物溶液0.1ml,

8、 37避光反应1015min。终止酶促反应（用毛细吸管滴一滴1mol/L柠檬酸30l）A 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1218酶促反应置37预温10min, A 1 2 结果计算 用酶标检测仪在570nm波长下读取各孔OD值, 并计算NK细胞活性。实验组OD值-自然释放对照组OD值NK细胞活性（%）最大释放对照组OD值-自然释放对照组OD值=100%19结果计算 用酶标检测仪在570nm波长下读取各孔OD值1、无论采用何种试验方法, 靶细胞的质量是影响细 胞标记率、自然释放率及实验稳定性的重要因 素。一般要求靶细胞的自然释放率10。2、分离PBMC时，应用毛细吸管尽可能吸取

9、灰白 层，切勿搅动各层。3、吸取细胞培养上清时, 应尽可能不吸动沉淀的细 胞。4、用此法测得NK活性的正常值范围在10-40%。注意事项:201、无论采用何种试验方法, 靶细胞的质量是影响细注意事项:2实验报告记录NK细胞杀伤实验的原理、方法、 结果。21实验报告记录NK细胞杀伤实验的原理、方法、21 T淋巴细胞检查1T细胞检查（1）T细胞花环形成试验 （Erythrocyte rosette formation test, ERFT）22 T淋巴细胞检查1T细胞检查22E花环形成试验（Erythrocyte rosette formation test, ERFT）【目的要求】1.掌握T淋巴

10、细胞E花环试验的原理、正常值， 了解其方法和用途。2.熟悉光镜下E花环的形态和计数方法。23E花环形成试验23【实验原理】 T细胞表面具有能与绵羊红细胞（SRBC）表面糖肽结合的受体，称为E受体（CD2）。已证实E受体是人类T细胞所特有的表面标志。当T细胞与SRBC混合后，SRBC便粘附于T细胞表面，呈现花环状。通过花环形成检查T细胞的方法，称为E花环形成试验。24【实验原理】24根据花环形成的多少，可测知T细胞的数目，从而间接了解机体细胞免疫功能状态，判断疾病的预后，考核药物疗效等。25根据花环形成的多少，可测知T细胞的数目，从而间接了解机体细胞2626 【实验方法】淋巴细胞与SRBC按一定比例(1:10)混合 37 5分钟， 420分钟 取样涂片瑞氏染色、镜检。 计数E花环数，算出总花环形成率。 正常值为60%80%。 27 【实验方法】27 【结果观察】高倍镜检查：淋巴细胞呈蓝色，SRBC呈红色围绕淋巴细胞形成花环