NR4A2通过肝纤维化中的MAPK通路抑制肝星状细胞增殖

1、孤核受体NR4A2通过肝纤维化中的MAPK通路抑制肝星状细胞增殖摘要：肝星状细胞（HSC）在肝纤维化中起关键作用，肝纤维化是以细胞外基质积累的病理过程。NR4A2 是属于 NR4A 亚科的核受体，在调节细胞生长，代谢，炎症等生物功能至关重要。然而，它在HSC中的作用尚不清楚。我们对纤维化肝脏中的NR4A2表达和刺激的HSCs 与对照组作对比，并研究了 NR4A2 敲除后对细胞增殖，细胞周期，细胞凋亡和 MAPK 通 路的影响。通过实时聚合酶链反应， Western 印迹，免疫组织化学和免疫荧光分析检测NR4A2表达。纤维化肝组织和PDGF BB或TGF- p中NR4A2表达显着降低后刺激的HS

2、Cs 与对照组相比。NR4A2敲除后，a-平滑肌肌动蛋白和Coll表达增加。此外，NR4A2沉默 促进细胞增殖，S期的细胞百分比增加，HSCs中ERK1 / 2 , P38和JNK的磷酸化水平降 低。这些结果表明NR4A2可通过MAPK通路抑制HSC增殖，并减少肝纤维发生中的细胞 外基质。NR4A2可能是治疗肝纤维化的治疗靶点。关键词：纤维化，肝星状细胞，MAPK , NR4A2，增殖介绍肝纤维化是细胞外基质积累为特征的病理过程。它可能由炎症，药物，酒精，病毒和胆汁郁 积引起。许多细胞如内皮细胞，肝星状细胞（HSC）和枯否细胞参与肝纤维发生。其中HSCs 起着关键作用，是细胞外基质的主要细胞来

3、源。HSC，也称为贮脂细胞或窦周细胞，及在 肝脏的窦周隙中发现的周细胞。当肝脏受损时，静息状态的HSC细胞被活化。MAPK /细胞外调节激酶(ERK )途径对HSC的活化起十分重要的作用。最近在动物模型 中证明肝纤维化是可逆的。然而，一些机制还仍然不知道。NR4A亚家族的报道越来越多。NR4A家族广泛分布在调节分化中，增殖和凋亡的细胞，并 且涉及许多疾病如癌症，血管硬化和代谢综合征。NR4A成员都有高度保守的细胞区域：可 变的氨基末端区域，中心的DNA结合区域在可变且连续的D区域，DBD连接到羧基末端 保守E / F区域的ONR4A是早期反应基因 作为转录因子oPalumbo-Zerr等人观察

4、到NR4A1 招募限制TGF- B导致纤维化的阻遏物。TGF- B的持续激活抑制NR4A1在纤维化疾病中的 表达。yin等发现，在子宫肌瘤中NA4A1 , NR4A2和NR4A3的表达显着下降。肝脏疾病 中NR4A的研究很少。可以肯定的是，HSCs中ERK1的下调显着减弱了纤维化肝脏细胞 外基质沉积。ERK5 / MAPK与NR4A2组合导致转录活性升高。另外，NR4A2被鉴定为 ERK2的靶标。总之，NR4A2可能调节肝纤维化中的HSC。在本文中，我们证实NR4A2的表达在纤维化肝组织和PDGF BB或TGF- p刺激的HSC中 显着降低。NR4A2沉默导致a平滑肌肌动蛋白表达量更多，促进细

5、胞增殖和增加S期细胞 百分比以及降低ERK1 / 2 , P38和JNK在HSC中的磷酸化。因此，NR4A2可能是抗纤维 化治疗的潜在靶点。材料与方法 抗体和试剂来自圣克鲁斯(Santa Cruz )的抗甘油脱水磷酸脱氢酶(GAPDH )( SC-25778 ), NR4A1(SC-5569 ), NR4A2 ( SC-991 ), NR4A3 ( SC-30154 )和 a -SMA ( SC-32251 ) CA , USA )Alexa氟 546 IgG抗体(A10040 和 Alexa Fluor 488的 lgG( H + L 抗体(A21202 ) 得自 Life Technolo

6、gies( Carlsbad ,CA , USA )来自 LI-COR Biosciences( Lincoln , NE， USA )的 IRDye680 抗兔抗体(926-32221 )和 IRDye680 抗小鼠抗体(926-32220 )来自 Cell Sig nali ng( Dan vers ,MA )的 Erk1 / 2( 4695P )，P-erk1 / 2( 4370P ), JNK( 9258P )， P-JNK( 4668P ),P-P38( 4511P )和 P38( 8690P )，美国)Nycodenz( QK1002424-1 ) 来自Nycomed (瑞士苏黎世

7、)NC硝化纤维素来自Pall ( Port Wash in gt on , NY , USA ) 脱氧核糖核酸酶I得自Roche ( Basel，Switzerland ) D-HanK和30%丙烯酰胺溶液来自 Bio-Light (中国上海)二氨基联苯胺(DAB )试剂盒(GK50705 )来自Gen eTech (中国 上海)细胞周期和细胞凋亡分析试剂盒购自R&S (中国上海)膜联蛋白V-FITC细胞凋 亡检测试剂盒来自Keygen (中国新泽西州)TGF-pp1得自Peprotech ( Rocky Hill , NJ , USA )吐温-20和过硫酸铵均获自国药(中国北京)Lipofe

8、ct-amineTM 2000购自Invitrogen (Carlsbad , CA , USA )胶原酶 IV , PDGF BB 和 Pronase 购自 Sigma ( St.Louis , MO , USA )粪便小牛血清(FBS )购自Gibco ( Waltham , MA , USA ) RIPA缓冲液，苯基甲 基磺酰氟，TEMED ,5xSDS加载缓冲液和BCA试剂盒均来自Beyotime (中国上海)动物和肝脏样品将大约250-270g的雄性Sprague-Dawley大鼠(SLAC冲国上海)保持在12小时黑暗/ 12 小时光照循环中 所有动物实验均经上海交通大学附属第六人民

9、医院动物保护使用委员会批 准(许可证编号 SYXK2011-0128) 人肝脏样本由上海交通大学附属第六人民医院肝胆外 科科提供 所有样品均按照上海交通大学伦理委员会的要求细胞培养HSC-T6细胞由纽约大学西奈山医学院(MSSM )的Friedman博士亲自提供。细胞在补充 有10%热灭活胎牛血清(FBS )的DMEM培养基中培养。将所有细胞在379下用5%CO 2保持在潮湿的培养箱中。使用血小板衍生生长因子(PDGF ) BB或TGF- B进行刺激。RNA分离和定量实时聚合酶链反应使用Trizol从HSC-T6细胞中提取总RNA ,并使用PrimeScript RT Master Mix逆转

10、录。使 用SYBR Green PCR Kit和Applied Biosystems 7500实时PCR系统进行实时聚合酶链反 应(RT-PCR )引物序列如下：NR4A1 ( Fw : 5-ACACCGGAGAGTTTGACACC-3; Rev : 5-GGGTAGCAGCCATACACCTG-3); NR4A2(Fw：5-AGATTCCTGGCTTTGCTGAC-3; Rev ： 5-CTGGGTTGGACCTGTATGCT-3 ); NR4A3 ( Fw ：5-GGCTGCAAGGGCTTCTTCA-3; Rev : 5-CACCATCCCGACACTGAGACA); a- SMA (F

11、w：5-CCAGGGAGTGATGGTTGGA-3; Rev：5-CCGTTAGCAAGGTCGGATG-3);Col1 ( Fw :5-AGGCATAAAGGGTCATCGTG-3; Rev :5-ACCGTTGAGTCCATCTTTGC-3 ); p -肌动蛋白(Fw :5-ACCCACACTGTGCCCATCTATG-3; Rev:5-AGAGTACTTGCGCTCAGGAGGA-3)。循环条件为95930秒，9595秒和60934秒循环40次，95995秒15秒，6091分钟，95915分钟秒。将所得序列归一化为p-肌动蛋白表达水平，并通过2-aact方法测量相对基 因表达。免疫组织化

12、学和免疫荧光将肝组织包埋在石蜡中并切片。将切片在3%H 2 O 2的甲醇中孵育，并用10%正常山羊血 清阻断非特异性结合。将切片与第一抗体在49孵育过夜，洗涤并在室温下与二抗孵育60 分钟。使用DAB试剂盒观察抗原-抗体复合物。如先前所述进行免疫荧光。为了检测NR4A2和a平滑肌肌动蛋白(a肝组织中a-SMA )的 表达，将切片孵育48小时，在49下用下列一抗：NR4A2 ( 1:50 ), Alexa氟 546的IgG (1 : 500 ), Alexa氟 488 的 IgG ( H + L)( 1 : 500 )将切片在4,6-二氨基-2-苯基吲哚 (DAPI , 1:100 )中孵育1分

13、钟并安装在抗褪色试剂中。NR4A2 siRNA 转染对于RNA干扰测定，将细胞以5x10 5的密度接种到6孔细胞培养板中细胞。根据制造商 的说明书,用 siRNA 和 Lipofectamine 2000 转染细胞。针对 NR4A2(GenePharma, Shanghai , China )的双链小干扰 RNA ( siRNA )如下：siRNA ( 1 ) ( Fw : 5-CGCGAAAUAUGUGUGUUUATT-3; Rev：5-UAAACACACAUAUUUCGCGTT-3); siRNA (2)( Fw ： 5-GACCAUGUGACUUUCAAUATT-3; Rev ：5-UA

14、UUGAAAGUCACAUGGUCTT-3 ); siRNA (3)( Fw ：5-GACCUCACCAACACUGAAATT-3; Rev：5-UUUCAGUGUUGGUGAGGUCTT-3); 阴 性 对 照 ( Fw ： 5-UUCUCCGAACGUGUCACG UTT-3; Rev ： 5-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3)简言之，将 100nmol siRNA和 5plLipofectamine 2000以最终体积为500稀释在血清和抗生素游离opti-DMEM ( Invitrogenn , Carlsbad , CA， USA )中。在室温下混合20分钟后， 2培养

15、箱。合成了与大鼠基因没有已知同源性的 非沉默siRNA作为阴性对照。初级HSC隔离制备了主要HSCs的Sprague-Dawley大鼠。麻醉后，打开大鼠腹壁，将肠移开，以露出腔 静脉和门静脉。将固定到适当位置的精细插管插入静脉。灌注溶液在使用前在379下孵育。 然后使用可调式蠕动泵来控制原位肝灌注过程。肝肿胀后，打开下腔静脉插管以排出。随后， 用D-HanK溶液，胶原酶IV溶液，Pronase溶液在379下依次灌注肝脏15分钟。收集破 碎细胞，洗涤并置于缓冲液的顶层和18%Nycodenz的底部缓冲液之间。在1400g离心22 分钟后，得到顶部和中间层之间的HSCs部分。最后，将细胞在补充有1

16、0%FBS的DMEM 培养基中培养。蛋白质印迹根据之前所述方案进行Western印迹分析。使用针对a- SMA( 1:500 ) ,GAPDH( 1:1000 ), NR4A1( 1:500 ) ,NR4A2( 1:500 ) ,NR4A3( 1:500 ) ,IRDye680 抗兔(1 :5,000 ) ,IRDye680 抗鼠( 1:5000)，Erk1 / 2( 1:5000)，P-erk1 / 2( 1：1,000)，JNK( 1：1,000)，P-JNK( 1：P-P38 ( 1 : 1,000 )和 P38 ( 1 : 1,000 ) 将蛋白质样品进行SDS，然后转移到聚偏二氟乙烯

17、膜上。封闭后，将膜与一抗，然后与过氧化物酶结合的二抗一起温育。通过奥德赛红外成像系统扫描蛋白质样品。CCK-8测定根据制造商的说明书，使用Cell Counting Kit-8评估细胞活力。简言之，将用NR4A2 siRNA 转染的HSC-T6细胞接种到96孔板（每孔3x10 3个细胞）中。接下来，向每个孔中加入 10JCCK8,将细胞在379下孵育2小时。使用酶标仪在450nm下评估吸光度。各组孔平 均光密度（0D ）用于绘制细胞生长曲线。细胞周期分析将细胞以5x10 5个细胞的密度接种到6孔细胞培养板中。细胞用siRNA NR4A2转染，48 小时后，根据制造商的方案收集细胞，染色并用碘化丙啶（PI ）固定，并使用流式细胞仪进 行细胞周期分析， 。细胞凋亡测定将细胞以5x10 5个细胞的密度接种到6孔细胞培养板中。细胞用siRNA NR4A2转染，48 小时后收获细胞。使用FITC AnnexinV细胞凋亡检测试剂盒根据制造商的方案测量细胞凋 亡测定，并使用流式细胞仪进行细胞周期分析。统计分析结果以平均值土SD表示，并通过方差分析（ANOVA ）或Students t检验进行分析，随后进 行配对比较。P 3） * P 3） * PV0.001 对 NC。（ E ）在由 TGF-3 刺激的 HSC-T6 细胞 NR4A2 水 平的实时