临床生物化学常用技术课件

1、临床生物化学检验常用技术第3章临床生物化学常用技术1临床生物化学检验常用技术第3章临床生物化学常用技术1 本 章 主 要 内 容光谱检验技术电化学分析技术电泳技术干化学技术PCR技术 临床生物化学常用技术2 本 章 主 要 内 容临床生物化学常用技术2教学目标和要求 掌握光谱分析中的对比法、摩尔吸收系数法、比浊法测定的方法原理，在生化检验中的应用及注意事项；区带电泳的原理、应用及影响因素；离子选择性电极法测定的原理和注意事项。 熟悉离心技术，其它电泳技术和层析技术中的HPLC及亲和层析的原理和应用；免疫分析技术、生物传感技术的概念和应用原理。 了解色谱、层析等常用生化技术的应用原理和方法，生物

2、芯片技术的概念和应用原理。 临床生物化学常用技术3教学目标和要求临床生物化学常用技术3第一节 光谱分析技术分光光度技术的基本原理分光光度计的基本结构分光光度计的操作方法 分光光度技术的定性和定量方法 临床生物化学常用技术4第一节 光谱分析技术分光光度技术的基本原理分光光度计的基光的本性光的描述：波长和能量可见光：400nm760nm紫外光:200 nm400nm红外光: 760nm1000nm临床生物化学常用技术5光的本性临床生物化学常用技术5光谱分析技术原理： 利用各种化学物质都具有发射、吸收或散射光谱谱系的特征，以此来确定物质性质、结构或含量。光谱分析技术分类：发射光谱分析技术：火焰光度法

3、、原子发射光谱法和荧光光谱法 吸收光谱分析技术：紫外、可见光分光光度法，原子吸收分光光 度法和红外光谱法 散射光谱分析技术：比浊法 临床生物化学常用技术6光谱分析技术原理： 利用各种化学物质都具有发射、吸收或一、分光光度技术的基本原理（一）吸光度与透光度 A = -lgT = -lgI/I0 = lgI0/I 当光线通过均匀、透明的溶液时可出现三种情况：一部分光被散射，一部份光被吸收，另有一部分光透过溶液。设入射光强度为I0，透射光强度为I，I和I0之比称为透光度，即：T = I/I0 T100为T%称为百分透光度。透光度的负对数称为吸光度即：临床生物化学常用技术7一、分光光度技术的基本原理（

4、一）吸光度与透光度 当（二）Lambert-Beer定律 Lambert-Beer定律是讨论溶液吸光度同溶液浓度和溶液层厚度之间关系的基本定律，该定律是分光分析的理论基础。其表达式为： A = KLC 式中A为吸光度；K为比例常数，称为吸光系数；L为溶液层厚度，称为光径；C为溶液浓度 （Lambert-Beer定律适用于可见光、紫外光、红外光和均匀非散射的液体。）临床生物化学常用技术8（二）Lambert-Beer定律 Lambert-B吸收曲线（曲线）1.0 0.8 0.6 0.4 0.2Y=ax+b临床生物化学常用技术9吸收曲线（曲线）吸光系数的应用、定性、判断方法的灵敏度、定量测定物质浓

5、度临床生物化学常用技术10吸光系数的应用、定性临床生物化学常用技术10偏离朗伯比耳定律的因素?1、光学因素2、化学因素3、为什么有的分光光度计使用双波长或双光束？临床生物化学常用技术11偏离朗伯比耳定律的因素?1、光学因素临床生物化学常用技术11分光光度法的结构光源及光源要求波长的选择原则:可按“吸收最大，干扰最小”的原则进行。 2、单色器3、比色杯及要求4、检测器与显示器临床生物化学常用技术12分光光度法的结构光源及光源要求临床生物化学常用技术12分光光度计的使用1、开启电源，将比色池盖打开，通电20分钟预热2、调节波长3、将空白液、标准液及样品液置于光路4、空白调节T为0、100%5、调A

6、为06、重复4和57、测量标准和样品吸光度。临床生物化学常用技术13分光光度计的使用1、开启电源，将比色池盖打开，通电20分钟预（二）吸光度的校正 铬酸钾的标准液可用于校正分光光度计的吸光度。在25，将4mg铬酸钾溶于100ml的0.05mol/L KOH中，放入比色池中，在不同波长下测定吸光度值，与己知的标准吸光度校正表进行比较，可检测仪器吸光度的准确度。 临床生物化学常用技术14（二）吸光度的校正 铬酸钾的标准液可用于校正分光光度计四、分光光度技术的定性和定量方法（一）分光光度技术的定性方法定性依据：最大吸收波长max和摩尔吸光系数 2.摩尔消光系数方法1.最大吸收波长max方法临床生物化

7、学常用技术15四、分光光度技术的定性和定量方法（一）分光光度技术的定性方法（二）分光光度技术的定量方法1、对比法1、将已知浓度的标准品和待测溶液有同一方法、在相同条件下同时进行测定。2、当标准液与标本用量可能不同时的测定。标准液的要求：其浓度尽量接近于样品浓度。（双标准）临床生物化学常用技术16（二）分光光度技术的定量方法1、对比法标准液的要求：其浓度尽（二）分光光度技术的定量方法2.标准曲线法 用途：1、确定分析范围2、减少系统误差3、比较方法的灵敏度临床生物化学常用技术17（二）分光光度技术的定量方法2.标准曲线法临床生物化学常用技 根据Lambert-Beer定律，液体的浓度在一定范围内

8、与吸光度成正比关系。配制一系列浓度的标准品溶液（浓度应包含高、中、低浓度范围），按标本处理方法作相同处理，在特定波长下测定吸光度，以标准液浓度为横座标，以吸光度为纵座标，将对应各点连成一条通过原点的直线，这条直线称为标准曲线。待测溶液测定吸光度后，从标准曲线上可查出其相应的浓度。方法：临床生物化学常用技术18 根据Lambert-Beer定律，液体的浓度在一定范作图法的步骤1、制备标准液2、显色反应3、比色4、作图5、制作检量表。临床生物化学常用技术19作图法的步骤1、制备标准液临床生物化学常用技术19将一系列浓度不同的标准溶液按照、一定操作过程显色后，分别测吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横

9、坐标绘制标准曲线。从标准曲线找出相对应的待测样品的浓度，即标准曲线法。标准曲线法临床生物化学常用技术20将一系列浓度不同的标准溶液按照、标准曲线法临床生物化学常用技制作和应用标准曲线时应注意下面几点：（1）浓度范围足够大（2）减少偶然误差（3）当待测液吸光度超过线性范围时，应将标本稀释后再测定。（4）标本测定的条件应和标准曲线制作时的条件完全一致。（5）测定条件发生变化时（如更换标准品和试剂等），应重新绘制。（6）标准品应有高的纯度，标准液的配制应准确。临床生物化学常用技术21制作和应用标准曲线时应注意下面几点：（1）浓度范围足够大（2第二节电化学分析技术 电化学法概述电化学分析：利用物质的电

10、化学性质，测定化学电池的电位、电流或电量的变化进行分析的方法。主要有：电位法、电导法、电容法。临床生物化学常用技术22第二节电化学分析技术 电化学法概述电位分析法基本原理电位分析法是利用电极电位和浓度之间关系来确定物质含量的分析方法。电极电位由能斯特方程式确立。电极电位测定是通过构建原电池电动势，其中一个电极的电位随待测离子尝浓度改变而改变（指示电极）；另一电极电位不受试液影响（参比电极），通过测定原电池的电动势便可求得待测离子浓度。临床生物化学常用技术23电位分析法基本原理电位分析法是利用电极电位和浓度之间关系来确Nernst方程。其方程式为： R为气体常数、T为绝对温度、n为离子电荷数、F

11、为法拉第常数a为被测离子活度临床生物化学常用技术24 R为气体常数、T为绝对温度、n为离子电荷数、F一、离子选择电极法的原理离子选择电极分析法（ion selective electrode，ISE）是利用电极电位和离子活度的关系来测定被测离子活度的一种电化学分析法。ISE法的核心是指示电极上带有对被测离子选择性响应的敏感膜，膜的一面与被测离子的溶液相接触、另一面则与电极内所充的一定活度的被测离子溶液和内参比电极接触，膜内外的离子活度的差异引起离子从高浓度向低浓度迁移，从而产生电位改变，其数值可在等电流的条件下测定。临床生物化学常用技术25一、离子选择电极法的原理离子选择电极分析法（ion s

12、ele离子选择性电极结构临床生物化学常用技术26离子选择性电极结构临床生物化学常用技术26临床生物化学常用技术27临床生物化学常用技术27ISE的特点选择性好:多数情况下共存离子的干扰小，组成复杂的试样往往不需分离处理即可直接测定；灵敏度高：可达10-510-8mmol/L, 线性范围宽，Na+为10-610-1mmol/L，K+为310-51mol/L，氯为510-51mol/L，Ca+为310-51mol/L；溶血、脂血及黄疸不影响测定，对有色、浑浊溶液都可进行分析；设备简单，分析速度快，易于自动化，标本用量少，应用范围广。临床生物化学常用技术28ISE的特点选择性好:多数情况下共存离子的

13、干扰小，组成复杂离子选择电极分析方法1、标准曲线法2、标准比较法3、标准加入法（消除基质效应）样品测定方式：直接法与间接法临床生物化学常用技术29离子选择电极分析方法1、标准曲线法2、标准比较法3、三、离子选择性电极法测定的影响因素1离子强度2、温度3、PH值4、共存离子的干扰临床生物化学常用技术30三、离子选择性电极法测定的影响因素临床生物化学常用技术30Attention! 电解质分析仪一般要求24小时开机，目的是为了保持电极膜很好的水化，增加电极的稳定性。经常关仪器，使得电极膜干燥，会加速电极膜的失效和产生测定中的漂移。仪器正常启动后，清洗管道，进行两点校准，每隔2小时自动单点校准。每天

14、用后进行电极保养，去除附在电极膜上的蛋白质。临床生物化学常用技术31Attention! 电解质分析仪一般要求24小时开机，目的第三节 干化学分析技术 一、干化学分析原理 1、反射光度法Kubelka-Munk理论：光反射率与固相层的厚度、单位厚度的光吸收系数以及固相反应层的散射系数有关系，当固相层的厚度和固相反应层的散射系数固定时，光吸收系数与待测物的浓度成正比。临床生物化学常用技术32第三节 干化学分析技术 一、干化学分析原理 临床生物化学常干化学的原理（1）试剂结构Sample反射层清除剂层支持层 样本扩散层试剂层临床生物化学常用技术33干化学的原理（1）试剂结构Sample反射层清除剂

15、层支持层二、分析原理 （一）分析过程 1样本扩散层待测样品定量加到干片试剂，由展开层把样品均匀展开，并且阻挡固体物质如红细胞和大分子物质进入试剂层。2、反射层 光漫射层，为光检测提供一个具有反射的背景。3、清除剂层：清除血清中内源性干扰物临床生物化学常用技术34二、分析原理 （一）分析过程 临床生物化学常用技术344试剂层样品中的水分成为干式试剂的溶剂，试剂与待测物质进行化学反应。试剂层的结构还能控制多步化学反应的反应次序。支持层为一透明胶片，仅起支撑试剂干片的作用。临床生物化学常用技术354试剂层样品中的水分成为干式试剂的溶剂，试剂与待测物质进干化学的原理（3）比色样本扩散层反射层清除剂层支

16、持层 接收器临床生物化学常用技术36干化学的原理（3）比色样本扩散层接收器临床生物化学常用技术干化学分析技术的影响因素仪器监测：标准灰色试剂条/校准条校准频度：每6个月校准一次，质控经常做质控物：用干化学分析仪生产厂家提供干片试剂的储存与使用：0保存，平衡后用工作环境与温度：1530，湿度85%临床生物化学常用技术37干化学分析技术的影响因素仪器监测：标准灰色试剂条/校准条临床第四节 电泳分析技术临床生物化学常用技术38第四节 电泳分析技术临床生物化学常用技术38一、电泳技术的原理及其影响因素1 原理：带电粒子在电场中的移动现象称为电泳(Electrophoresis)。带负电荷的粒子向电场的

17、正极移动；带正电荷的粒子则向负极移动。各种物质由于所带净电荷的种类和数量不同，因而在电场中的迁移方向和速度不同。利用物质的这种性质可以对物质进行分离和鉴定。临床生物化学常用技术39一、电泳技术的原理及其影响因素1 原理：带电粒子在电场中2 影响颗粒电泳迁移率的因素电泳迁移率？1、分子形状 体积大者慢，小者快2、EvQEV扩散明显、区带模糊、分辨率下降临床生物化学常用技术402 影响颗粒电泳迁移率的因素电泳迁移率？1、分子形状 3、 缓冲液（1）缓冲溶质 性质稳定，缓冲容量大、电导低、离子移动好（2）pH 影响分子电荷性质和电量 (3)离子强度（I） 影响缓冲容量、速度和产热效应 I、pH稳定、

18、速度慢、产热多、时间延长、扩散 I、 pH不稳定、速度快、产热少；区带不整齐、分辨率 下降 临床生物化学常用技术413、 缓冲液临床生物化学常用技术414、支持介质 吸附作用：支持介质对标本的吸附作用 吸附作用使电泳速度减慢，出现拖尾现象。 电渗：电场中液对固相的相对移动 电渗只影响电泳速度，不影响分辨率临床生物化学常用技术424、支持介质临床生物化学常用技术42蒸发：支持介质水份的蒸发导致缓冲液浓缩，离子强度增加，标本分电流减少，电泳速度减慢；虹吸作用，使标本区带向中间集中并弯曲，导致分辨率下降。（所以，电泳时电泳槽要密闭）临床生物化学常用技术43蒸发：支持介质水份的蒸发导致缓冲液浓缩，离子

19、强度增加，标本分二、电泳类型及应用电泳的分类方法很多，在这里电泳原理将电泳分离系统分为1、移动界面电泳2、区带电泳3、稳态电泳临床生物化学常用技术44二、电泳类型及应用电泳的分类方法很多，在这里电泳原理将电泳分（一）. 醋酸纤维素薄膜电泳（cellulose acetate electrophoresis）醋酸纤维素是将纤维素的羟基乙酰化而形成的纤维素醋酸酯，由它制成的薄膜称为醋酸纤维素薄膜。它具有分辨力好，对蛋白质吸附极少，拖尾现象轻微；不吸附染料，对区带周围的染料能完全洗去，不干扰测定；样品需要量少、介质又可以透明后定量扫描等优点。临床生物化学上分离血清蛋白、糖蛋白、脂蛋白、血红蛋白、甲胎

20、蛋白及同工酶等大分子物质。临床生物化学常用技术45（一）. 醋酸纤维素薄膜电泳（cellulose acet缺点和注意事项： 吸水性差，水份易蒸发。 电泳槽要求密闭，维持水蒸气饱和 电流强度不宜过大，0.40.6mA/cm宽。临床生物化学常用技术46缺点和注意事项：临床生物化学常用技术46（三） 琼脂糖凝胶电泳概述：琼脂糖凝胶电泳是以琼脂糖凝胶作为支持介质的一项电流技术。常用于血浆脂蛋白、免疫球蛋白、同工酶和DNA酶切片断的电泳分离。临床生物化学常用技术47（三） 琼脂糖凝胶电泳概述：琼脂糖凝胶电泳是以琼脂糖凝胶作为琼脂糖凝胶电泳优点 电渗作用小 吸附极微 分辨率和重现性均较好 适合分离大分子

21、物质（分子筛效应） 电泳图谱清晰便于扫描并可长期保存临床生物化学常用技术48琼脂糖凝胶电泳优点临床生物化学常用技术48临床生物化学常用技术49临床生物化学常用技术49（二）. 聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE）聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化剂和加速剂的作用下聚合而成三维网状结构的凝胶。临床生物化学常用技术50（二）. 聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamid常用的催化剂有过硫酸胺和核黄素，加速剂一般用四甲基乙二胺。凝胶网状结构孔径的大小，决定于丙烯酰胺单体的浓度和甲叉双丙烯酰

22、胺的浓度及两者的比例。临床生物化学常用技术51常用的催化剂有过硫酸胺和核黄素，加速剂一般用四甲基乙二胺。临PAGE的三种效应1、标本浓缩效应2、电荷效应3、分子筛效应临床生物化学常用技术52PAGE的三种效应1、标本浓缩效应临床生物化学常用技术52电泳区带的测定方法分类：直接法：紫外光扫描区带，适用于透明介质染色法：染料染色后，洗脱背景可见光扫描临床生物化学常用技术53电泳区带的测定方法分类：临床生物化学常用技术53区带染色法蛋白质染料：丽春红、氨基黑10B、考马斯亮兰、溴酚兰、硝酸银。同工酶的染料：常使用乳酸脱氢酶（LDH）-辅酶（NAD+）-酚嗪甲酯硫酸盐（PMS）-NBT脂蛋白染料：苏丹

23、红、苏丹黑，油红O核酸染料：溴乙啶临床生物化学常用技术54区带染色法蛋白质染料：丽春红、氨基黑10B、考马斯亮兰、溴酚区带定量分析1、光密度扫描法2、洗脱比色法 特殊电泳技术自动电泳分析临床生物化学常用技术55区带定量分析1、光密度扫描法 特殊电泳技术临床生物化学常电泳的临床应用一、蛋白质电泳血清蛋白电泳免疫固定电泳脂蛋白电泳尿蛋白电泳二、同工酶电泳分析临床生物化学常用技术56电泳的临床应用一、蛋白质电泳临床生物化学常用技术56临床生物化学常用技术57临床生物化学常用技术57临床生物化学常用技术58临床生物化学常用技术58第六节自动化分析技术临床生物化学常用技术59第六节自动化分析技术临床生物

24、化学常用技术59教学目标和要求掌握自动生化分析仪的分析方法类型及其 特点，连续监测法的理论K值，必选的分析参数，双波长测定的作用，双试剂的优点，分析仪与手工法比较的优点和缺点。熟悉分立式自动生化分析仪的基本结构，备选的分析参数，测定过程的自动监测，校准方式和校准要求，影响分析仪分析速度的因素和分析仪性能指标。了解某些分析参数的特殊意义，分析仪的工作过程和操作方法，干片式分析仪的结构和分析原理，常用分析仪的分析性能。临床生物化学常用技术60教学目标和要求临床生物化学常用技术60三、自动化分析与手工操作的比较 （一）优点 1. 检测速度快 2. 检测灵敏度高 3. 检测准确度高 4. 检测精密度高

25、 5. 样品和试剂用量减少 6. 其他 :能精确地控制反应时间 ;能精确 地控制反应温度 ;能进行复杂的结果计算。 临床生物化学常用技术61三、自动化分析与手工操作的比较 （一）优点临床生物化学常用技（二）缺点 1. 选择次波长较困难 2. 操作时间受限 3. 操作复杂性受限 :加试剂的次数受限制;无法做复杂的操作;选择和改变反应温度困难 4. 样品量/试剂量的比例受限制 5. 不适宜做参考方法 6. 仪器维护和保养较复杂 临床生物化学常用技术62（二）缺点 1. 选择次波长较困难 临床生物化学常用技术62 自动生化分析仪由电脑控制，将生化分析中的取样(sampling)、加试剂、混匀、保温反

26、应、检测(detect)、结果计算、可靠性判断、显示和打印、以及清洗(cleaning)等步骤组合在一起自动进行操作的分析仪器。 临床生物化学常用技术63 自动生化分析仪由电脑控制，将生化分析中的取样(sam第二节 生化自动化分析方法一、分析方法分类（一）终点法（end assay） 被测物质在反应过程中完全被转变为产物，到达反应终点，根据终点吸光度的大小求出被测物浓度，称为终点法。该法称为平衡法更为恰当。从时间-吸光度曲线来看，到达反应终点或平衡点时，吸光度将不再变化。终点法参数设置简单，反应时间一般较长，精密度较好。 临床生物化学常用技术64第二节 生化自动化分析方法一、分析方法分类临床生

27、物化学常用技终点时间的确定根据时间-吸光度曲线来确定，根据被测物反应终点，结合干扰物的反应情况来确定。临床生物化学常用技术65终点时间的确定根据时间-吸光度曲线来确定，临床生物化学常用1一点法（终点法） 在反应到达终点，即在时间-吸光度曲线上吸光度不再改变时选择一个终点吸光度值，用于计算结果。结果计算公式：待测物浓度CU=（待测吸光度AU试剂空白吸光度AB）KK为校准系数 适合蛋白、糖、胆固醇测定临床生物化学常用技术661一点法（终点法） 在反应到达终点，即在时间-吸光度曲线图4-3一点终点法反应曲线 A单试剂一点终点法 B双试剂一点终点法临床生物化学常用技术67图4-3一点终点法反应曲线 A

28、单试剂一点终点法 2两点法（two point end assay） 在反应过程中测定两个时间点的吸光度，此两点吸光度之差用于计算结果。 计算公式为： CU=（待测吸光度A2待测吸光度A1）K。 临床生物化学常用技术682两点法（two point end assay） 在反图4-4两点终点法反应曲线 A单试剂两点终点法 B双试剂两点终点法 临床生物化学常用技术69图4-4两点终点法反应曲线 A单试剂两点终点法 该法能有效地消除溶血(hemolysis)、黄疸（icterus）和脂浊（lipo-turbid）等样品本身光吸收造成的干扰。 图4-5 血红蛋白、胆红素和脂浊的光吸收曲线 临床生物化

29、学常用技术70 该法能有效地消除溶血(hemolysis)、黄疸（i（二）二点速率法（fixed-time assay） 指在反应过程中选择适当两点（此两点既非反应初始吸光度亦非终点吸光度）测定吸光度，这两点的吸光度差值用于结果计算。 计算公式 CU=(A2-A1)K。临床生物化学常用技术71（二）二点速率法（fixed-time assay） 图4-6两点速率法反应曲线 该分析方法有助于解决某些反应的非特异性问题。 临床生物化学常用技术72图4-6两点速率法反应曲线 临床生物化学常用技（三）速率A法（continuous monitoring assay） 又称连续监测法（rate assa

30、y），是在测定酶活性或用酶法测定代谢产物时，连续选取时间-吸光度曲线中线性期（各两点间吸光度差值相等）的吸光度值，并以此线性期的单位吸光度变化值（A/min）计算结果。临床生物化学常用技术73（三）速率A法（continuous monitoring图4-7连续监测法反应曲线 A单试剂连续监测法 B双试剂连续监测法 临床生物化学常用技术74图4-7连续监测法反应曲线 A单试剂连续监测法 酶促反应的线性段 1及5值偏小，而234，故A1点至A4点属线性段 临床生物化学常用技术75酶促反应的线性段 1及5值偏小，而234，故A连续监测法的优点 可以确定线性期并计算A/min，根据此值再准确地计算酶

31、活性，因而使自动生化分析仪在酶活性测定方面显著地优于手工法。连续监测法也可用于测定呈线性反应的代谢物浓度，一般是某些基于酶法测定的代谢物。 酶活性（U/L） A/min理论（或校准）K值。 代谢物浓度CU=A/min校准K值。 临床生物化学常用技术76连续监测法的优点 可以确定线性期并计算A/min1理论K值 多用于酶活性测定中，因酶活性尚无公认的校准品可用。根据酶活性的国际单位定义得出酶活性的计算公式为：酶活性 (U/L)=A/min将此式中 以K来表示，即为理论K值 可作为分析参数输入到分析仪中。 临床生物化学常用技术771理论K值 多用于酶活性测定中，因酶活性尚无公认的校准采用理论K值的

32、前提 应当是样品和试剂的加量准确、比色杯光径准确、温度控制精确以及波长准确等。但事实上由于各型分析仪在注射器容积步进电机精度、滤光片带宽等方面的差异，可造成样品和试剂加量以及吸光度检测的偏差，温度的影响有时也非常大。 临床生物化学常用技术78采用理论K值的前提 应当是样品和试剂的加量准确、比色 由于摩尔吸光系数受比色杯光径、波长等的影响，书本上或试剂厂家提供的理论摩尔吸光系数可能与实际所用分析仪所测的不同，因而有必要获得实际的摩尔吸光系数，然后来计算理论K值。 临床生物化学常用技术79 由于摩尔吸光系数受比色杯光径、波长等的影响，书本上或（1）NADH（NADPH）摩尔吸光系数的测定 NADH

33、（NADPH）没有标准纯制品，而且配成溶液后稳定性又较差，不能直接用NADH 或NADPH标准液来校正仪器，须通过有NAD+(NADP+)参与的反应途径。 临床生物化学常用技术80（1）NADH（NADPH）摩尔吸光系数的测定 用已糖激酶 (HK)或葡萄糖脱氢酶(GD)方法测定葡萄糖时，葡萄糖的消耗与NADH的生成呈等摩尔关系。葡萄糖有标准纯制品。根据公式A=bC，已知比色杯光径b和葡萄糖标准液浓度，测得葡萄糖标准管的吸光度A后便可计算出NADH（NADPH）的摩尔吸光系数为 A/bC。 临床生物化学常用技术81用已糖激酶 (HK)或葡萄糖脱氢酶(GD)方法测定葡萄糖时，测定方法 葡萄糖标准液

34、浓度为1Ommo1/L(0.01mol/L)，标准液加入量为3.5L，酶试剂加入量为335L，比色杯光径为0.7cm，在340nm测得吸光度为0.465，则实测NADH摩尔吸光系数 = 6424，即在此台分析仪上340nm波长处测得NADH（NADPH）的摩尔吸光系数为6424，而理论上NADH（NADPH）的为6220。 临床生物化学常用技术82测定方法 葡萄糖标准液浓度为1Ommo1/L(0.（2）“色素原”酶促产物在405nm波长摩尔吸光系数的测定 有许多酶底物为人工合成的“色素原”底物，其本身无色，经酶作用后释放出有色的反应产物，在405nm波长具有吸收峰。ALP底物磷酸对硝基苯酚 (

35、4-Nitrophenyl phosphate，4-NPP) 经酶作用后释放出黄色的对硝基苯酚(4-Nitrophenol，4-NP)GGT底物-L-谷氨酰对硝基苯胺(-L-Glutamyl-p-nitroanilide)或-L-谷氨酰-3-羟基-对硝基苯胺(-L-Glutamyl-3-carboxyl-p-nitroan)经酶作用后释放出黄色的对硝基苯胺(p-Nitroaniline，4-NA)或对硝基-5-氨基苯甲酸(2-amino-nitrobenzoicacid， ANBA)。 临床生物化学常用技术83（2）“色素原”酶促产物在405nm波长摩尔吸光系数的测定以对硝基苯酚的摩尔吸光系数

36、测定为例试剂： 4-NP标准储存液(1Ommo1/L) 4-NP标准应用液(2.5mmo1/L，以0.84mol/L AMP缓冲液稀释而成) 底物缓冲液(l5mmol/L 4-NPP配于0.84mol/L AMP-HCL缓冲液中，37,pH l0.09土0.02)。临床生物化学常用技术84以对硝基苯酚的摩尔吸光系数测定为例试剂：临床生物化学常用技术测定方法 4-NP标准液加入量为5L，底物缓冲液加入量为350L，波长405nm，光径0.7cm，温度37，测定得吸光度为A1；另用蒸馏水代替4-NP标准液，按上述方法测定其吸光度为A2，4-NP标准液吸光度A= A1- A2，若测得A为0.460，

37、则实测4-NP摩尔吸光系数18662 临床生物化学常用技术85测定方法 4-NP标准液加入量为5L，底自动生化分析仪的校准方法1、K因素法：又称标准化法或线性法，当物质的浓度与吸光度成正比时选用该法。原理：浓度=因素吸光度2、非线性法：又称曲线拟合法，或称为多点定标。临床生物化学常用技术86自动生化分析仪的校准方法1、K因素法：又称标准化法或线性法，校准K值注意事项 酶活性校准品经校准操作后由分析仪自动计算得出。在进行酶学测定时，如果分析条件的变化如温度、样品试剂加量和吸光度检测偏差可同等程度地影响校准物和待测样品，则使用校准品能进行补偿。一般来说以使用校准K值为好，但必须有两个先决条件：必须

38、使用配套的试剂；必须使用配套的高质量的校准品，该校准品应具有溯源性。 临床生物化学常用技术87校准K值注意事项 酶活性校准品经校准操作后由分析仪自（四）透射比浊法(多点校准) 抗原与相应的抗体结合形成的免疫复合物，在反应液中具有一定的浊度，可由一般分光光度法进行透射比浊（transmission turbidimetry）测定，可用于某些蛋白质和药物浓度等的测定。该法须做多点校准，再经非线性回归，求出抗原或抗体的含量。 临床生物化学常用技术88（四）透射比浊法(多点校准) 抗原与相应的抗体结合二、常用生化检测项目分析方法举例 1终点法检测 常用的有总胆红素（氧化法或重氮法）、结合胆红素（氧化法

39、或重氮法）、血清总蛋白（双缩脲法）、血清白蛋白（溴甲酚氯法）、总胆汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法）、总胆固醇（胆固醇氧化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、高密度脂蛋白胆固醇（直接测定法）、钙（偶氮砷法）、磷（紫外法）、镁（二甲苯胺蓝法）等。 临床生物化学常用技术89二、常用生化检测项目分析方法举例 1终点法检测 常2二点速率法苦味酸法测定肌酐采用此法。 临床生物化学常用技术902二点速率法苦味酸法测定肌酐采用此法。 临床生物化学常用3连续监测法 对于酶活性测定一般应选用连续监测法，如：丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、谷氨氨酰基转移酶、

40、淀粉酶和肌酸激酶等。一些代谢物酶法测定的项目如：脲酶偶联法测定尿素等，也可用连续监测法。 临床生物化学常用技术913连续监测法 对于酶活性测定一般应选用连续监测法4透射比浊法 透射比浊法可用于测定产生浊度反应的项目，多数属免疫比浊法，载脂蛋白、免疫球蛋白、补体、抗“O”、类风湿因子，以及血清中的其他蛋白质如前白蛋白、结合珠蛋白、转铁蛋白等均可用此法。 临床生物化学常用技术924透射比浊法 透射比浊法可用于测定产生浊度反应的第三节 分析参数 (analysisparameter）设置 封闭式生化分析仪：各种测定项目的分析参数大部分也已设计好，存于磁盘中，供用户使用。开放式生化分析仪：用户可以更改

41、这些参数。生化分析仪一般另外留一些检测项目的空白通道，由用户自己设定分析参数。临床生物化学常用技术93第三节 分析参数 (analysisparame一、分析参数介绍（一）必选分析参数 1试验名称（test code）2方法类型（也称反应模式）(assay mode)3反应温度4主波长（primary wavelength） 5次波长（secondary wavelength）双波长优点：减少噪音；减少杂散光；减少样品本身光吸收噪音：从光源到比色杯、单色器及检测器的整个光路系统中，均存在着随时间发生变化的不稳定的检测信号，即噪音。临床生物化学常用技术94一、分析参数介绍（一）必选分析参数 1试

42、验名称（test6.反应方向（response direction） 7样品量（sampling volume） 常量、减量和增量。8第一试剂量 （first reagent volume） 一般20-300l9第二试剂量（second reagent volume）同上。10总反应容量（total reacting volume） 一般180-350l，个别仪器能减少至120l。反应时间11孵育时间（incubate time）12延迟时间（delay time）临床生物化学常用技术956.反应方向（response direction） 临床生13分析时间 ：参数设定中最重要的一部14校准

43、液（calibrator）个数及浓度 15校准K值（calibrate coefficient）或理论K值16线性范围（linearity range）17小数点位数（decimal point digit） 临床生物化学常用技术9613分析时间 ：参数设定中最重要的一部临床生物化学常用技术参数设置举例1、某生化分析仪有关参数设置的范围：样品格235ul,第一和第试剂量均为20270ul 总反应体积180350ul，吸光度监测验18s，总反应时间为10min，各试剂可加入时间：1.5min,4.5min,9.5min.2、肌酸激酶试剂盒通用参数：样品50ul，第一试剂1000ul，37保温5m

44、in，加第二试剂500ul，延滞时间2min，在340nm读第一点吸光度，连续监测2min。临床生物化学常用技术97参数设置举例1、某生化分析仪有关参数设置的范围：样品格23根据以上条件进行参数设置（1）按比例减少样品和试剂的剂量，使反应总体积在180350ul范围内。选择样品质10ul，第一试剂200ul，第二试剂100ul，总体积310ul。（2）确定第二试剂加入时间：根据通用参数，应选择4.5min为第二试剂加入点.(3)确定各个吸光度选择点:由于第二试剂的加入点是4.5min,换算成监测周期为第1617之间,加上延滞时间2min,则在第24监测点为第一点吸光度,并连续监测量2431监测

45、点.临床生物化学常用技术98根据以上条件进行参数设置（1）按比例减少样品和试剂的剂量，使计算K值:根据样品量度10ul,第一试剂200ul,第二试剂100ul代入计算公式,则 K=也可以采用肌酸激酶的校准品,执行校准程序来得到校准方程:K=校准品浓度/校准品吸光度临床生物化学常用技术99计算K值:根据样品量度10ul,第一试剂200ul,第二试剂第四节自动生化分析仪 工作过程和操作方法 一、工作过程 在测定过程中所有机械步骤均由微处理器根据已设定的程序（procedure）进行工作。临床生物化学常用技术100第四节自动生化分析仪 工作过程和操作方法 一、工1取样加试剂和混匀2保温反应和吸光度检

46、测3计算并显示或打印结果临床生物化学常用技术1011取样加试剂和混匀2保温反应和吸光度检测3计算并显示或二、操作方法 （一）操作前的各项检查（1）正常开机以后，检查冲洗用水装置是否正常、各项分析试剂是否充足、各种清洗剂是否足够，以及样品针、试剂针和搅拌棒是否清洁。（2）确认要进行校准的项目，确认要做的质控批号及项目，以及校准品、质控品是否足够。（3）进行光度计自检来确认光路与检测系统是否处于正常工作状态。 临床生物化学常用技术102二、操作方法 （一）操作前的各项检查临床生物化学常用技术10（二）校准 分析仪在样品分析之前都要对该分析项目进行校准（也称定标），得出一个该项目的校准系数（K）。校

47、准前首先必须在反应程序里设定有关校准的参数，如校准液的代码、位置及浓度值等。执行校准程序，检测得到该校准品的吸光度值，再根据校准浓度计算校准系数（K=校准品浓度/校准品吸光度）。 临床生物化学常用技术103（二）校准 分析仪在样品分析之前都要对该分析项目1校准方式 有单点校准、两点校准和多点校准单点校准：校准曲线呈直线且通过原点，用单个浓度的校准液即可，两点校准：若校准曲线呈直线但不通过原点，则需用两个浓度的校准液做两点校准；多点校准：当校准曲线不呈直线而为真正的曲线时，应做多点校准，并按其线形选择不同的曲线方程进行拟和，如双曲线、抛物线、幂函数、指数函数、对数函数等方程等。 临床生物化学常用

48、技术1041校准方式 有单点校准、两点校准和多点校准临床生物化学如有下列情况发生时，必须进行校准： 改变试剂的种类或批号； 仪器或者检验系统进行一次大的预防性维护 或者更换了重要部件； 质控反映出异常的趋势或偏移，或者超出了 实验室规定的接受限。 临床生物化学常用技术105如有下列情况发生时，必须进行校准：临床生物化学常用技术105（三）质控品测定 质控是保证检测结果可靠性的一个重要手段，因此每批样品的分析测定均应该有质控样品同时监测。关于分析仪的批测定，是指一批样品从开始测定到完成测定后停止的整个过程。其中如果进行了添加或更新试剂、进行了有可能改变吸光度的维护等操作，均应进行一次质控样品的检

49、测，以便及时监测到分析系统的改变。 临床生物化学常用技术106（三）质控品测定 质控是保证检测结果可靠性的一个重要 所有分析仪都已设定或固化了有关质控的分析程序：设定有关质控参数，如每个质控品的批号、靶值和标准差；选择质控图的方式，如均值标准差质控图；质控结果的统计分析，分析仪会保存每次测定的质控结果，并对其进行统计，以列表及质控图的形式在屏幕上显示。临床生物化学常用技术107 所有分析仪都已设定或固化了有关质控的分析程序： 可根据质控结果在质控图上的位置判断其是否在控。如果判为失控则应从试剂、质控品、校准品和分析仪等几方面寻找原因。通过对质控结果的分析，可以了解某项目的分析精密度和准确度的改

50、变。临床生物化学常用技术108 可根据质控结果在质控图上的位置判断其是否在控。如果（四）检测项目的输入与测定 1项目输入（1）逐项输入：每份样品可以任选分析仪中已设置的且试剂室内已预置试剂的项目中的一项、几项或全部项目。临床生物化学常用技术109（四）检测项目的输入与测定 1项目输入临床生物化学常用技术（2）项目组合输入：把与疾病相关的检验项目 组合在一起，进行组合检验，这有利于方便病人，有利于疾病的诊断和预后分析，同时也简化了分析操作，提高分析效率。（3）批量输入：对于有连续相同测定项目的样品，可使用批量输入的方法。 临床生物化学常用技术110（2）项目组合输入：把与疾病相关的检验项目临床生

51、物化学常用技 多数全自动分析仪的操作非常方便，在开始测定画面，输入该批第一个样品的样品号，分析仪即会自动逐个地对样品进行测定。一般在开始画面还可选择： 是否需要对结果超过设定的线性范围、超过允许的吸光度上限等的样品自动进行重复测定； 测定结果是否需要按照已设定的打印格式自动打印与测定结果有关的选项。 2进行测定临床生物化学常用技术111 多数全自动分析仪的操作非常方便，在开始测定画面，输入3急诊检验 几乎所有全自动生化分析仪都具备“急诊优先”的功能，仪器留有急诊样品的分析位置或专用样品架以或急诊分析的专用编号。一旦在急诊样品位置上放置了样品，并设定了急诊检验的项目，分析仪就会在常规样品的测定过

52、程中，优先安排对该样品进行分析测定。 临床生物化学常用技术1123急诊检验 几乎所有全自动生化分析仪都具备“急诊优先”四 自动生化分析仪性能评价1自动化程度2、分析效率3、应用范围4、分析的准确度临床生物化学常用技术113四 自动生化分析仪性能评价1自动化程度临床生物化学常用技二、分析仪性能指标 （一）准确度吸样、加试剂、温控准确度，以及光路系统如波长、检测器准确度和波谱带宽等，都影响检测准确度，这些因素往往使相同项目的检测结果向同一方向偏离。有关这些准确度的指标通常无具体说明，但可以通过相应的实验来检测。应当说多数分析仪对有关这些部件的制作及其工作的准确度比手工操作及其所用的仪器好得多。 临

53、床生物化学常用技术114二、分析仪性能指标 （一）准确度临床生物化学常用技术114（二）精密度以上影响准确度的因素同样可因其制作不精而使工作稳定性较差，造成精密度不佳，吸样精度以及样品针、试剂针、搅拌棒、反应杯的交叉污染是影响精密度的主要因素，有关分析仪的资料中通常会介绍防止和减少交叉污染的措施，主要是其冲洗系统各有特点，冲洗效果可能不同。 临床生物化学常用技术115（二）精密度临床生物化学常用技术115（三）检测能力 1检测方法多数分析仪能做终点法、固定时间法、连续监测法和透射比浊法。 2检测时间分析仪通常可检测最长10min的反应，个别最长能检测15-22min甚至更长。 3. 加试剂次数

54、能加1-4种试剂，多数为2种。 临床生物化学常用技术116（三）检测能力临床生物化学常用技术1164. 检测范围 能检测吸光度的最高值及其准确度决定检测上限；检测灵敏度则为能辨别待测物最小浓度差的能力，有时与最低检出浓度一致，但后者主要取决于方法灵敏度。临床生物化学常用技术1174. 检测范围临床生物化学常用技术117（四）速度影响分析速度的因素，包括本节一中所述的试剂瓶数、取样周期、反应杯数量、一次可容纳样品数量、试剂瓶容量和模块组合能力等。（五）检测成本反应杯类型和寿命决定其耗费，最小样品量影响试剂用量，最小反应杯液量可决定样品和试剂用量，以及保养维护消耗。临床生物化学常用技术118（四）

55、速度临床生物化学常用技术118第五节、其他检验技术自学为主临床生物化学常用技术119第五节、其他检验技术自学为主临床生物化学常用技术119四、干化学式自动生物化学分析仪 多采用以Kubelka-Munk理论为主要理论基础的多层薄膜的固相试剂技术，仅需将样品加在固相试剂上进行测定。它不同于大家所熟知的在反应容器中加入液态试剂和样品,混合后发生物化学学反应的“湿化学”(wet chemistry), 所以“干化学”是相对于经典的“湿化学”而言。 干化学式分析仪是80年代问世的，其采用干化学（dry chemistry）方法，将发生在液相反应物中的反应，转移到一个固相载体上，利用分光检测系统进行检测

56、的一类新型仪器。（一）工作原理临床生物化学常用技术120四、干化学式自动生物化学分析仪 多采用优点：它完全脱离了传统的采用试管和吸管的分析方法，仪器操作简便，测定速度快，灵敏度和准确度与典型的分立式仪器相近。 原理分类：干化学分析仪大都采用反射光度法(reflectance spectroscopy)和基于离子选择电极(ion selective electrode，ISE)的差示电位法(differential potentiometry)及近几年出现有采用荧光光度计的干化学分析仪。临床生物化学常用技术121优点：它完全脱离了传统的采用试管和吸管的分析方法，仪器操作简（二）仪器的类型及特点一

57、种是使用试条的反射光度法系统（reflotron system）；另一种是采用胶片涂层技术的化学分析系统（vitros chemistry system）， 采用的是干试剂包进行临床化学分析，常称为袋式分析仪。 临床生物化学常用技术122（二）仪器的类型及特点一种是使用试条的反射光度法系统（ref1反射光度法系统 ：每一个检测项目都有各自专用的试剂条，由3个主要部分组成， 密码磁带：位于剂试条背面,是该项目的全部检测程序,存贮了全部方法学所必需的资料,包括:英文缩写符号、测试范围、血浆分离时间、波长选择、反应时间、换算因数和误差自检等,插入后即传送给微机。血浆分离区：位于正面下部并标以红色,由

58、玻璃纤维和纸层构成。反应区：位于试剂条的正面上部。试剂条日常贮存在密封的盒内,每条的表面贴有一层锡箔,使用时再揭去。临床生物化学常用技术1231反射光度法系统 ：每一个检测项目都有各自专用的试剂条，由血浆运输层试剂层反应层密码磁带血浆分离区辅助试剂层外膜层干试条的组成临床生物化学常用技术124血浆运输层试剂层反应层密码磁带血浆分离区辅助试剂层外膜层干试测定过程首先定量指尖肝素化毛细血管血或任何部位的穿刺血标本加在红色的血浆分离区上。首先通过玻璃纤维层，红、白细胞被阻截，血浆被过滤到血浆分离区，另有辅助试剂层，当血浆层中的血浆溶解渗透辅助试剂层后，通过转移介质层将血浆运送到反应区的底部。此时仪器

59、给反应区施加400Pa的压力，此时，试剂层2、试剂层1和透明片相继平贴于转移介质层(亦称血浆池)之上。血浆中的待测物与干试剂相作用而呈色并显示检测结果，全部过程均在接受密码信号后的微机控制下完成。临床生物化学常用技术125测定过程首先定量指尖肝素化毛细血管血或任何部位的穿刺血标本加2胶片涂层技术的化学分析系统该干式化学系统使用的是试剂片（块），它采用的是胶片涂层技术,各种反应都在干片(多层膜片)内进行。 工作原理：应用涂层技术制作胶片基础的感光乳剂，将其均匀呈层状地涂布在支持层或下层上。在该干片中多涂层被置于一张透明聚酯片基上,然后夹在一个塑料壳中间，共有4个功能层：即分布层，接受样品；两个中介层，以改变样品的物理化学性质；一个指示剂层,对待测物进行定量。其层数视所采用的分析方法而定，干片的大小与一枚邮票大致相同，指示剂层呈现的颜色深浅随待测物的浓度变化而变化。临床生物化学常用技术1262胶片涂层技术的化学分析系统该干式化