一代测序常见问题解决策略

1、合用文档测序常有问题及解决策略一、PCR常有问题假阴性，不出现扩增条带PCR出现假阴性结果，可从以下几个方面来搜寻原因：1）模板：模板中有杂蛋白；模板中有Taq酶控制剂；在提取制备模板时扔掉过多；模板核酸变性不完整。2）酶：酶失活或反应时忘了加酶。3）Mg2+浓度：Mg2+浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。4）反应条件：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。5）靶序列变异：靶序列发生突变或缺

2、失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。假阳性假阳性：出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。常有原因有：1）引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，所以在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列很短或引物很短，简单出现假阳性。需重新设计引物。2）靶序列或扩增产物的交织污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交织污染，以致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防范将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列

3、短，但有必然的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而以致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减少或除掉。出现非特异性扩增带PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，也许同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物文案大全合用文档与靶序列不完满互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。三是酶的质和量，经常一些本源的酶易出现非特异条带而另一本源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一本源的酶。降低引物量，合适增加模板量，减少循环次数。合

4、适提高退火温度或采用二温度点法。出现片状拖带或涂抹带PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因经常由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一本源的酶。减少dNTP的浓度。合适降低Mg2+浓度。增加模板量，减少循环次数。二、一代测序结果常有问题及解析原始数据图片为：文案大全合用文档图1解析后无搅乱峰的老例序列图为：图2常有问题有：钉子峰图3产生原因：样品或毛细管内有气泡或灰尘、结晶等固体小颗粒反射激光，所文案大全合用文档以信号很高，而且所有波长（4色）都有。解决方法：灌胶时不要产生气泡；使用过的毛细管在取下

5、一段时间后，重新安装前要冲刷；要经常擦去灰尘；样品纯化干净。PCR产物测序时出现重叠峰1）单一位点（图4）或两个位点（图5）的碱基缺失以致测序结果移码图4图5产生原因：碱基缺失态有在PCR产物中，特别是从基因组中扩增获取的PCR片段，如上图所示，单一位点或两个位点的缺失会以致测序结果移码，影响碱基的判读。解决策略：将PCR产物克隆到质粒（如T载体）中挑单克隆测序，或将PCR产物进行PAGE纯化（最少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序。或使用反向引物连续测序，以更正缺失位点并达到测通的目的。若是可以确定该PCR片段中不应该出缺失的位点，那么可以改变PCR反应条件，重新扩增。2）测序引物碱基缺

6、失文案大全合用文档图6产生原因：测序引物有碱基缺失（一般是引物的5端缺失），和模板的碱基缺失有些近似，所不相同的是模板碱基缺失一般是在一段正常测序序列后才出现移码，而引物碱基缺失的话，则从测序一开始就出现移码，表面在图形上即是一开始就是严重的峰形重叠。解决策略：重新合成引物，或将引物进行PAGE纯化。克隆测序时出现峰形重叠图7产生原因：所优选的重组子不是单克隆，所供应的测序用质粒中含有两种以上插入片段不相同的质粒；或是送测序的菌液污染。解决策略：重新挑单克隆的菌落（划线分别单菌落），提质粒或送菌液再次测序。样品有杂合/突变位点文案大全合用文档图8产生原因：范本中有杂合型突变，也就说范本自己在这

7、个位点出现突变；或者是从基因组中扩增出来的杂合位点。若是范本有杂合突变或缺失，那么测序图形中其他的位点一般都是单一的峰形，尔后突然在某一个点出现重叠峰(如图中箭头所示)。解决策略：建议将DNA片段克隆到载体再测序。5.PolyA/T结构图9图10文案大全合用文档产生原因：如图9、10所示，在PolyA/T结构出现后，测序酶简单在模板上滑动，以致PolyA/T结构后的峰形变得纷乱，出现移码现象。解决策略：使用反向引物对模板进行测序，测到该poly结构处，即可完成模板全长的拼接。G/C特别结构区图11产生原因：序列中存在一个GC特别结构区，在该地域后，信号迅速减弱。上图的下半部分是对测序反应进行优

8、化后的测序结果，在GC特别结构后，测序信号获取必然程度的改进，但是离一般的测序结果还是相差甚远。解决策略：针对该种类的模板，一般应从反向进行测序，尔后在该特别结构区周边将两个方向的测序结果拼接起来，获取完满的序列。基因中含有重复序列文案大全合用文档图12产生原因：样品中含有重复序列以致的测序结果和PolyA/T的结果相同，会以致复制框滑动，较短的重复序列会以致测序结果出现移码；而较长的重复序列会使信号衰减。解决策略：反向测序有时可以顺利的经过重复序列地域(但不是必然都可以)，经过多次的测序结果比对，拼接可以获取全序列结果。8.背景峰杂1）模板杂图13产生原因：与目的片段条带大小只相差几个碱基的

9、非特异性PCR扩增产物是无法用肉眼区分开的。但是DNA测序反应敏感而客观，可以直接反应出模板自己的情况。如上图所示，该反应的背景信号较高，不利于碱基的判读。解决策略：改变PCR条件，重新扩增。也许可以将该PCR产物克隆到质粒中，初步优选后进行单克隆测序。文案大全合用文档2）引物不纯图14产生原因：引物不纯造成移码现象，与模板杂在峰图上均表现为背景峰杂，但是引物不纯在峰图上表现的更有规律，一般在每一个主峰前都有一个同一碱基的小峰。解决策略：重新合成引物，也许将引物进行PAGE纯化后再进行测序。模板不仅调1）菌液为非单克隆文案大全合用文档图15产生原因：上图是pGEM-T载体测序的结果，在83位点

10、处测序结果出现双峰，即测序结果在载体部分很正确，而进入插入片段后出现双峰的情况。这是由于在接种时没有挑单菌落以致的，当两个以上的正常的克隆（插入片段方向相反），或正常克隆与空载体混在一起，而经过酶切和PCR判断很难看出异常，特别在T-A克隆时经常碰到。解决策略：重新涂平板挑单菌落测序。需要注意的是，重新进行PCR反应也许酶切判断仅能证明该克隆含有插入片段，其实不足以证明模板的单一。2）PCR产物不纯文案大全合用文档图16产生原因：在197bp前测序峰表现为杂或有明显套峰，且在197bp地址有一个高高的A峰，这个A峰标志住此PCR产物中有一个片段大小为200bp左右的小片段。（注：PCR产物测序

11、都是以A巅峰停止。）解决策略：对PCR产物切胶纯化，再进行测序。回文结构文案大全合用文档图17产生原因：位点94至137是一个回文结构，该结构以致后边的信号衰减，出现错误的判读。解决策略：使用反向引物对模板进行测序，测到该回文结构处，即可完成模板全长的拼接。酒精峰和染料峰图18产生原因：Bigdye测序反应试剂盒（BDT）中的bigdyemix稀释过分出现染料峰，纯化的酒精没有挥发干净则会出现酒精峰，一般情况下这样的峰形出现在前200bp的某部分，大部分情况下是不影响测序结果的。解决策略：重新安排反应。测序一开始就出现双峰文案大全合用文档图19产生原因：样品自己被污染，这经常发生在样品为质粒和

12、菌液的情况中。当使用通用引物测序时，若是恰好和样品中的几个质粒均能结合，那么就会出现这种情况，而且在同一地址上还可能有不仅两个峰形。样品不是单一模板，这经常发生在样品为PCR产物的情况中。平时PCR样品含非特异性扩增，存在两条分子量很凑近，采用琼脂糖电泳无法分开的条带，在测序时简单发生这种情况。样品中存在两个引物结合位点，这经常发生在样品中存在重复序列的情况下。当引物恰好设计在重复序列中时，那么在重复序列以外的部分就会出现双峰的情况。解决策略：划平板挑取单克隆测序；优化PCR系统也许克隆后测序；采用特异性引物。PCR测序结果出现N值图20产生原因：该结果信号很强，峰型整齐，但是在该测序结果中有多个地址有重叠峰，出现N值。造成该情况的主要原因很可能是该PCR产物中有突变体的存在。在每个突变位点上有一个重叠的峰，由于仪器无法正确鉴别该处的碱基，就只能以N值代替。解决策略：