蛋白质分离纯化步骤

1、一、蛋白质分别纯化的一般原则大多数蛋白质在组织细胞中都是和核酸等生物分子结合在一起 程序以获得高纯度的制品。且分别的关键步骤、根本手段还是共同的。蛋白质提纯的目的是增加产品的纯度和产量 性。因此，要分别纯化某一种蛋白质，首先应选择一种含目的蛋白质较丰富的材料。其次， 04 要设法除去变性的蛋白质和其它杂蛋白，从而到达增加纯度和提高产量的目的。二、分别纯化蛋白质的一般程序分别纯化蛋白质的一般程序可分为以下几个步骤：一材料的预处理及细胞裂开方法有：机械裂开法这种方法是利用机械力的剪切作用匀浆器、研钵等。渗透裂开法这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而裂开。反复冻融法那些对温度变化敏感的蛋白质不宜承受此法

2、。超声波法使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞裂开。酶法如用溶菌酶破坏微生物细胞等。(二) 蛋白质的抽提pH 一般要参加外表活性剂tritonX-100 等，使膜构造破坏，利于蛋白质与膜分别。在抽提过程中，应留意温度，避开猛烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。(三蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分别开来依据蛋白质溶解度的差异进展的分别。常用的有以下几种方法：等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分别。盐析法不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其自然性质，并能再度溶解而不变性。有机溶剂沉淀法变性，使用该法时，要

3、留意在低温下操作，选择适宜的有机溶剂浓度。四样品的进一步分别纯化析、亲和层析等等。有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品。凝胶过滤层析凝胶过滤层析gel-filtration chromatography又称为分子排阻层析或分子筛层析。它是将葡聚糖凝胶Sephadex装入一个柱子中，制成凝胶柱。这种凝胶颗粒具有分子大小不同，进入网孔的程度不同，因此流出的速度不同，洗脱所用体积准时间不同，从而到达分别的目的。纤维素柱层析法该法是利用蛋白质的酸碱性质作为分别的根底。离子交换纤维素celluloseion-exchanger是人工合成的纤维素衍生物，它具有松散的亲水性网状构造，有较

4、大的外表积，使蛋白质大分子可以自由通过。因此常用于蛋白质的分别。1羧甲基纤维素CM-纤维素在纤维素颗粒上带有羧甲基基团。在中性pH 条件下，羧甲基上的质子可解离下来图 2-27a，而溶液中带正电荷的蛋白质分子可与纤维素颗粒上的羧甲基负电荷结合。可 小取决于彼此间相反电荷基团之间静电吸引。(2二乙氨基乙基纤维素DEAE-纤维素在中性pH可交换的基团带负电荷，因此是一种阴离子交换剂。当某一蛋白质混合溶液通过装有DEAE- pH 和离子强度的缓冲液进展洗脱，转变蛋白质分子所带的静电荷，依次从层析柱流出到达相互分别的目的。亲和层析亲和层析affinity-chromatography分别技术是依据很多

5、蛋白质对特定的化 配基或配体ligand。亲和层析是一种极有效的分别纯化蛋白质的方法。例如酶对它的底物具有特别的亲和力；抗原和抗体互为配基。以伴刀豆球蛋白Aconcanavalin A的分别纯地连接到像琼脂糖凝胶一类的载体外表上或称为间隔臂， spacerarm，使配体与载体之间保持足够的距离。将这种多糖颗粒装入肯定规格的玻璃管中就制成了一根亲和层析柱合而被吸附到柱上，其他蛋白因不能与葡萄糖配基结合将通过柱子而流出图2-28a。然它蛋白质分别的目的。 三、蛋白质分子量的测定蛋白质分子量测定的方法很多，目前常用的方法有以下几种。一凝胶过滤法凝胶过滤法测定蛋白质分子量的原理如“分别纯化方法”中所述

6、 后能够进入颗粒的蛋白质也按分子量大小而先后被洗脱下来 应的分子量来。二SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定分子量蛋白质在一般聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度取决于蛋白质分子大小量以及分子外形。而SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳与此不同的是在样品及电泳缓冲液中参加了 十二烷基硫酸钠sodium dodecyl sulfate,SDS。SDS变性并解离成亚基。当蛋白质样品中参加SDS0.1后，SDS量，因而掩盖了不同蛋白质之间的电荷差异。全部结合SDS-SDS了蛋白质之间原有的电荷和外形的差异，电泳的速度只取决于蛋白质分子量的大小。下电泳，依据测得的样品相对迁移率，从标准曲线上便可查出其分子量。三沉降法蛋白质颗

7、粒在离心场中的沉降速度用每单位时间内颗粒下沉的距离来表示。离心力减去浮力与溶剂的摩擦力平衡时，每单位离心场强度的沉降速度称为沉降系数Sedimentation Coefficient。国际上承受Svedberg 单位作为沉降系数的单位，用S 表示，以纪念超速离心法的创始人，瑞典有名的蛋白质化学家T.SvedberSvedberg或直接称一个为11013。110132001013s1S200S。蛋白质分别纯化的一般程序可分为以下几个步骤：一材料的预处理及细胞裂开活性。所以要承受适当的方法将组织和细胞裂开。常用的裂开组织细胞的方法有：机械裂开法这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞裂开。常用设备有

8、，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。渗透裂开法这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而裂开。反复冻融法敏感的蛋白质不宜承受此法。超声波法使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞裂开。酶法(二) 蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应依据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要参加外表活性剂十二烷tritonX-100，使膜构造破坏，利于蛋白质与膜分别。在抽提过程中，应留意温度，避开猛烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。三蛋白质粗制品的获得差异进展的分别。常用的有以下几种方法：等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分别。2. 盐析法2. 盐析法不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调整盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其自然性质，并能再度溶解而不变性。3. 有机溶剂沉淀法中