细胞融合精品课件

1、关于细胞融合第一张，PPT共七十八页，创作于2022年6月 又称体细胞杂交(Somatic hybridization) 是指将不同来源的原生质体（细胞）相融合并使之分化再生、形成新物种或新品种的技术。51 细胞融合的定义第二张，PPT共七十八页，创作于2022年6月第三张，PPT共七十八页，创作于2022年6月 人们很早就发现在生物界中有自发的细胞融合现象。我们知道，无论是远缘杂交还是利用多倍体技术都要先实现有性杂交，而亲缘关系较远的物种间杂交往往表现为杂交不亲合或不能受精或是胚胎早期败育。 克服远缘杂交中的不亲和障碍；优良性状改良组合起各种植物的优良遗传性状，从而培育出理想的新品种。52

2、细胞融合的意义第四张，PPT共七十八页，创作于2022年6月 进行体细胞融合就可以避开生殖细胞的受精过程。避免上述种种麻烦，从而在亲缘更远的物种间实现基因转移，创造出自然界中所没有的新物种。 例如，马铃薯和番茄通过细胞融合得到了至今有性杂交未能获得的属间杂种薯番茄和番茄薯。第五张，PPT共七十八页，创作于2022年6月 许多研究人员成功地进行了不同植物的细胞融合，并培养出了再生植株后，许多人开始尝试培育不同种属的超级杂交植物。年，德国的梅罗帕斯博士用细胞融合的方法培育出了马铃薯（土豆）和番茄的杂交后代薯番茄。他们先用酶液除去马铃薯、番茄的细胞壁，然后将两种去壁细胞（原生质体）等量混合，在混合液

3、中加进聚乙二醇溶液，使原生质体紧密粘聚，再用高钙和高溶液处理，结果，马铃薯与番茄两种原生质体的融合率竟高达。其中所育成的“番茄薯”新品种地上部分能结番茄，地下部分能结马铃薯第六张，PPT共七十八页，创作于2022年6月 存在问题 （1）通过融合将双亲的染色体组相加，往往会造成遗传上的不稳定，杂种细胞也不易分化成株。 (2)从野生种带进过多的不良基因第七张，PPT共七十八页，创作于2022年6月1、对于植物细胞而言，一般先得到原生质体2、通过物理或化学方法诱导细胞融合形成杂种细胞3、进行杂种细胞的分检和培养4、促使杂种细胞分裂形成细胞团、愈伤组织、直至形成杂种植株，从而实现基因在远缘物种间的转移

4、 由于这个新细胞得到了来自两个细胞的染色体组和细胞质，在适宜的条件下来培养，长成的生物个体就是一个新的物种或品系。53 基本原理及步骤第八张，PPT共七十八页，创作于2022年6月53 基本原理 新生物第九张，PPT共七十八页，创作于2022年6月 细胞可以发生融合的生物范围是很广的。到目前为止、已经在种间、属间、科间以及动植物两界之间都做过细胞融合的尝试，但只有体细胞的无性杂交才是真正意义上的细胞融合技术。第十张，PPT共七十八页，创作于2022年6月第十一张，PPT共七十八页，创作于2022年6月融 合 过 程第十二张，PPT共七十八页，创作于2022年6月 细胞融合主要经过了以下4步：两

5、原生质体或细胞互相靠近细胞桥形成胞质渗透细胞核融合其中细胞桥的形成是细胞融合最关键的一步第十三张，PPT共七十八页，创作于2022年6月541 植物或微生物原生质体的制备 植物和许多微生物细胞外有一层坚韧的细胞壁，为了促使这样细胞的融合就必须先得到单个细胞，除去细胞壁，才能获得植物原生质体或微生物原生质球 。因此时于植物和微生物细胞的融合一般又可称为原生质体融合。 54 融合材料第十四张，PPT共七十八页，创作于2022年6月 542 动物单个细胞的获得 （一）组织的获得 (二)组织的消化 第十五张，PPT共七十八页，创作于2022年6月 55 细胞融合技术 细胞融合技术 生物法 化学法 物理

6、法细胞融合的影响因素第十六张，PPT共七十八页，创作于2022年6月 物理法 主要包括显微操作、电场刺激等；化学法 主要是用聚乙二醇PEG结合高PH、高钙离子法； 生物法 有仙台病毒法等。第十七张，PPT共七十八页，创作于2022年6月 具体应用时要根据不同对象选择不同的细胞融合方法和条件。 诱导动物细胞融合 仙台病毒HVJ诱导、PEG法、电融合法都适用 植物细胞融合 常用PEG法和电融合法； 微生物细胞融合 只适用PEG法第十八张，PPT共七十八页，创作于2022年6月 我们知道很多病毒都具有凝集细胞的能力。它一边黏接在一个细胞表面，另外一边黏接在另一个细胞表面，从而使两个细胞在病毒的作用下

7、靠近发生凝结。 仙台病毒也称日本血凝病毒HVJ,属黏液病毒副流感类群，是RNA病毒，多型颗粒状，易在小鼠中蔓延。 551 生物法仙台病毒法第十九张，PPT共七十八页，创作于2022年6月 由于被感染细胞表面发生某些改变，使得这些细胞容易发生融合，甚至处死的HVJ病毒也具有促进细胞融合的作用。 日本学者冈田利用仙台病毒使两种不同的动物细胞之间发生凝集，进而融合成一体。第二十张，PPT共七十八页，创作于2022年6月 研究发现：促进细胞融合的有效部位在于病毒的膜，被超声波打碎的病毒膜片仍具有促进细胞融合的功能。 仙台病毒促使细胞融合的因素与病毒被膜上的磷脂成分有关，而与病毒内核酸的活性无关。 仙台

8、病毒被膜糖蛋白与其促融合的能力有关。在动物细胞融合中，仙台病毒(HVJ)已成为产生细胞杂种的标准融合剂。第二十一张，PPT共七十八页，创作于2022年6月 病毒促使细胞融合的主要步骤： (1)两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近 (2)通过病毒与原生质体或细胞膜的作用是两个细胞膜间互相渗透，胞质互相渗透 (3)两个原生质体的细胞核互相融合，融为一体 (4)进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色体的杂种子细胞。第二十二张，PPT共七十八页，创作于2022年6月用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程细胞核病毒颗粒细胞核第二十三张，PPT共七十八页，创作于2022年6月 55 细胞融合技术 细胞

9、融合技术 生物法 化学法 物理法细胞融合的影响因素第二十四张，PPT共七十八页，创作于2022年6月细胞融合中的化学法诱导主要包括：NaNO3诱导 NaNO3能中和原生质体表面负电荷，促进原生质体聚集，对原生质体无损害，但融合效率低。高Ca2+和pH诱导法PEG诱导PEG结合高Ca2+和PH诱导法上面几种方法中以PEG结合高Ca2+和PH诱导法最为常用，下面做重点介绍：PEG结合高Ca2+、PH诱导法第二十五张，PPT共七十八页，创作于2022年6月5521 基本原理 聚乙二醇(PEG)是一种多聚化合物，商品名卡波蜡，实验室用的PEG ，平均相对分子质量在200-2000之间，一般1000以下

10、者为液体，1000以上者为固体。 1974年人们用它诱导大麦、大豆植物原生质体融合，以后又用PEG诱导与用高Ca2+和PH诱导相结合，极大地提高了融合效率。第二十六张，PPT共七十八页，创作于2022年6月机制 由于PEG分子带有大量负电荷，和原生质体表面的负电荷在钙离子的连接下形成静电键，从而在原生质体之间形成分子桥，其结果是使原生质体发生粘连而促使原生质体的融合；另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能。第二十七张，PPT共七十八页，创作于2022年6月 用高Ca2+和PH溶液把与质膜结合的PEG分子进行洗脱，导致电荷平衡失调并重新分配，使两种原生质体上的

11、正负电荷连接起来，进而形成具有共同质膜的融合体。第二十八张，PPT共七十八页，创作于2022年6月第二十九张，PPT共七十八页，创作于2022年6月一、 基本原理 开发较晚，但目前应用广泛。 电融合必须有融合仪和融合板。 原理：在直流电脉冲的诱导下，原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位发生改变。使异种原生质体黏合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，至到闭和成完整的膜形成融合体。 物理法第三十张，PPT共七十八页，创作于2022年6月与PEG法比较，电融合法三大优点： 1、融合率高、重复性强、对原生质体伤害小； 2、装置精巧、方便简单、可在显微镜下观察或录像融合过程； 3、免去PEG 诱导后的

12、洗涤过程、诱导过程可控制性强等等。第三十一张，PPT共七十八页，创作于2022年6月电融合仪第三十二张，PPT共七十八页，创作于2022年6月本产品是一台多功能的细胞电融合和电穿孔仪，独特的交流非正弦波 使细胞双向电泳排列到一起，然后在微秒级时间内转换成直流方波使细胞融合，融合后的交流脉冲稳定杂合细胞的融合状态，大大提高了细胞融合的效率。电融合仪第三十三张，PPT共七十八页，创作于2022年6月二、 基本过程 细胞膜的接触： 当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串 膜的击穿：

13、 原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起第三十四张，PPT共七十八页，创作于2022年6月 55 细胞融合技术 细胞融合技术 生物法 化学法 物理法细胞融合的影响因素第三十五张，PPT共七十八页，创作于2022年6月一、 影响植物细胞融合的因素 植物原生质体融合无种属特异性，与其自身种属无关，故其融合效率仅与外界条件有关。 1、PEG诱导融合的关键是作用时间，尤其是高Ca2+和PH溶液处理时间长短非常重要。 时间过长，原生质体损伤严重，融合效率低 过短则不融合。 2、 PEG规格和纯度与融合效率也有关系。 细胞融合的影响因素第三十六张

14、，PPT共七十八页，创作于2022年6月 3、在电场诱导融合时，融合率与原生质体密度有关，密度小于104个/ml融合效率较低，大于106个/ml，会融合成团。 最适宜的密度是2-8104个/ml。4、在融合液中加入少量CaCI2,既可维持一定电导率，对细胞也有保护作用。 另外交变电流的强弱、处理时间长短、电脉冲大小均会影响融合率。 5 、此外，用混合盐溶液对原生质进行融合前处理，以及在促融剂中添加伴刀豆蛋白、二甲基亚砜等可提高融合率。第三十七张，PPT共七十八页，创作于2022年6月二、影响动物细胞融合的因素 在动物细胞的融合过程中，除促融剂外，细胞性质、温度、PH、离子强度、离子种类均可影响

15、细胞融合率。 1、亲本细胞表面性质影响较大，表面覆盖绒毛而不规则者容易融合，而表面光滑者较难融合。 2、细胞种类不同，融合效果也不同，如：腹水癌较易融合，而淋巴细胞、血细胞几乎不融合。第三十八张，PPT共七十八页，创作于2022年6月3、细胞融合时，需要适宜的温度和运动状态。4、细胞融合过程中，通常耗氧量大，缺氧时不融合。5、有些细胞融合时需要Ca2+否则不融合。6、最适合的PH为7.4-7.8之间，在此范围之外，不宜融合。第三十九张，PPT共七十八页，创作于2022年6月 不同的融合产物在培养条件下有着不同的命运。 未融合的原生质体和同源融合的原生质体能较快地适应培养条件而生长发育。 异源融

16、合体往往因它们发育缓慢而受到优势生长的亲本原生质体融合细胞的抑制，不易发育成杂种。因此需要通过培养和筛选，除去不需要的细胞，分离出需要的杂种细胞，从而解决融合细胞的选择问题。5.6 融合细胞的选择第四十张，PPT共七十八页，创作于2022年6月 对于如何筛选杂种细胞，尚无特定规律可循，需对不同对象设计具体的筛选方案和选择体系，优先选择杂种细胞，或只允许杂种细胞生长，以淘汰亲本细胞。5.6 融合细胞的选择第四十一张，PPT共七十八页，创作于2022年6月 最简单的选择方法是利用双亲细胞形态和色泽上的差异识别杂种细胞，但多数是根据细胞生理遗传上的特性来选择。比较常用的杂种细胞筛选方法包括： (1)

17、遗传互补筛选法：利用每一亲本贡献一个功能正常等位基因，纠正另外一亲本的缺陷，从而令杂种细胞表现正常功能的原理选择杂种细胞。如亲本1：叶绿体缺陷型亲本2：光致死型两亲本在光照下一种死亡，另一种呈白色，融合细胞长成植株呈绿色，并能成长 第四十二张，PPT共七十八页，创作于2022年6月 (2)抗体互补筛选法；利用亲本原生质体对抗生素、除草剂及其他毒性物质抗性差异来选择杂种细胞。抗性突变体或抗药性有差异的可采用这种方法。第四十三张，PPT共七十八页，创作于2022年6月 (3)生长特性筛选法：利用原生质体对培养基成分要求与反应的差异选择杂种细胞。例如：亲本原生质体生长要求外源激素，而有的杂种细胞由于

18、双亲互补作用会产生内激素，从而使杂种细胞能在无激素的培养基上生长。第四十四张，PPT共七十八页，创作于2022年6月 (5)其他方法：采用显微操作技术也能把单个异核体分离出来进行培养。因为如果是融合细胞，就必定具有与双亲本不同的荧光标记，所以科学家发明了一种普遍适用的方法，即采用无毒的荧光素标记双亲原生质体。融合后利用一种电子荧光激活选择器自动分类和选择融合细胞。 以上方法中利用选择性培养基是一个很常用的杂种细胞选择方法。第四十五张，PPT共七十八页，创作于2022年6月57 细胞融合技术的应用举例 植物原生质体融合的研究已有90 多年的历史。但现代植物细胞融合技术研究是从20世纪60年代才开

19、始的，20世纪70年代，一些科学家探讨了植物细胞杂交的内容、方法和意义，并提出具有吸引力的以番茄和马铃薯为细胞杂交亲本的细胞杂交模型，推动了原生质体融合技术研究的广泛开展。此后、逐步形成了通过细胞杂交进行作物改良的新观念 。第四十六张，PPT共七十八页，创作于2022年6月 近年来，科学家利用以细胞融合为核心技术的操作取得了很大的科研成果，杂交育种已成为培育动物新品种的一个有效手段。 如已培育出绵山羊：具有绵羊的卷曲浓密的长毛、山羊式的羊角，毛肉兼用。第四十七张，PPT共七十八页，创作于2022年6月 抗原决定簇：存在于抗原分子表面，决定该抗原特异性的特殊化学基团。 Polyclonal an

20、tibody,PcAb：针对多种抗原决定簇的混合抗体Monoclonal antibody,McAb:由单个B细胞克隆产生的针对单一抗原决定簇的同源抗体单克隆抗体生产第四十八张，PPT共七十八页，创作于2022年6月单克隆抗体的特点 1）单克隆抗体是针对单一抗原决定簇的化学结构完全相同的单一抗体，其特异性强，与其对应抗原的亲和力高度均一； 2）杂种瘤细胞株可冷冻于液氮中长期保存，所以单克隆抗体可以重复、稳定地制备，不会因批号不同而产生差异； 3）产生单克隆抗体的杂交瘤株可在体外扩大培养。单克隆抗体生产第四十九张，PPT共七十八页，创作于2022年6月 单克隆抗体技术的建立 1975年英国剑桥大

21、学分子生物学实验室科学家Kohler和Milstein将经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合，首次获得能生产单一抗体的杂交瘤细胞。与血液中的多种抗体比较，该杂交瘤细胞株能持续分泌成分单一、有特异性的抗体，即单克隆抗体。 两位科学家也因此而荣获了1984年诺贝尔生理学医学奖单克隆抗体生产第五十张，PPT共七十八页，创作于2022年6月包括： 动物免疫 细胞融合 选择杂交瘤 检测抗体 杂交瘤细胞的克隆化 冻存 单克隆抗体的大量产生要经过几个月的一系列实验步骤单克隆抗体生产第五十一张，PPT共七十八页，创作于2022年6月大致步骤如下： 首先取得抗原，注射到小鼠体内，大约注射4次，使

22、小鼠免疫并产生相应的抗体。取小鼠的血清与抗原作用，确定产生抗原-抗体反应。取出免疫小鼠的脾脏制成脾细胞悬液，与鼠骨髓瘤细胞混合，加入聚乙二醇形成融合细胞，又叫杂交瘤。单克隆抗体生产第五十二张，PPT共七十八页，创作于2022年6月它具有分泌抗体又能迅速生长的特性，称为单克隆抗体杂交株。单克隆抗体大量制备过程： 细胞融合前的准备 细胞融合与杂交瘤选择 抗体的检测与杂交瘤选择 单克隆抗体的大量生产 单克隆抗体的鉴定第五十三张，PPT共七十八页，创作于2022年6月 5.7.1.1 细胞融合前的准备 (一) 动物免疫与免疫脾细胞悬液的制备 一般经过三次免疫过程：初次免疫、第二次免疫、加强免疫。取加强

23、免疫3天后的脾脏，制备脾细胞悬液。 （二）骨髓瘤细胞的获得与培养 骨髓瘤细胞系应与免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于小鼠腹腔内产生大量McAb。第五十四张，PPT共七十八页，创作于2022年6月 在准备融合两周前开始复苏骨髓瘤细胞，利用一般动物细胞培养液，小牛血清在10%-20%，细胞最大密度不超过106/ml， 每3-5天传代一次。第五十五张，PPT共七十八页，创作于2022年6月5.7.1.2 细胞融合与杂交瘤选择 (一)细胞融合流程 1、取对数生长的骨髓瘤细胞，离心，弃上清，用不完全培养基混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。 同时制备脾细胞悬液，用不完全培

24、养液洗涤2次。第五十六张，PPT共七十八页，创作于2022年6月 2、将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10或1：5的比例混合在一起，用不完全培养液洗涤1次。离心，弃上清，用滴管吸净残留液体。 3、30s内加入预热的一定浓度、一定分子量的PEG,(聚乙二醇) ，边加边搅拌，在室温下融合。加预热的不完全液，终止PEG作用。第五十七张，PPT共七十八页，创作于2022年6月 4、离心，弃上清，用20小牛血清等轻轻混悬，将融合后细胞悬液加入96孔板，100ul孔，37、5%CO2培养箱培养。（二）HAT选择杂交瘤 一般在融合24h后，加HAT选择培养液，在HAT选择培养液中培养时，由于骨髓瘤细胞缺乏胸苷激酶

25、或次黄嘌呤鸟嘌呤核糖转移酶，故不能生长繁殖，而杂交瘤细胞具有上述两种酶，在HAT选择培养液可以生长繁殖。 维持培养两周后，改用HT培养液，再维持培养两周，改用一般培养液。次黄嘌呤胸腺嘧啶核苷氨基喋呤第五十八张，PPT共七十八页，创作于2022年6月5.7.1.3 抗体的检测与杂交瘤选择 筛选杂交瘤细胞通过选择性培养而获得杂交细胞系中仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体。检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法。 一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。第五十九张，PPT共七十八页，创作于2022年6月常用的方法有： 1)ELISA用于可溶性抗原(蛋白质)、细胞和病毒等

26、McAb的检测。 2)RIA用于可溶性抗原、细胞McAb 的检测。 3)FACS(荧光激活细胞分类仪)用于检查细胞表面抗原的McAb检测。 4)IFA（免疫荧光法）用于细胞和病毒McAb的检测。第六十张，PPT共七十八页，创作于2022年6月单克隆抗体的应用1）临床诊断及治疗：诊断各类病原体：如乙肝病毒、EB病毒等。肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原的检测如AFP、CEA等检测淋巴细胞的表面标志如CD3、4、8等“生物导弹”以McAb作为载体携带某些药物或毒素，将其携带至靶器官，从而有效地发挥药物作用，直接杀伤靶细胞。第六十一张，PPT共七十八页，创作于2022年6月单克隆抗体的应用2） 免疫学研究

27、： 签定、区分各种抗原； 检测大分子抗原上不同的抗原决定簇，鉴定各种组织之间的相容性，寻找与肿瘤或其他细胞表面抗原结合的优良试剂等； 对免疫球蛋白基因的定位及表达进行研究工作，分析免疫球蛋白的分子结构，研究免疫球蛋白基因的结构和多样性。 大分子蛋白的提纯： 利用免疫亲和层析的方法提纯的蛋白类大分子杂质低，对产物的起始浓度要求较低。第六十二张，PPT共七十八页，创作于2022年6月5.7.1.4单克隆抗体的大量生产 方法主要有两种： (1)体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从上清中获取单克隆抗体。 此方法产量低、一般培养液含量为10-60ugml如果大量生产，费用较高。 第六十三张，PPT共

28、七十八页，创作于2022年6月5.7.1.4单克隆抗体的大量生产 (2)体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清： A、实体瘤法：对数生长期的杂交瘤细胞按1-3l07个ml接种于小鼠背部皮下、每处注射0.2ml；待肿瘤达到一定大小后(一般1020天)则可采血,从血清中获得单克隆抗体含量可达到1-10mg/ml。但采血量有限。第六十四张，PPT共七十八页，创作于2022年6月 B、腹水的制备：常规是先给小鼠腹腔注射0.5ml 降植烷或液体石腊，1-2周后腹腔注射1l06个杂交瘤细胞，接种细胞7-10天后可产生腹水。密切观察动物的健康状况与腹水征象、待腹水尽可能多，而小鼠濒临死亡之前，处死小鼠，用滴管将

29、腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获110ml的腹水。也可用注射器抽取腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达5-20mg/ml，这是目前最常用的方法，还可将腹水中细胞冻存起来，复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水快、量多。第六十五张，PPT共七十八页，创作于2022年6月 5.7.1.5 单克隆抗体的鉴定对制备的McAb进行系统的鉴定是十分必要的。此对其做如下方面的鉴定：（一）特异性的鉴定（二）McAb的Ig类与亚类的鉴定（三）McAb中和活性的鉴定(四) McAb识别抗原表位的鉴定(五) McAb亲和力的鉴定 第六十六张，PPT共七十八页，创作于2022年6月5716 影响因素分析 出于制备Mc

30、Ab的实验周期长，环节多，所以影响因素就比较多，稍不注意就会造成失败。 其主要失败原因和影响因素可能有；（一）污染 包括细菌、霉菌和支原体的污染。 一旦发现有霉菌污染就应及早将污染板弃之，以免污染整个培养环境。支原体的污染主要来源小牛血清。 此外，其他添加剂、实验工作人员及环境也可能造成支原体污染。第六十七张，PPT共七十八页，创作于2022年6月5716 影响因素分析 进行支原体检查（对每一批小牛血清和长期传代培养的细胞系） 对于污染的杂交瘤细胞可以采取生物学的过滤方法，将污染的杂交瘤细胞注射于小鼠的腹腔，待长出腹水或实体瘤时，取出分离杂交瘤细胞，一般可除去支原体污染。第六十八张，PPT共七十八页，创作于2022年6月（二）融合后杂交瘤不生长在保证融合技术没有问题的前提下主要考虑下列因素 (1)PFG有毒性或作用时间过长。 (2)小牛血清的质量太差，用前没有进行严格的筛选。 (3)骨髓瘤细胞污染了支原体。 (4) HAT有问题，主要是A含量过高或HT含量不足。第六十九张，PPT共七十八页，创作于2022年6月（三