谷氨酸发酵菌

1、氨基酸发酵工艺学3谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养关键词提示菌落形态、菌体形态重要生理特征育种策略谷氨酸生产菌种制备第一节 谷氨酸生产菌棒状杆菌科(Corynebacteriaceae) 棒杆菌属 北京棒杆菌 C. pekinenseCorynebacterium 钝齿棒杆菌 C. crenatum 谷氨酸棒杆菌 C. glutamicum 百合棒杆菌 C. lilium 美棒杆菌 C. callunae 力士棒杆菌 C. herculis 小杆菌属 嗜氨小杆菌 Microbacterium ammoniaphilumMicrobacterium 节杆菌属 球形节杆菌 Arthrobacte

2、r globiformisArthrobacter短杆菌科(Brevibacteriaceae) 短杆菌属 乳糖发酵短杆菌 B. lactofermentumBrevibacterium 叉开短杆菌 B. divaricatum 黄色短杆菌 B. flvum 硫殖短杆菌 B. thiogenitalis 产氨短杆菌 B. ammoniagenes特征1.1 棒状杆菌属(Corynebacterium) 直到微弯的杆菌，一端膨大呈棒状，折断分裂形成“八”字形或栅状排列。 G+1.2 短杆菌属(Brevibacterium) 短的不分枝直杆菌。 G+1.3 小杆菌属(Microbacterium)

3、 杆状，与棒杆菌相似。 G+1.4 节杆菌属(Arthrobacterium) 培养过程中，球菌 杆菌，杆菌 球菌。G+ G- , G- G+ Corynebacterium：放线菌目中一属革兰染色阳性、不运动、非抗酸性、无芽孢的杆菌。菌体直形、弯形或多形，常呈棒状。一般不运动。好氧或兼性厌氧，化能有机营养型。进行氧化性或发酵性代谢。过氧化氢酶阳性。G+Cmo1%值为5159。 谷氨酸棒杆菌C. glutamicum基因特征GC含量类E.coli，分类属于革兰氏阳性菌策略：全序列测序 注释蛋白信息 分析异同 克隆谷氨酸合成相关基因谷氨酸生产菌株形态及生理共性细胞为球形、棒形或短杆形革兰氏染色阳

4、性，无芽孢，无鞭毛，不能运动都是需氧型 微生物都是生物素缺陷型微生物脲酶强阳性不分解淀粉、纤维素、油脂、酪蛋白以及明胶等发酵中菌体发生明显的形态变化，同时发生细胞膜渗透性的变化CO2固定反应酶系活力强异柠檬酸裂解酶活力欠缺或微弱，乙醛酸循环弱酮戊二酸氧化能力缺失或微弱还原型辅酶进入呼吸链能力弱柠檬酸合成酶、乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶以及谷氨酸脱氢酶活力强能利用醋酸，不能利用石蜡具有向环境中泄漏谷氨酸的能力不分解利用谷氨酸，并能耐高浓度的谷氨酸，产谷氨酸5%以上国内谷氨酸生产主要菌株天津短杆菌 (T613)及其突变株钝齿棒杆菌(AS1.542)用其突变株北京棒杆菌(AS1.299)及其突变株1 北

5、京棒杆菌(AS1299)的形态和生理特征(1) 形态特征 短杆至小棒状，有时微弯曲，两端钝圆，不分枝，呈多种形态。 单个、成对及“V”字形排列。 G+。胞内有横隔。不运动。无芽孢。北京棒杆菌(AS1299)的形态和生理特征(2) 培养特征 普通肉汁琼脂斜面：中间划直线培养，中度生长，菌胎线状，24h白色，48h淡黄色，颜色逐渐加深，表面光滑、湿润、有光泽，无黏性，无水溶性色素。 普通肉汁琼脂平板：菌落圆形， 24h白色，48h淡黄色，中央隆起，表面湿润、光滑，有光泽，边缘整齐且呈半透明状，无黏性，不产生水溶性色素。 普通肉汁液体培养：稍浑浊，有时表面沿管壁呈薄环状，摇动培养管，底部有粒状沉渣。

6、 普通肉汁琼脂穿刺：表面发育良好，沿穿刺线生长弱，且不向四周扩散。 明胶平板及明胶穿刺：菌落形状不规则，扁平，边缘不整齐，淡黄色。穿刺培养时，沿穿刺线生长不明显，表面发育良好。不液化明胶。 马铃薯块：培养三周仍不生长。北京棒杆菌(AS1299)的形态和生理特征(3) 生理特征 对氧的要求：好氧及兼性厌氧。 与温度的关系：菌株2637 培养生长良好，不耐高温，41 生长较弱。 pH的影响： Ph510均能生长，最适 pH67.5。 还原硝酸盐：反映强烈。 石蕊牛奶培养：7d后微产碱。 不水解淀粉。 不分解纤维素。 脲酶试验：强阳性反应。 产酸物质的测定：G、果糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖 生长因素试

7、验：生物素是必需生长因素。硫胺素明显促生长。2 钝齿棒杆菌(AS1542)的形态和生理特征 (1) 形态特征 短杆至棒状，有时微弯曲，两端钝圆，不分枝。 单个、成对及“V”字形排列。 折断分裂。 G+。胞内有横隔。不运动。无芽孢。钝齿棒杆菌(AS1542)的形态和生理特征 (2) 培养特征 普通肉汁琼脂斜面：中间划直线培养，中度生长，菌胎线状，近草黄色，表面湿润、无光泽，无黏性，不产生水溶性色素。 普通肉汁琼脂平板：菌落圆形，近草黄色， 表面湿润、光滑，无光泽，边缘顿齿状，较薄，半透明，无黏性，不产生水溶性色素。 普通肉汁液体培养：稍浑浊，表面有薄菌膜，底部有较多沉渣。 普通肉汁琼脂穿刺：表面

8、及沿穿刺线生长，且不向四周扩散。 明胶穿刺培养：表面及沿穿刺线生长。不液化明胶。 马铃薯块：培养三周仍不生长。钝齿棒杆菌(AS1542)的形态和生理特征 (3) 生理特征 对氧的要求：兼性厌氧。 与温度的关系：菌株2037 培养生长良好，不耐高温，42 不生长。 pH的影响： pH69生长良好， pH10生长微弱， pH45已不能生长。 还原硝酸盐：反映强烈。 石蕊牛奶培养：7d后微产碱。 水解淀粉。 不分解纤维素。 脲酶试验：强阳性反应。 产酸物质的测定： G、果糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖、水杨苷、七叶灵 生长因素试验：生物素是必需生长因子。3 天津短杆菌(T613)的形态和生理特征(1) 形

9、态特征 典型的短杆状，有时微弯曲，两端稍钝圆，不分枝。 单个、成对及“V”字形排列。 折断分裂。 G+。不运动。无芽孢。天津短杆菌(T613)的形态和生理特征(2) 培养特征 普通肉汁琼脂斜面：中间划直线培养，中度生长，菌胎线状、隆起，浅黄色，表面湿润、有光泽，不透明，不产生水溶性色素。 普通肉汁琼脂平板：菌落圆形，浅黄色， 表面湿润、光滑，隆起，边缘整齐，较薄，半透明，无黏性，不产生水溶性色素。 普通肉汁液体培养：浑浊，没有菌盖，表面沿管壁有一圈菌膜，底部有棉絮状和粒状沉渣。 普通肉汁琼脂穿刺：表面发育良好，沿穿刺线生长较弱，且不向四周扩散。 明胶穿刺培养：表面发育良好，沿穿刺线生长不明显，

10、不液化明胶。 马铃薯块：培养15d仍不生长。天津短杆菌(T613)的形态和生理特征(3) 生理特征 对氧的要求：好氧及兼性厌氧。 与温度的关系：菌株2637 培养生长良好，75 处理10min不再生长。 pH的影响： pH610生长良好， pH5生长微弱， pH4和pH11已不能生长。 还原硝酸盐：反映强烈。 不水解淀粉。 不分解纤维素。 脲酶试验：强阳性反应。 产酸物质的测定：G、果糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖、水杨苷、七叶灵 生长因素试验：生物素是必需生长因子。硫胺素是促生长作用。北京棒杆菌(7338)与钝齿棒杆菌(B9)的比较后提取容易，收率较高，质量较好分泌色素较多天津短杆菌(T613)与

11、钝齿杆菌(B9)的比较 T613感染噬菌体时，不能换用B9，调换7338.目前味精行业采用的主要菌株 钝齿棒杆菌B9和天津短杆菌TG-866是我国味精行业生产上的重要菌种。 二者融合子F263. S9114 华南理工大学 FD415 上海复旦大学 TG961 天津科技大学作业：列 表 比 较菌种形态特征培养特征生理特性生产特性其他北京棒杆菌钝齿棒杆菌天津短杆菌文献导航http:/search.aspx?q=Corynebacterium%20crenatum2 谷氨酸生产菌在发酵过程中的形态变化细胞壁 细胞形态 + 生物素 细胞壁过程变化斜面小，革兰氏染色浅种子大而粗壮，革兰氏染色深第一个10

12、小时大而粗壮，革兰氏染色深第二个10小时细胞形态急剧变化，伸长、膨大。非积累型积累型。16或20小时后伸长，膨大，不规则状，缺乏“V”字形排列，有的呈弯曲形，边缘颜色浅，稍模糊，有的边缘褶皱，甚至残缺不齐，菌体形态基本清楚发酵后期细胞较长，有模隔的多节花生状，产酸高。感染噬菌体后：感染时期细胞形态生产表现发酵前期菌体细胞明显减少，细胞不规则，发圆，发胖，缺乏V字形排列，细胞碎片，严重时出现拉丝、拉网，互相堆在一起，几乎找不到完整的菌体细胞。排气口二氧化碳迅速下降，相继出现OD值下跌、pH上升或不上升、耗糖缓慢 发酵中后期细胞形态不规则，边缘不整齐，毛刺状，有细胞碎片。OD值下降，泡沫多，粘度大

13、、耗糖缓慢等，补加适量营养物可适当挽救。策略：以日常维护优选为背景3 谷氨酸发酵的育种谷氨酸生产菌选择压代谢控制细胞工程基因工程诱变细胞融合高糖高谷氨酸日常菌种工作定期分纯小剂量诱变刺激高产菌制做安瓿管育种方法1 自然选育与诱变育种自然选育 诱变育种 变异幅度大于自然选育。2 代谢控制育种选育细胞膜渗透性好的突变株抗VP类衍生物选育对溶菌酶敏感突变株选育二氨基庚二酸缺陷突变株选育温度敏感突变株磷脂质磷酸甘油磷酸二羟丙酮3-磷酸甘油醛脂肪酸乙酰CoA柠檬酸酮戊二酸L-GA葡萄糖C16酸C18酸乙酸葡萄糖表活剂生物素n-石蜡油酸油酸G途径石蜡途径甘油缺陷部位表活剂拮抗部位细菌谷氨酸排泄控制部位L-

14、GAR1COCH2R2COCHOOH2COPOR3OO脂肪酸甘油磷 酸R1和R2： 烃 基R3： 乙醇胺 丝氨酸 肌苷酸 胆 碱磷脂生物素：是脂肪合成中关键酶乙酰CoA羧化酶的辅助因子，生物素限量时，就会抑制脂肪酸的合成，从而导致膜结构的不完整。青霉素诱变育种的基本过程：选择选择合适的出发菌株制备待处理的菌悬液诱变处理筛选保藏和扩大试验出发菌株：(1)要有一定的目标产物的生产能力(2)对诱变剂敏感(3)生产性能好，如生长快、营养要求低、产孢子多且早，最好是生产上自然选育的菌株。举例：根据代谢工程的基本原理,对谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)TWQ080进行逐

15、级诱变处理,最终选育出一株谷氨酸产生菌GW46-4。然后对其摇瓶发酵条件及7L罐发酵条件进行了优化,最后又对出发菌株和突变菌株的代谢流量进行了分析。主要研究内容和结论如下： (1)以本实验室保藏菌株谷氨酸棒杆菌TWQ080为出发菌株,经过紫外线(UV)和硫酸二乙酯(DES)逐级诱变处理,以高浓度糖、高浓度味精和琥珀酸为唯一碳源的平板进行定向筛选,最终选育出一株谷氨酸产生菌GW46。然后对该菌株进行了耐高温驯化,驯化过程中不断提高培养温度,经过多次驯化,育得一耐高温菌株GW46-4,在未经优化的条件下产酸92.5g/L,比出发菌株提高了31.2%。 (2)对菌株GW46-4的种子培养基及培养条件

16、进行了优化,发现最佳种子培养基配方：葡萄糖25g/L、玉米浆30g/L、磷酸氢二钾1.5g/L、尿素6g/L、硫酸镁0.4g/L；最佳培养条件：初始pH 7.0,装液量30mL/250mL。 代谢途径分析策略2 代谢控制育种策略葡萄糖丙酮酸草酰乙酸柠檬酸苹果酸乙醛酸异柠檬酸-酮戊二酸反丁烯二酸谷氨酸谷氨酸琥珀酸乙酰CoA设法阻断的代谢设法强化的代谢CO2固定柠檬酸合成酶乌头酸酶异柠檬酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶细胞膜渗透性裂解酶脱氢酶DCA使有机酸浓度升高，抑制异柠檬酸裂解酶，解除对异柠檬酸脱氢酶的抑制，转入TCA。生物素减少草酰乙酸减少乙酸减少关闭DCA琥珀酸氧化酶的能力低 积累琥珀酸，阻遏异柠檬酸

17、裂解酶，关闭DCA环。 CO2固定 PEP+CO2+GDP 草酰乙酸+GTP CO2 丙酮酸 苹果酸 草酰乙酸 CO2 NAD+ NADH+H+PEP羧化酶苹果酸酶苹果酸脱氢酶黄色短杆菌中： 进入分解途径的情况： 1 PEP浓度低（减弱亲和力）； 2 TCA中间产物浓度高（反馈抑制，防止草酰乙酸过剩。 固定CO2的情况： 1 乙酰CoA浓度增加，与F16P共同激活PEP羧化酶； 2 乙酰CoA氧化，产生的ATP抑制丙酮酸激酶。氨的导入-酮戊二酸还原氨基化天冬氨酸或丙氨酸通过氨基转移作用将氨基转给-酮戊二酸谷氨酸合成酶途径：谷氨酸合成酶对NH4+亲和力更强，不受谷氨酸反馈抑制，当NH4+浓度低时

18、循此途径。(1) 选育强化CO2固定反应的突变株选育在以琥珀酸为唯一碳源的培养基上生长快、大的菌株选育对氟丙酮酸敏感突变株选育丙酮酸缺陷、天冬氨酸缺陷突变株强化丙酮酸羧化酶基因(2) 选育减弱乙醛酸循环的突变株选育对琥珀酸敏感突变株选育不利用乙酸的突变株通过基因工程技术使异柠檬酸裂解酶活力降低(3) 选育强化TCA中柠檬酸至-酮戊二酸代谢的突变株选育柠檬酸合成酶强的突变株选育抗氟乙酸、氟化钠、氮丝氨酸和氟柠檬酸的突变株具体策略谷氨酸发酵的代谢控制育种策略(4) 选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反馈调节的突变株选育抗酮基丙二酸抗性突变株选育耐高谷氨酸的突变株选育抗谷氨酸结构类似物突变株选育抗谷氨酰胺突变株(5) 选育强化能量代谢的突变株选育抗呼吸抑制剂的突变株选育抗ADP磷酸化抑制剂突变株选育抗抑制能量代谢的抗生素突变株(6) 选育减弱HMP后段酶活的突变株选育莽草酸缺陷型或添加芳香族氨基酸能促进生长的突变株选育抗嘌呤、嘧啶类似物的突变株选育抗核苷酸类抗生素突变株3 细胞工程育种原生质体融合4 基因工程育种基础：已获得相关基因4 谷氨酸菌种的扩大培养斜面菌种斜面培养基必须有利于菌种生长而