SNP的理论与应用课件

1、定量PCR Taqman探针上个世纪90年代原美国Perkin Elmer( PE)公司开发出了Taqman荧光探针定量技术，将定量PCR带入了更广阔的应用空间。Taqman探针法的出现是定量PCR技术的重要里程碑，之后在此基础上发展出了杂交探针法，以及荧光引物法，是对探针法的不断改进和简化。如果希望全面掌握定量PCR技术的研究人员就不能错过这些定量检测技术。要提到荧光探针或者荧光引物，有一个基础概念需要首先明确，那就是荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)：一对合适的荧光物质可以构成一个能量供体 (donor) 和能量受体

2、 (acceptor) 对, 其中供体的发射光谱与受体的吸收光谱重叠，当它们在空间上相互接近到一定距离(110 nm)时，激发供体而产生的荧光能量正好被附近的受体吸收，使得供体发射的荧光强度衰减，受体荧光分子的荧光强度增强。能量传递的效率和供体的发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相对取向、供体与受体之间的距离等有关。定量PCR所涉及的荧光探针和荧光引物的检测都这个FRET原理相关。实时荧光中另一个很重要的概念，即Ct值。C代表循环。T代表阈值。Ct值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数反应的前个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省设置是个循

3、环的荧光信号的标准偏差的倍。研究表明，每个模板的值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数一：水解探针法TaqMan技术原理：除了一对特异性引物，TaqMan探针法增加一条和模版互补的基因特异性探针（通常2030bp），探针上5端和3端分别标记了一个报告荧光基团（供体）和一个淬灭荧光基团（受体），在反应初始（探针完整）时系统激发供体而产生的荧光信号被临近的淬灭基团吸收，所以此时检测不到供体荧光信号；而当PCR过程中Taq DNA聚合酶扩增到探针结合模版的位

4、点时，其5-3核酸外切酶的活性（也就是切口平移）切割掉探针5端的报告基团游离的报告基团远离淬灭基团，打破能量的传递，激发报告基团产生的荧光信号就可以被荧光检测系统检测到。这样每扩增一条DNA链，就对应有一个游离的荧光分子（报告基团）形成，保证了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，因此对荧光信号进行检测就可以实时监控PCR的过程，准确定量PCR的起始拷贝数。但是实际上探针较长使得两端基团距离较远，会导致荧光淬灭不彻底，而且淬灭基团也会产生不同波长的荧光，都会使得本底偏高优点：1.灵敏，特异性高：具有模版序列特异的Taqman探针在引物特异的基础上进一步提高的定量PCR的专一性；每扩增一个特异

5、产物只释放一个分子的荧光染料，仪器检测的是特异扩增的结果，非特异产物对检测信号没有影响，有效提高检测的专一性。2.有多种不同波长的荧光基团对可供选择，使得Taqman探针法可以实现在同一管内检测多重PCR，降低成本也提高效率和准确性3.避免了荧光染料对PCR反应的影响缺点：探针设计有一定难度，需要验证效果，探针的合成和双荧光标记成本高。此外，也有人认为，Taqman法利用了Taq酶的外切活性，而由于各家公司出产的Taq酶对于其外切酶活性并没有做出严格的活性标定，定量PCR的效率有可能受酶外切活性的影响，酶活性差异也给定量带来了不确定性。至少，生物通定量PCR技术系列前面介绍的Stratagen

6、e 2100万美元专利之争的Fullvelocity DNA聚合酶由于去掉外切酶活性，就不能用于Taqman探针法了！应用：Taqman技术广泛应用在人类传染病诊断和病原定量上，在动物疾病病原体基因的检测、畜禽产品的检验检疫、生物制品的鉴定以及在疫苗效力测定上等方面都有成功的许多例子。注意：1) 探针长度应在15-45bp（最佳20-30bp)左右，以保证结合的特异性。2) GC碱基含量在40%-60% ，避免单核苷酸序列的重复。3)避免与引物发生杂交或重叠。 4)探针与模板结合的稳定程度要大于引物与模板结合的稳定程度,因此探针的Tm值要比引物的Tm 值至少高出5。另外，探针的浓度，探针与模板

7、序列的同源性，探针与引物的距离都对实验结果有影响。另外，在仪器的选择上也要注意，尽量选择具有4色或以上的荧光检测通道的仪器，已保证你的机器的适用性和试剂选择的灵活性。毕竟技术是在快速发展的。我们前面提到，Taqman水解探针法中，一但报告基团水解离开淬灭基团，就一直游离于反应体系中可被检测，所以检测的是累积荧光，是不可逆的。杂交探针不同，是复性时两条特异探针杂交到模板上，相互靠近而产生检测信号，到升温变性探针远离模版就没有信号，所以检测的是实时信号，是可逆的，所以可以进行熔解曲线的分析，还可以用于进行突变分析，SNP基因分型以及产物鉴别。比如一旦探针位置上出现有点突变，通过熔解曲线就可以很快分

8、析出来，这也是Taqman法无法做到的。另外，由于采用2条模版特异的探针，杂交探针法的专一性无疑更高于其他方法，不受非特异产物的影响。Fret探针法由于需要合成2条探针，探针的末端要封闭以避免反应，所以合成的成本会比较高，也比较麻烦。但实际上，Fret探针的设计其实比Taqman探针容易，因为Taqman探针要求一定的长度以保证探针的特异性和结合模版的能力，但是长度会导致两末端的荧光基团距离远而使得荧光共振能量传递的效率降低，淬灭不彻底。Fret探针就不受这个限制。不管怎么说，多数人还是习惯认为单探针比合成2条探针要简单。在水解和杂交探针技术之间产生另外一种技术：分子信标（分子信标产生时间是1

9、996年）分子信标技术原理：分子信标（ Molecular beacon，MB）是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。荧光基团被激发后产生的光子被淬灭剂淬灭，由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。分子信标的茎环结构中，环一般为15-30bp（有人认为18-20个bp较好）长，并与目标序列互补，茎一般5-7bp长（GC含量较高），相互配对形成茎的结构。荧光基团标记在探针的一端，而淬灭剂则标记在另一端。在复性温度下，因为模板不存在时形成茎环结构，当加热变性会互补配对的茎环双链解开，如果有模板存在环序

10、列将与模板配对。与模板配对后，分子信标将成链状而非发夹状，使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，淬灭作用被解除，发出激发光子。应用：应用于基因定量分析和突变体识别、疾病基因检测与诊断、单核苷酸多态性( single nucleotide polymorphism , SNP) 分析等生物医学基础和临床研究中。优点：本底低，特异灵敏缺点：杂交时探针不能完全与模板结合，因此稳定性较差。探针合成时标记较复杂延伸技术：建立在分子信标技术基础上的探针技术有Amplifluor、Sunrise、Amplisensor、Scorpion等，其中Sunrise技术，这一方法的特点是所有的扩增产物均能标

11、记上荧光分子，因此荧光信号响应快，但无法区分特异和非特异扩增是其致命的不足。第三代、荧光引物Amplifluor技术原理：激发的荧光进行分子能量转移到受体成分导致荧光发射的淬灭。目标特异性Amplifluor引物包含一个5内部互补序列，标记有荧光发色团（fluorescerin）和一个能量受体：4-（二甲胺）氮-苯磺酸（DABSYL）。发夹结构的3端序列是目标特异性引物区。未结合的Amplifluor引物由于内部荧光发色团和淬灭分子的紧密接近，只有低的荧光信号。在第一个循环中，Amplifluor引物1与特异CDNA的第一条链退火并被Taq酶延伸。在第二个循环中 Amplifluor引物1延伸

12、产物作为引物2（反义链引物）的模板。一旦引物2被Taq酶延伸，Amplifluor发夹引物解折叠并产生荧光信号。随后的扩增循环中产生的荧光信号的增强与扩增产物量的增加成比例。LUM技术原理：LUM(light upon extention) 引物技术是Invitrogen公司的一项专利，是利用荧光标记的引物实现定量的一项新技术。使用类似分子信标的发夹结构设计引物，使引物同时起到荧光探针的作用。引物对中的一个引物3端用荧光报告基团标记。在没有单链模板的情况下，该引物自身配对，形成发夹结构，使荧光淬灭。在模板存在的情况下，引物与模板配对，发夹结构打开，产生荧光信号。使用LUX引物，不需要专门设计探

13、针，即省了成本又给实验设计提供了宽松的条件。由于没有探针控制特异性，因此他的特异性要弱于探针技术，但非特异性扩增或引物二聚体没有影响，所以其特异性要强于SYBRGREEN。看完这些方法，相信新近接触定量PCR的人就已经觉得眼花缭乱了，其实虽然以上这些检测技术有许多，但是实际上在商品成熟应用上并不是有这么多丰富的选择，具体的优良产品筛选请见：定量PCR经典之选Taqman探针科研定量PCR首选杂交探针定量检测精灵荧光引物中国的PCR达安单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）：主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类

14、可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每5001000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换（transition）或颠换（transversion）所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说的SNP并不包括后两种情况。理论上讲，SNP既可能是二等位多态性，也可能是3个或4个等位多态性，但实际上，后两者非常少见，几乎可以忽略。因此，通常所说的SNP都是二等位多态性的。这种变异可能是转换（C T，在其互补链上则为G A），也可能是颠换（C A，G T，C

15、 G，A T）。转换的发生率总是明显高于其它几种变异，具有转换型变异的SNP约占2/3，其它几种变异的发生几率相似。Wang等的研究也证明了这一点。转换的几率之所以高，可能是因为CpG二核苷酸上的胞嘧啶残基是人类基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。在基因组DNA中，任何碱基均有可能发生变异，因此SNP既有可能在基因序列内，也有可能在基因以外的非编码序列上。总的来说，位于编码区内的SNP（coding SNP,cSNP）比较少，因为在外显子内，其变异率仅及周围序列的1/5.但它在遗传性疾病研究中却具有重要意义，因此cSNP的研究更受关注。从对生物的遗

16、传性状的影响上来看，cSNP又可分为2种：同义cSNP（synonymous cSNP）：即SNP所致的编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的含义相同；非同义cSNP（non-synonymous cSNP）：指碱基序列的改变可使以其为蓝本翻译的蛋白质序列发生改变，从而影响了蛋白质的功能。这种改变常是导致生物性状改变的直接原因。cSNP中约有一半为非同义cSNP。先形成的SNP在人群中常有更高的频率，后形成的SNP所占的比率较低。各地各民族人群中特定SNP并非一定都存在，其所占比率也不尽相同，但大约有85%应是共通的。SNP自身的特性决定了它更适合于对复杂性

17、状与疾病的遗传解剖以及基于群体的基因识别等方面的研究：1、 SNP数量多，分布广泛。 据估计，人类基因组中每1000个核苷酸就有一个SNP，人类30亿碱基中共有300万以上的SNPs.SNP 遍布于整个人类基因组中，根据SNP在基因中的位置，可分为基因编码区SNPs（Coding-region SNPs，cSNPs）、基因周边SNPs（Perigenic SNPs，pSNPs）以及基因间SNPs（Intergenic SNPs，iSNPs）等三类。2、 SNP适于快速、规模化筛查。组成DNA的碱基虽然有4种，但SNP一般只有两种碱基组成，所以它是一种二态的标记，即二等位基因（biallelic

18、）。 由于SNP的二态性，非此即彼，在基因组筛选中SNPs往往只需+/-的分析，而不用分析片段的长度，这就利于发展自动化技术筛选或检测SNPs.3、 SNP等位基因频率的容易估计。采用混和样本估算等位基因的频率是种高效快速的策略。该策略的原理是：首先选择参考样本制作标准曲线，然后将待测的混和样本与标准曲线进行比较，根据所得信号的比例确定混和样本中各种等位基因的频率。4、 易于基因分型。SNPs 的二态性，也有利于对其进行基因分型。对SNP进行基因分型包括三方面的内容： （1）鉴别基因型所采用的化学反应，常用的技术手段包括：DNA分子杂交、引物延伸、等位基因特异的寡核苷酸连接反应、侧翼探针切割反

19、应以及基于这些方法的变通技术； （2）完成这些化学反应所采用的模式，包括液相反应、固相支持物上进行的反应以及二者皆有的反应。 （3）化学反应结束后，需要应用生物技术系统检测反应结果。SNP检测技术snp现有检测技术有主要的3大类别1、测序 主要发现新的snp位点和比较集中的snp位点，如hla区域，但成本较高，工作量大，不适合大样本做疾病关联分析。2、taqman探针结果比较可靠，国外文章也大量应用，不过对于国内成本偏高，同类还有snpshot技术，abi和贝克曼都相应试剂盒。成本和成功率都比taqman要低。3、snp芯片国外大规模筛查疾病关联分析常用，illumina和affy都有不同密度

20、的成熟产品，单位点成本很低，但点较多，样本多时也会很高花费，但结果准确，适合复杂疾病，有实力的项目组一般大型机器点在384-群基因组可以订制，但成本会高；illumina开发了一台小的芯片，极其适合1-384，可以订制，成本在2-5元/人点，但还没有很成熟的流程，具体效果和成功率要进一步看。剩下的就是传统方法如酶切，pcr-sscp等，也有杂志接受，但一般需要测序验证。缺点是工作量太大，结果不准确，不是所有位点都可以做，但成本很低。突变数据库Human Gene Mutation Database (HGMD) http:/www.uwcm.ac.uk/uwcm/mg/hgmd0.html T

21、he Genome Database (GD) SNP数据库Database of Single Nuleotide Polymorphisms (dbSNP) /SNP/ Human Genome Variation Database (HGVbase) http:/hgvbase.cgb.ki.se/The Snp Consortium， LTD.（TSC） / 而STR是 short tandem repeat,短串联重复，一般是CA重复，重复次数很多的。在一个人的染色体上可以有多种重复。假设A个体，来自父亲的染色体重复了10次，来自母亲的那条重复了11次，B个体来自父亲的染色体重复了8

22、次，来自母亲的那条重复了14次，那么这样说这个STR已经有四种等位基因型了，当然还有更多的。所以说 ，变异没有STR那么大。SNP功能研究进展 SNP的研究在当前仍然可以用入火如荼形容，一方面是各大数据库可以方便检索到几乎任何一个基因的SNP分布及其频率，另一方面SNP的功能研究有非常大的研究空间和前景，这应归于许多SNP的流行病关联研究重复性差，因此只有在功能上对其阐述才能解决根本问题。当前SNP功能研究主要有以下几方面：1、报告基因转染技术：这一技术主要用于研究启动子SNP对于mRNA转录效率，是通过观察转录结局来判断SNP是否具有功能。2、EMSA技术：通过在体外合成含SNP位点的寡核苷

23、酸与转录因子特异性结合，观察结合的强度和效率,但是该技术由于只人工合成较短长度的寡核苷酸，没有考虑SNP周围遗传背景环境的影响,因此在重复性和说服力上不强。3、ChiP技术：该技术通过超声将染色体碎片化,再将碎片化的核酸与转录因子的结合，最后通过PCR技术观察判断结合的效率和强度，该技术克服了EMSA的一些缺点,当前做的文献较多。Cell上的一篇文章绝对是SNP功能的经典文章，值得一看:Cell, Vol 119, 591-602, 24 November 2004A Single Nucleotide Polymorphism in the MDM2 Promoter Attenuates

24、the p53 Tumor Suppressor Pathway and Accelerates Tumor Formation in Humans,Gareth L. Bond,Wenwei Hu,Elisabeth E. Bond,etal第一个层次：实际检测应用这个层面主要是一些微生物检测，食品检测，环境监测以及一些医学临床应用（病源体检测，基因病诊断，传染病检测，微小残留病变检测等），在这些方面定量PCR与传统的方法具有相似的灵敏度，但是耗时少，需要的劳动力也少，而且它们既可以从活着的也可以从死的病原菌中检测和定量核酸，而传统的微生物方法只能检测活的病原菌。这些主要应用到的就是定量PC

25、R在核酸浓度上的简单定量，由于之前要想在分子操作过程中知道核酸的浓度，主要应用的方法是琼脂糖凝胶电泳和分光光度计，但是这两种方法前者靠主观判断，造成的偏差较大；后者很易受样品中杂质的影响。因此定量PCR 由于其灵敏度高、特异性强、无污染性和准确性等特点当然成为了首选。第二个层次：分子生物学应用检测应用和分子生物学应用都是利用了定量PCR对基因表达的检测，只不过前者是在临床实际应用上，而后者则是侧重于科学研究。在分子生物学上定量PCR的应用相当广泛，包括基因转录检测（即同一基因在不同组织中的表达差异），转基因生物检测，肿瘤耐药基因表达等在内的高通量基因表达检测（虽然Taqman相对于SYBR G

26、reen荧光染料，没有那么灵活，但是在陆续各生物技术公司推出一些相应试剂盒，也保证了Taqman在高通量方面的应用）。之前的高通量筛选基因表达差异的技术是cDNA 芯片和差异显示，但这两种技术的缺点是只能定性而非完整意义上的定量分析。定量PCR 技术的出现无疑为这种检测提供了极大的方便，利用定量 PCR检测产物并进行熔解曲线分析的方法，已经对cDNA 芯片和差异显示技术的结果进行了确认，而且得到了更加完整和精确的结果。第三个层次：遗传学，SNP分析以及深入应用点突变分析和等位基因分析：用不同的荧光报告基团标记的 Taqman 探针分别与野生型和突变基因杂交。探针杂交的效率和其后的切除与杂交有关

27、。如果一种染料的荧光信号明显强于另一种则说明它是一个纯合子，如果两种荧光信号都增加则表明是一个杂合子。实时定量 PCR 的数据被标在xy坐标轴上来区分特异的基因型。利用这种方法，能在不到两个小时内很快对 96 个样本进行基因分型。这一方法最先由Sevall在文章“Rapid allelic discrimination from real-time DNA amplification”中提及。 为了检测突变体，可以设计两种不同颜色的探针：一个探针设计来检测野生型，可以标记FAM，另一个标记JOE的探针来检测突变体。通常两个探针的差别只有1个bp，由于两个探针相差极小，因此一般推荐使用严格的反应

28、条件。 通过分析数据，两个通道的结果会呈现在一个屏幕中，没有标记物的曲线是CH1结果，有循环数的是CH2，最多可以有四个探针(两个突变体)可以被分析，在编辑好基因型名称，将域值调整到0以上后，结果就会在图下方的表格中显示出来。DNA甲基化分析： CG 岛内胞嘧啶的甲基化形成 5-甲基胞嘧啶被认为和许多人类疾病特别是癌症有关。Laird 等人利用一种被称作 Methylight 的技术。 Methylight 是一种基于 Taqman 探针的甲基化特异定量 PCR 技术。在扩增之前先处理 DNA ，使得未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不受影响，用特异性的引物和 Taqman 探针来区

29、分甲基化和非甲基化的 DNA ，这种方法不仅方便而且灵敏度更高。特异的引物和 Taqman 探针被用来区分甲基化和非甲基化的 DNA 。和其它实时 PCR 方法一样，Methylight无需电泳，因而提高了反应的灵敏性和通量。这种方法的灵敏性在食道癌病人血液中癌细胞异常甲基化的DNA检测中被证明。 低密度表达谱分析： 这一方面主要是配合ABI的系列产品：TaqMan Low Density Arrays。这个芯片是从人，小鼠和大鼠的基因中挑选的4万个arrays，可以根据用户要求在反应板中固化不同基因的检测探针和引物，同时检测1个标本的384个不同的基因或8个标本的48个不同的基因，而且这个试剂盒是pre-loaded，方便使用，同其反应体积小（2ul），节省试剂的优点一起构成了这个适用于标准化，中高通量基因表达研究的试剂。SNP分析：SN