脑源性神经营养因子对糖尿病大鼠早期神经视网膜病变的影响

1、脑源性神经营养因子对糖尿病大鼠早期神经视网膜病变的影响【摘要】目的：观察玻璃体腔内注射脑源性神经营养因子Brainderivedneurtrphifatr，BDNF前后STZ糖尿病大鼠视网膜中酪氨酸羟化酶tyrsinehydrxylase，TH的程度及多巴胺能无长突细胞数目的变化。法：9周龄istar大鼠，链脲佐菌素streptztin，STZ腹腔注射，制成糖尿病模型，于模型建立2k后，大鼠眼玻璃体内注射BDNF溶液，于模型建立4k后，处死大鼠，取出眼球，取视网膜组织进展esternbltting及视网膜铺片免疫组织化学染色检测，观察视网膜中TH程度的变化，从而反映糖尿病大鼠视网膜中多巴胺能无

2、长突细胞程度的变化。结果：实验组糖尿病大鼠未注射BDNF眼视网膜中TH蛋白程度降低，多巴胺能无长突细胞计数及灰度低于对照组，均有统计学差异。实验组注射BDNF眼视网膜中TH蛋白程度、多巴胺能无长突细胞计数及灰度与对照组无统计学差异。结论：在STZ糖尿病大鼠糖尿病早期，玻璃体腔内注射BDNF可进步视网膜中TH的程度，进步多巴胺能无长突细胞的数目。【关键词】istar大鼠糖尿病视网膜病变酪氨酸羟化酶脑源性神经营养因子InvlveentfbrainderivedneurtrphifatrinearlyretinalneurpathyfdiabetesinratsAbstratAI:Tbserveth

3、ehangesftyrsinehydrxylase(TH)prtEinlevelsandthedensityfdpainergiaarineellsbefreandaftertheadinisteringbrainderivedneurtrphifatr(BDNF)prteinintthevitreusavitiesfstreptztin(STZ)reduedistardiabetirats.ETHDS:Adultaleistarrats,9eeksfage,ereinjetedintraperitneallyithSTZtreatediabetes.At2eekafterthedelsere

4、reated,BDNFprteinasadinisteredintthevitreusavitiesfrats.At4eekafterthedelserereated,theratserekilledandtheretinaasrevedfresternblttingandhle-untiunhistheistryfrTHtbservethehangesfTHanddpainergiaarineellsinretina.RESULTS:TheprteinlevelsfTH,thenuberfpsitivestainingdpainergiaarineellsandthestaininggray

5、salefexperientalgrupithutBDNFerelerstatistially.ButthereerenstatistialdifferenesbeteenexperientalgrupithBDNFandntrlgrup.NLUSIN:IntheearlystagefSTZdiabeti,adinisteringBDNFprteinintthevitreusavitiesaninreaseTHprteinlevelsandthedensityfdpainergiaarineellsintheSTZratsretina.KEYRDS:istarrats;diabetiretin

6、pathy;tyrsinehydrxylase;brainderivedneurtrphifatr0引言传统的理论认为糖尿病视网膜病变属于微血管病变，但实际上它也是一种视网膜的神经变性类疾玻在人类和实验动物中，在糖尿病发生后不久，且在血管并发症出现之前，神经元内的分子功能就已经发生变化。糖尿病中视网膜的神经病变早于血管并发症出现，并贯穿糖尿病的始终，严重危害患者的视力。许多研究都说明脑源性神经营养因子brainderivedneurtrphifatr，BDNF在视网膜生理和病理生理过程中具有重要作用1,2，本文报道在糖尿病大鼠玻璃体腔内注射BDNF前后视网膜中酪氨酸羟化酶tyrsinehydr

7、xylase，TH的程度及多巴胺能无长突细胞数目的变化，旨在初步讨论糖尿病早期视网膜神经病变的发病机制。1材料和方法1.1材料链脲佐菌素streptztin，STZ，美国Siga公司。TH免疫组化染色试剂盒，武汉Bster生物。BDNF冻干粉，美国Upstate公司。牛血清白蛋白BSA，美国Siga公司。平衡盐溶液BSS，美国Aln公司。中国医科大学实验动物部提供安康成年近交系9k龄雄性istar大鼠60只，体质量180220g，眼部经裂隙灯和检眼镜检查屈光间质明晰，眼底无病变。分笼饲养，标准颗粒饲料，不限食水。饲养场所通风良好，室温1825，相对湿度40%70%，12h光照昼夜循环。尿糖试纸

8、，桂林中辉科技开展。血糖仪，血糖试纸，德国罗氏公司。1.2方法1.2.1STZ诱导糖尿病大鼠模型枸橼酸盐溶液0.1l/LpH4.5，高压灭菌，STZ浓度10g/L溶解于其中，使用前配制。大鼠禁食水12h，STZ70g/kg体质量腹腔注射。其后48h，72h，1k连续3次采尾静脉血测空腹血糖，以空腹血糖高于16.7l/L为制模成功，且每周监测尿糖1次、每2k监测血糖一次，将空腹血糖低于16.7l/L者剔除。1.2.2动物的分组及处理以成模鼠作为实验组，对照组腹腔注射同样剂量的枸橼酸盐溶液每组30只。大鼠成模后4k，100g/L水合氯醛3l/kg体质量腹腔注射全身麻醉后，摘除双侧眼球备用。颈椎脱位

9、法处死大鼠。1.2.3BDNF的眼内注射于STZ或抚慰剂腹腔注射后2k开场，每3d注射1次，共5次。BDNF冻干粉1g/L溶于含1g/L牛血清白蛋白BSA的平衡盐溶液BSS中。100g/L水合氯醛3L/kg体质量腹腔注射全身麻醉，20g/L利多卡因1滴外表麻醉成功后，随机选取大鼠一侧眼球，用微量进样器取上述溶液5L注射入大鼠眼玻璃体腔内，对侧眼注入同样剂量的含1g/LBSA的BSS溶液。将出现玻璃体出血或眼球萎缩者剔除。1.2.4esternbltting检测检测TH的蛋白程度。将大鼠眼球置于显微镜下，去眼前节，小心别离出视网膜，将视网膜放入1LEP管中，参加裂解液，冰上超声，4离心，取上清液

10、，70下保存，待检。酚试剂法蛋白定量，上样时确保每个样本的总蛋白量一样。大鼠抗-TH单克隆抗体1:100倍稀释作为一抗，兔抗鼠IgG抗体1:100倍稀释作为二抗。应用BandSan软件分析电泳条带的灰度值。1.2.5视网膜铺片免疫组化检测将视网膜固定，脱脂，在1g/L的PBS液中水合，将视网膜切成假设干瓣，内界膜面向上，小心平铺在载玻片上。将标本放于含抗-TH单克隆抗体1:100倍稀释，5g/LTritnX-100的PBS液中4下孵育72h，PBS洗后，置兔抗鼠IgG抗体(1:100倍稀释)中4下孵育24h，PBS洗后，DAB显色。中性树胶封片后，置显微镜下观察。可分辨出多巴胺能无长突细胞。每

11、张铺片计数5个高倍视野中标记的细胞数目即可得到TH阳性细胞的数目。统计学处理：计数资料用均数标准差表示，t检验，使用SPSS12.0数据分析软件包处理。2结果2.1实验组及对照组视网膜中的TH蛋白程度TH蛋白程度用同一泳道的-atin程度来标准化可见，实验组大鼠未注射BDNF眼TH蛋白灰度明显低于对侧眼和对照组眼P0.01。而实验组大鼠注射BDNF眼、对照组注射与未注射BDNF眼TH蛋白程度无统计学差异图1，表1。图1实验组大鼠未注射(A)与注射BDNF眼(B)、对照组未注射()与注射BDNF眼(D)TH蛋白程度2.2实验组及对照组视网膜中TH阳性细胞计数和染色灰度实验组及对照组视网膜每张铺片

12、分别计数5个高倍视野的TH阳性细胞数值，并取其平均值，实验组未注射BDNF眼的TH阳性细胞平均值明显低于对侧眼和对照组眼P0.01。而实验组大鼠注射BDNF眼、对照组注射与未注射BDNF眼TH阳性细胞平均值无统计学差异图2，表2。实验组及对照组视网膜每张铺片分别计算5个高倍视野的TH阳性细胞的染色灰度值,并取其平均值，实验组未注射BDNF眼的TH阳性细胞染色灰度平均值明显低于对侧眼和对照组眼P0.05。而实验组大鼠注射BDNF眼、对照组注射与未注射BDNF眼TH阳性细胞的染色灰度平均值无统计学差异表2。图2实验组大鼠未注射BDNF眼(A)的TH阳性细胞平均值明显低于注射BDNF眼(B)3讨论无

13、长突细胞是一种视信号整合细胞，它有长的分支与其他细胞相突触，可能使视网膜的功能协调一致。无长突细胞之所以得名是因为该类细胞没有轴突，无长突细胞的胞体位于内核层的下层，与内网状层相毗邻，从细胞体各个方向发出突起，沿着内核层，进入内网状层，与双极细胞、神经节细胞相突触。多巴胺与人体许多并且非常根本的功能相关。在视网膜，多巴胺由无长突细胞释放，并激活分布于视网膜上的多巴胺受体发挥作用。它在视网膜的功能中发挥重要和复杂的作用。其中一个人们感兴趣的焦点是多巴胺在视网膜中的营养功能。包括生长、发育、细胞死亡，实验性近视等相关领域。目前的研究认为，神经视网膜与多巴胺能系统之间的互相作用是一个双向的通路，多巴

14、胺可能是神经视网膜细胞间互相反响的信使。多巴胺有D1和D2两个受体。多巴胺能无长突细胞的末梢与程度细胞成突触，释放多巴胺作用到程度细胞的D1受体上，降低程度细胞对光的反响。多巴胺D2受体属于多巴胺神经元的自身受体，具有突触前负反响的功能，可以调节多巴胺能神经元的多巴胺释放。D1和D2受体之间互相作用完成多巴胺的生理功能。多巴胺可以刺激乙酰胆碱能神经元，释放乙酰胆碱增多。视网膜神经递质-氨基丁酸GABA，谷氨酸L-glutaate可以抑制视网膜多巴胺释放，钾离子可促进多巴胺的合成。多巴胺可抑制血管活性肠肽的活性。多巴胺可刺激RPE生成环磷酸腺苷AP，并降低血管活性肠肽刺激RPE分泌大分子物质等3

15、。多巴胺可与众多神经活性物质发生互相作用，多巴胺能神经元释放多巴胺到光感受器和RPE上的多巴胺受体，通过与D1结合引起视网膜光感受器细胞的变化，多巴胺是从视网膜到RPE的传导媒介。此外多巴胺又通过D2抑制腺苷酸环化酶A的酶活性，降低AP程度，反响抑制多巴胺的释放。因此，多巴胺在视网膜起神经-激素作用4。多巴胺在维持正常视神经功能中起着重要的作用。临床资料说明：Parkinsns病主要损害多巴胺能神经元，这种患者出现视网膜比照敏感度和分辨力等视功能损害的特征，这是因为多巴胺能神经元功能缺乏影响了程度细胞多巴胺敏感细胞从而干扰了外周视觉5。光刺激可以激活多巴胺能神经元，在光照下，视网膜多巴胺合成、

16、代谢明显增强，多巴胺合成限速酶TH的活性也明显增强，在暗环境下光适应的视网膜多巴胺神经元功能下降，视网膜多巴胺及其代谢产物减少，多巴胺能控制与光和暗适应的视网膜生理反响，调节程度细胞对光反响，减少细胞间的电联接。在哺乳动物视网膜，多巴胺能细胞体位于无长突细胞层，即内核层和内丛状层的交界处。在脊椎动物视网膜中，多巴胺能神经元的密度较低，约为10100/2，但每个细胞均放射状地伸出许多突起，足以覆盖邻近的多巴胺能神经元。多巴胺能神经元通过调节多巴胺的合成和释放来对多种刺激作出反响，在此过程中，一个关键的角色就是TH，它是多巴胺合成的限速酶，它和多巴胺一样，都分布于整个细胞，包括最为精细的突起和末稍

17、6。因此TH蛋白程度是视网膜多巴胺能无长突细胞的标志之一。糖尿病中多巴胺能无长突细胞发生变性的可能机制如下：第一，严重的胰岛素剥夺，见于STZ所致的糖尿玻研究认为7，胰岛素是体外无长突细胞生存的重要因子。第二，高血糖。体外培养结果说明8，过量的糖破坏视网膜中胰岛素刺激细胞的生存和胰岛素受体的信号传递。第三，视网膜llers细胞功能障碍。糖尿病时，llers细胞中谷氨酸-天冬氨酸转运功能降低9，并且天冬氨酸的合成遭到破坏10。这些功能障碍导致糖尿病视网膜谷氨酸程度增加，对无长突细胞具有毒性。BDNF对于对视网膜和视神经损伤，视网膜缺血及化学性损伤、光感受器细胞的损伤后的恢复及再生等方面具有非常重

18、要的作用，目前，它被认为是抗凋亡剂、钙通道阻滞剂和抗氧化剂。多巴胺能无长突细胞的变性可能导致BDNF程度的降低。小鼠bdnf基因的零突变可以导致多巴胺能无长突细胞的萎缩11。另据报道，在黑质12及体内13和体外14培养的视网膜无长突细胞中，BDNF可以阻止多巴胺能神经元的死亡。神经营养因子不能通过血脑屏障15，因此，它们对于视网膜神经元的部分供给很难保证。在本实验中，我们将BDNF直接注射入眼球，但在糖尿病患者中进展神经营养因子的玻璃体腔内连续注射是可行性稍差。玻璃体腔内或视网膜下植入持续释放BDNF的细胞或装置，应用病毒载体进展眼内BDNF的基因转移可能更为可行。【参考文献】1LuG，HuD

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