慢性乙型肝炎基因治疗策略研究进展

1、慢性乙型肝炎基因治疗策略研究进展【关键词】肝炎乙型慢性基因疗法治疗基因DNA反义RNA反义慢性乙型肝炎是由乙型肝炎病毒HepatitisBvirus，HBV感染引起的、病死率较高的一种慢性传染性疾病，易开展为肝硬化、肝癌。据资料显示1，2，全球约有3.5亿慢性乙肝患者，我国是慢性乙肝高发区，约有1.3亿患者。目前，基因治疗作为一种全新的治疗理念越来越受到人们的关注。基因治疗是指将外源性的有特定功能的目的基因DNA或RNA片段，通过一定的技术手段导入靶细胞内，成为宿主细胞遗传物质的一部分，在一定条件下目的基因表达产物对疾病起治疗作用的一种治疗方式。当前基因治疗的研究热点主要集中在探究适宜的治疗基

2、因、构建理想的载体以及对导入基因表达的调控与监测等方面。笔者将着重从反义RNA技术、反义DNA技术、核酶技术、锁核酸与锁核酸核酶、RNA干扰(RNAinterferene,RNAi)技术和显性阴性突变体等几个方面对基因治疗策略的现状作一综述，以期为抗HBV基因治疗研究提供参考。1反义RNA技术1.1反义RNA的作用机制反义RNAantisenseRNA亦称反义寡核苷酸antisenseligdexynuletide,ASDN是指按碱基互补配对原那么与单链RNA特异性结合，形成部分双链核酸，定点封闭靶基因，阻断特定基因表达的一小段2030bp左右人工合成的RNA分子，具有准确选择性和高度特异性，

3、而且能显著抑制病毒复制，被认为是一种较理想的基因治疗药物。反义RNA可能通过以下几种反义作用机制到达抗HBV的目的：反义RNA互补于特定的RNA的非编码区，影响核糖体的结合，从而抑制翻译；反义RNA互补于特定的RNA的编码区，抑制翻译；反义RNA通过激活RNaseH，使RNA易于被核酸酶降解；反义RNA作用于靶RNA的5端，阻止帽子构造的形成，影响靶RNA的成熟；反义RNA作用于3端的ply(A)尾的形成，阻止靶RNA的成熟及其向胞浆内的转移；反义RNA作用于外显子与内含子的连接区，阻止RNA前体的剪接。通过以上几种机制，反义RNA可以在翻译程度阻断HBV的RNA的表达。1.2依不同基因位点而

4、设的ASDN的抗HBV才能自20世纪90年代初Gdarizi首次报道了反义RNA能特异抑制HBV-DNA复制现象以来，先后有许多研究者在这一研究领域做了大量卓有成效的工作。然而，有效的反义RNA序列的设计仍然依赖于对病毒基因组构造与调控序列的研究进展。因此，必须选择那些对病毒生存和复制至关重要的基因部位进展反义抑制，而把作用于不同位点的多个反义RNA同时使用或串联或杂合反义核酸，到达阻止多个有害基因的表达，从而更好地发挥其抑制HBV的作用，这是值得研究的一个方向。根据HBV基因组表达、复制特点，设计出针对S、P、X、前(pre)、前S1(preS1)和前S2(preS2)基因的反义RNA，特别

5、是针对那些调节序列，如DR1、DR2、U5、增强子、启动子、帽子构造和ply(A)尾等，有可能获得更为有效的抑制作用。Krba等3评价了56条不同的针对HBV特定功能区的ASDN抑制HBV复制、表达的才能，结果说明，即抑制效果到达最正确后下降到一定程度又上升1.3ASDN技术存在的问题尽管ASDN抗病毒的作用为人们治疗HBV感染展示了广阔的前景，但是仍然存在着一些问题：ASDN主要通过封闭HBV的RNA来抑制HBV的复制与表达，而HBV的复制模板DNA仍然存在，因此，一旦停顿治疗，HBV仍可能重新复制，显然研究如何封闭超螺旋HBV-DNA是一个值得考虑的方向；ASDN在体内及细胞内的稳定性有待

6、进步；ASDN及其代谢物的平安性、副作用，尤其是长期毒性目前也知之甚少，这些都需要做更进一步的研究。2反义DNA技术由于反义RNA技术对源源不断产生的RNA难以全部阻断，因此很难实现完全抑制HBV复制。因此，人们的注意力开场转向研究能封闭病毒基因的反义DNA技术。所谓的反义DNA技术是指脱氧寡核苷酸能与双链DNA特异性结合，形成三链DNA，从而阻止基因转录，故又称三链DNA技术。为了与反义RNA技术相区别，又将三链DNA技术称为反基因技术。由此可见，反义DNA技术抗HBV的反义作用机制是反义DNA与特定的DNA结合形成三链DNA分子，阻止转录因子与DNA结合，从而在转录程度上阻断特定基因的表达

7、，到达抗HBV复制的目的。3核酶技术核酶最早是从四膜虫的核糖体RNA前体中发现的。它能催化其他RNA分子转变、降解与聚合，使靶RNA链在某些特殊部位断裂，重新连接起来，而自身却无消耗，它是一种真正意义上的酶。而且核酶在切断RNA后又可以从杂交链上脱落下来，重新结合并切割其他RNA，故其抑制作用明显强于反义RNA。目前已广泛应用于病毒性疾病如HIV感染、HBV感染、HV感染等的治疗研究。HBV基因组含有四个开放读码框，即前S/S区、前/区、P区和X区。前S/S区编码大、中、小3种包膜蛋白，前/区编码HBeAg和HBAg，P区编码聚合酶，X区编码X蛋白。HBV-DNA进入宿主肝细胞核内，在宿主酶的

8、作用下，以负链DNA为模板延长正链，修补正链中的裂隙区，形成共价闭合环状DNADNA，后以DNA为模板，在宿主RNA聚合酶的作用下，转录成几种不同长度的RNA，其中3.5kb的RNA含有HBV-DNA序列上的全部遗传信息，称前基因组RNApgRNA。pgRNA进入肝细胞质中后作为模板，在HBV逆转录酶作用下，合成负链DNA，再以负链DNA为模板，在HBV-DNA聚合酶作用下，合成正链DNA，形成子代双链环状DNA。因此，针对各基因组研究设计能切割RNA及pgRNA的核酶具有抗HBV的作用。Heprih等6用噬菌体phi29的pRNA为载体，将针对HBV-ply(A)的外源核酶连在pRNA的5端

9、与3端之间，通过与载体相连方式修饰过的核酶能有效防止被核酸外切酶降解，在培养细胞中抑制HBV复制的效果明显进步。rrissey等7用化学方法对核酶进展修饰，以进步核酶的稳定性，包括对核苷酸甲基或烯丙基化、硫代磷酸交联等。修饰后的核酶在HBV转基因小鼠体内试验说明，可以有效降低血浆中HBsAg、HBeAg及HBV-DNA的含量。脱氧核酶DNAzye4LNA与LNAzye4.1LNA4.2LNAzyeLNAzye是脱氧核酶DNAzye的一种衍生物，是一种经过LNA修饰的DNAzye，即在DNAzye的两个结合臂上引入一个或多个LNA单体。LNA的引入大大增加了LNAzye与底物的杂交亲和力，增强了

10、切割反响5RNAi技术RNAi也称基因沉默genesilening，是最近发现和开展起来的新型基因阻断技术，是通过利用dsDNA诱发对宿主细胞特异性RNA转录的抑制，从而抑制特异目的基因的表达12。机制是在细胞中导入dsDNA，切割酶Dier(由核酸内切酶和解旋酶等组成)将dsDNA剪切为2123bp的小干扰RNAsallinterferingRNA,siRNA，siRNA与酶蛋白结合形成RNA诱导的沉默复合体RNA-induedsileningplex,RIS，RIS根据碱基互补配对原那么与靶向RNA结合，在ATP参与下利用酶切作用降解RNA，从而导致目的基因表达沉默，而RIS那么可继续参与

11、下一个RNAi作用循环13。RNAi是动植物抵抗病毒入侵，保持基因完好的天然防御机制，而有些细胞可能缺少Dier酶不能将dsRNA裂解为siRNA，使病毒逃逸了免疫监视。因此，可以通过体外合成和细胞内表达两种方式获得siRNA，促使宿主细胞内形成RIS，启动基因沉默机制，到达shRNA，导入淋巴细胞、肝细胞和神经细胞中，发现siRNA和shRNA可在这些细胞中稳定的持续的表达，这一研究结果克制了体外合成siRNA作用时间短的缺点。Shlai等16采用载体pSuper携带HBV-DNA的区pSuper或X区pSuperX序列，在质粒H1启动子调控下表达shRNA，分别转染pSuper或pSupe

12、rX72h后，其相应的蛋白表达均明显降低。而将两者分别与含1.3倍HBV基因的载体结合，共转染Huh7肝癌细胞株，蛋白和X蛋白分别下降89%和63%，明显高于单个靶点的抑制作用。还发现以X基因为靶点的shRNA，对变异株HBVXut细胞中的X蛋白表达无影响，但对表达HBV病毒颗粒的细胞株仍可抑制HBV复制。以上研究结果提示多个靶点结合可进步RNAi抑制病毒复制的效果。RNAi不仅在体外细胞实验中有效，体内实验也显示其高效的抗病毒复制才能。affrey等17针对HBVS基因区设计的shRNA具有显著的抑制效果，抑制率达94%，在免疫缺陷小鼠中肝细胞HBV-RNA程度较对照组下降了84.5%，小鼠

13、血清中蛋白的表达也显著下降，抑制率达99.7%。Uprihard等18针对HBV的siRNA通过重组腺病毒载体有效地进入HBV转基因小鼠的肝脏，可完全抑制转基因鼠中HBV达4周之久，显示了siRNA的治疗效果。6DNDN是将病毒重要构造或功能蛋白突变，从而制造出一个人工重组干扰蛋白。该蛋白与病毒野生型蛋白互相作用，影响后者发挥其生物效应，干扰病毒正常生存周期以到达基因治疗的目的。突变蛋白使野生型蛋白功能降低或丧失，相对野生型蛋白而言，突变蛋白的功能为显性，两蛋白互相作用的结果是负调甚至是缺失了野生型蛋白的功能。国外研究者报道鸭HBV核心蛋白显性阴性突变体干扰DNA病毒的合成以及基因突变阻碍核衣

14、壳包装，到达7完毕语基因治疗是一种前景非常看好的针对HBV感染的治疗方式，因此相关的临床与实验研究也越来越多，并且随着研究的深化，已渐渐凸现出基因作为一种治疗性药物的作用。但是要真正实现基因治疗步入实际的临床应用还需要解决许多相关的问题：基因突变或不同病毒亚型的存在，可能诱导突变和病毒变异；细胞内多种酶的存在，可能影响核酶和锁核酸核酶的活性；敏感靶位点的选择，基因传送的肝导向性的准确度，仍需进一步研究；外源性基因导入后引起肝细胞免疫原性变化；对导入的治疗基因表达调控和监测；导入的治疗基因的稳定性和作用持续性；导入的治疗基因及其代谢物的平安性、副作用与细胞毒性等等。假如上述问题能寻找到更好的解决

15、方法，慢性乙型肝炎的基因治疗有望在临床上发挥宏大作用，应用前景也更为广阔。【参考文献】1KdleyK.ThestfanaginghrniHepatitisBinfetin:aglbalperspetiveJ.linGastrenterl,2022,38(suppl):S132-133.2AlterJ.EpideilgyandpreventinfhepatitisBJ.SeinLiverDis，2022,23(1):39-40.3KrbaBE,GerinJL.AntisenselignuletidesareeffetiveinhibitrsfhepatitisBvirusrepliatininv

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