高效液相色谱法的应用

1、高效液相色谱法的应用第1页，共25页，2022年，5月20日，20点34分，星期四 请大家将手机调整到“振动”档！ 谢谢您的配合！第2页，共25页，2022年，5月20日，20点34分，星期四授 课 内 容 （1）HPLC仪器的介绍，基础知识。（2）方法学验证中各项指标的深入剖析。（3）在新药申报资料中应注意的问题和事项。（4）从溶出度研究引申至国产口服固体制剂与进口原研制剂的差距。申请ANDA（美国仿制药申请）和OEM（制剂委托加工）的技术要点。（5）剖析中国药典中有待商榷之处，使大家举一反三、融会贯通！（6）为学员们解答各种问题。第3页，共25页，2022年，5月20日，20点34分，星期

2、四理念与思路 工作中应注意总结，理论联系实际，重视文献的查询，不要匆匆忙忙地就进行试验，搞清楚原理，做好试验计划、设计好试验后，再有条不紊地进行。试验期间不要怕遇到问题，越是遇到问题，解决问题，提高得越快，如果长时间都没有问题，都“一帆风顺”，那将没有提高!第4页，共25页，2022年，5月20日，20点34分，星期四理念与思路 1）“搞分析”就是“搞误差”！2）只有把握住误差，才能科学、辨证地做到“知识的活学活用”！3）做到技术上的“粗放自如”、“张持有度”，需要不断地体会和领悟！第5页，共25页，2022年，5月20日，20点34分，星期四信 息 查 询/ 国家药监局新药审评中心网站/ 国

3、家药品监督管理局网站/ 国家药典委员会网站/index.htm 中国期刊网数字图书馆 维普数据库 万方数据库第6页，共25页，2022年，5月20日，20点34分，星期四HPLC仪的一般操作1.几大仪器生产厂商的介绍和使用下来的体会。包括国内目前可以生产的部件；根据自己工作需要购买某一品牌。2.流动相的配制（梯度洗脱）和处理（过滤膜） 3.柱子的安装。4.操作顺序 5.平衡时间6.如有气泡，如何处理。第7页，共25页，2022年，5月20日，20点34分，星期四（1）分析生化样品、血液制品和手性色谱柱时，最好加一预柱以保护。（2）配备柱温箱，以保证试验的重现性和降低柱压等（3）最好能配一电脑和

4、国产软件。不要用积分仪。（4）压力不稳时，绝大多数情况是有气泡混入。应排除。（5）试验后色谱柱冲洗。（6）色谱柱不用、存放时，两头柱塞一定塞住，否则容易挥发干损伤柱子。（7）建立仪器使用登记本。 （8） 仪器维修 培养一位同志第8页，共25页，2022年，5月20日，20点34分，星期四1定义: HPLC high performance liquid chromatography2分析物质的分子量大小 分子量一般在2001000之间，太大的分子量（如多肽类等）导致脱尾严重，此时可采用其他方法进行分析，如毛细管电泳，凝胶色谱等。第9页，共25页，2022年，5月20日，20点34分，星期四3.

5、 分析的特点 适用范围宽：现在决大部分化学类药品皆可采用该仪器分析。 分离效率高：复方分析、辅料干扰时等情况下，更显示其威力。 速度快：一般出峰时间均在30min以内。这里需要强调的是，通常采用流速为1.0ml/min，柱温3040的测定条件。一般含量测定、溶出度可调整为出峰时间快一些，有关物质测定一般调整的慢一些，最好1015min左右出峰为好。第10页，共25页，2022年，5月20日，20点34分，星期四 流速和柱温均可适当改变，以适应测定的需要。如含量测定时，可适当加大流速和提高柱温；柱温降低和流速降低均可对分离效果提高。顺便提级：同样的测定条件，不同公司生产的色谱柱C18柱，出峰时间

6、都有可能相差很大。这十分正常。目前国外已基本采用一根色谱柱对一个产品，特别是一些特殊的柱型，质量标准中均详细注明。国内虽做不到，但可在色谱条件上下工夫，以适应不同的色谱柱型号，即后面即将讲到的方法认证中的系统耐用性。第11页，共25页，2022年，5月20日，20点34分，星期四 灵敏度高：可检测物质达10-9g左右，一般最低检测浓度均可达10-110-3g/ml（进样体积1020l）。这是紫外测定无法匹敌的。有些浓度非常低的，紫外检测不到或者说紫外无法测定的，应用HPLC法均可得到满意的解决！并可通过使用不同的检测器，测定不同物质，或再提高测定灵敏度。 色谱柱可反复使用：一般保存好，均可达2

7、年以上。 流出的组分容易收集：可用于制备色谱或价格极为昂贵的物质收集。第12页，共25页，2022年，5月20日，20点34分，星期四 安全：仅有一些有机溶剂的污染（使用时，流动相口要密封，一者以免挥发，流动相中各组分比例不准，二者防止挥发，污染环境），比气相要安全的多。 还有一个优点，就是成功率较高：一般条件确定好后，均可得满意的结果，这也是与气相、毛细管电泳比最大的优点。第13页，共25页，2022年，5月20日，20点34分，星期四 4分离原理就是利用不同物质间的细微差别，使得在色谱柱上所显现的保留行为有所不同进行分离测定。主要是能够分离。 两个主要参数：(1)柱效用理论板数来表达： 上

8、面两式需要注意的是：第一个为基本公式，好的软件均可自动计算出；第二个公式为推导公式，即假设拖尾因子为1.0，即色谱峰完全对称时，用峰面积和峰高来表示半峰宽，因此两者是有区别的，当峰形拖尾或前沿严重时，两者差异将较大。第14页，共25页，2022年，5月20日，20点34分，星期四5. 色谱柱类型 C18柱（ODS是其中的一种，主要区别是将未键合的OH基遮盖，而ODS是其商品名）、C8柱、氨基柱、苯基柱、阳（阴）离子交换色谱柱等，这些都是固定相表面键合的极性有机基团不同所至。 不能混用。第15页，共25页，2022年，5月20日，20点34分，星期四6. 流动相常用溶剂的极性和截止波长 由极性可

9、以看出，在反相色谱中，要使出峰时间加快，可增加流动相中的乙腈比例，但要注意分离度的减小；若要使出峰时间减慢，可增加流动相中水的比例，增加水的比例还会引起分离度的增加；两者之间综合来考虑。举例说明 。异丙醇转相时必须用；四氢呋喃使用时注意波长。必须选用色谱级的。 梯度洗脱的注意事项：流动相、测定波长、预先混合的比例第16页，共25页，2022年，5月20日，20点34分，星期四 由于甲醇的极限波长为210nm左右，故短波长测定时，最好不要采用甲醇，而用乙腈。 样品稀释用溶剂的选择：测定有关物质时最好选用流动相，避免以溶剂峰的干扰，水往往出倒峰。含量测定时，溶剂依情况而定，有时选用流动相费用太高，

10、或是不易于操作。 进样量最好选用定量环的量，以避免由于进样不准而引起的偏差。定量环可进行更换。第17页，共25页，2022年，5月20日，20点34分，星期四7. 检测器类型 最通用的紫外检测器：注意测定波长较短时，基线有可能会飘；洗柱子时，尽量关闭光源，以延长使用寿命。 二极管阵列检测器：目前使用者越来越多。用于多波长检测、峰纯度测定、对被测定物质进行紫外扫描后选择波长等用途。 荧光检测器：灵敏度更高，对那些g级的制剂品种，有时适用。但缺点是，基线稳定需平衡时间较长。 示差折光检测器、蒸发光散射检测器、电化学检测器（电导检测器）等。第18页，共25页，2022年，5月20日，20点34分，星

11、期四8定量分析8.1 外标法：计算公式 使用时应注意尽量保持样品溶液和对照品溶液浓度相同 第19页，共25页，2022年，5月20日，20点34分，星期四8.2 内标法 使对照品溶液和样品溶液中内标物的浓度一致，否则计算将极为烦琐。该法仅是由于以前仪器的性能还不十分精确，进样体积还不能准确控制的很准时，才采用的。现在随着定量阀和自动进样器的使用，该法使用已越来越少，而且相反会引起不必要的误差，除非进样阀进样量不准时，应急采用。但该法在气相色谱中还是十分具有价值的。 第20页，共25页，2022年，5月20日，20点34分，星期四第21页，共25页，2022年，5月20日，20点34分，星期四8

12、.3 归一化法和自身对照法 为有关物质（杂质）的测定方法。这是通过峰面积的比较来推算出各物质质量比例的方法。目前多采用自身对照法来进行。 (1) 归一化法：即一个峰的峰面积（杂质峰）占总峰面积或占主峰面积的多少。由于有关物质测定时，总峰面积的绝大部分均为主峰面积，故两者结果差不多，结果基本一致。 第22页，共25页，2022年，5月20日，20点34分，星期四 (2) 自身对照法：通常是将供试品溶液稀释一定倍数后（通常为100倍）作为对照溶液（这里对照溶液与对照品溶液的区别需要强调一下），将其和供试品溶液分别进样测定，供试品溶液色谱图中的每个杂质峰面积，与对照溶液主成分峰面积进行比较或计算进行

13、对杂质的判断。如比较，直接比峰面积大小，如计算，则采用公式计算杂质含量 。第23页，共25页，2022年，5月20日，20点34分，星期四 这里，需要讲解的是：如果该物质线性关系良好，稀释100倍，峰面积还呈线性的话，那么，归一化法和自身对照法所得结果基本是一致的（最多差0.02%左右）。但如果稀释100倍，峰面积不呈线性的话，那么，归一化法和自身对照法所得结果将有所差异，如此时采用归一化法，将得不到较为正确的结果，因为此时，峰面积已不能较为准确地表示质量；而采用自身对照法，则可避免该情况的发生，这也是目前推荐采用该法的原因所在。但大家可以注意，目前你们测定的化合物，稀释100倍，通常，峰面积是呈线性的，原因是因为采用紫外检测器，一般化合物的线性范围可达1106或107，但也有一些测定物质，线性范围较窄，此时便需要摸索其范围，但又不能单纯考虑线性范围，还应着重考虑供试品溶液的浓度才是最为重要的。 第24页，共25页，2022年，5月20日，20点34分，星期四 9流动相的调节 为了得到较好的分离效果和柱效，有时要在流动相中加入一些少量的有机溶剂，如三乙胺来调节峰形变“瘦”；或加入缓冲盐，调节流动相的pH值或离子强度，以改变组分的保