解毒化淤颗粒对急性肝衰竭小鼠肝细胞Caspase3mRNA表达的影响

1、解毒化淤颗粒对急性肝衰竭小鼠肝细胞Caspase-3mRNA表达的影响【摘要】目的讨论解毒化瘀颗粒抑制急性肝衰竭小鼠肝细胞凋亡的作用及可能的机制。方法将昆明小鼠随机分为空白组、模型组、解毒化淤颗粒组、安宫牛黄丸组、乳果糖组，用D-GalN+LPS腹腔注射构建急性肝衰竭的小鼠模型，观察各组小鼠存活率，SYBR荧光实时定量PR法检测肝细胞内天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶-3(aspase-3RNA)的表达。结果成模后48h存活率解毒化淤颗粒组高于其他药物组;促凋亡因子aspase-3在解毒化淤颗粒组肝组织中表达量低，而在其他药物干预组及模型组中那么高表达。结论急性肝衰竭中aspase-3表达与肝细胞

2、凋亡程度有相关性，解毒化淤颗粒能下调内毒素肝损伤肝细胞aspase-3表达并抑制其凋亡效应，降低肝衰竭小鼠死亡率，提示解毒化淤颗粒抑制肝细胞凋亡有可能是其防治急性肝衰竭的机制之一。【关键词】解毒化瘀颗粒;急性肝衰竭;细胞凋亡;SYBR荧光实时定量PRAbstrat：bjetiveTinvestigatetheeffetfJieduhuayugranulenhepatyteapptsisinauteliverfailureieanditspssibleehanis.ethdsKuningieererandlydividedintblankntrlgrup,delgrup,andJieduhuay

3、utreatinggrup.AuteliverfailureasbuiltithD-GalN+LPSintraperitnealinjetinttheie.Thesurvivalrateasbservedandtheexpressinfaspase-3RNAastestedithSYBRfluresenereal-tiequantitativePRassay.ResultsAfter48h,thesurvivalrateinJieduhuayutreatinggrupashigherthanthatftherdrugtreatinggrup;atthesaetiepr-appttifatr,a

4、spase-3expressininlivertissueislintheJieduhuayupartilegrupbuthighexpressinintherdrugtreatentgrups.nlusinTheaspase-3expressinisrelatedithhepatyteapptsisinauteliverfailure.Jieduhuayutreatentgranuleanredueliverellinjurybythrughinhibitingtheexpressinfaspase-3,andreduingrtalityratefliverfailureie.Keyrds：

5、Jieduhuayugranule;Auteliverfailure;Apptsis;SYBRflureseneRT-PR急性肝衰竭病情重预后差,其发病机制目前尚不非常清楚。临床上虽有药物和人工肝等各种治疗措施,但病死率仍高达60%80%1。近来研究发现,肝细胞凋亡是病毒性肝炎及肝衰竭的重要发病机制之一，细胞发生凋亡的中心环节是激发了以蛋白酶组成的级联反响，而aspase-3处于核心位置，在细胞凋亡过程中起着关键作用2。因此，干预肝细胞凋亡的发生在防治急性肝衰竭的研究中有重要的临床意义。解毒化淤颗粒是我院用于治疗肝衰竭的复方中药制剂，近年用于肝衰竭的治疗也获得了较好的效果，但其作用机制尚未清楚

6、。本文从动物实验方面观察了aspase-3基因在D-GalN+LPS所致急性肝衰竭小鼠肝细胞中的表达和肝细胞凋亡情况，讨论aspase-3基因表达在急性肝衰竭肝细胞凋亡中的意义及解毒化瘀颗粒拮抗肝细胞凋亡的机理。1材料与仪器1.2药物解毒化淤颗粒(茵陈30g，赤芍50g，大黄15g，白花蛇舌草30g，郁金15g，石菖蒲15g等)由单味中药浓缩颗粒剂配制而成(由江阴天江药业提供，产品批号07004160);乳果糖(由荷兰SlvayPhara公司提供，产品批号：331307，进口注册号:h20220303);安宫牛黄丸(由北京同仁堂股份同仁堂制药厂提供，批准文号：国药准字Z11020226，产品批

7、号：6017014)。1.3试剂造模剂：氨基半乳糖D-GalND-(+)-Galatsainehydrhlride(由siga公司提供，产品批号：G0500)，内毒素脂多糖LPS(lipplysahar-rides，由siga公司提供，产品批号：L2880at.N.L8880)。SYBR荧光实时定量PR:总RNA抽提试剂Trizl为Invitrgen公司产品，反转录试剂盒SupersriptTRnaseH-ReverseTransriptase为Epientre公司产品，Lightyler-FastStartDNAasterSYBRGreen试剂盒为Rhe公司产品、dNTP、lig-dT为上海

8、生工生物工程公司产品，Rnasin、DTT、pD18-TVetr为Epientre公司产品。1.4仪器DU-640型蛋白核酸分析仪(美国Bak-an公司);5417R型低温高速离心机(德国Eppendrf公司);JY92-2D型超声波细胞粉碎机(宁波新芝科器研究所);ST-型大型半干式转移电泳槽(大连竞迈生物科技);V-ILA型小型双垂直板电泳槽(大连竞迈生物科技);GeneApPRSyste9700(AppliedBisystes)。2方法2.1动物模型制作采用腹腔结合注射D-GalN+LPS致急性肝衰竭小鼠模型,方法参考张磬等3的方法，使用前用生理盐水将D-GalN配置成的1G/100l的

9、溶液,再用1l/L氢氧化钠溶液调整pH值至7.17.2。LPS用无菌生理盐水配成1g/6l,过滤除菌。注射量为D-GalN600g/kg体重与LPS10g/kg体重。2.2动物分组及给药160只SPF级昆明小鼠,随机分为空白组(16只)、模型组(36只)、解毒化瘀颗粒组(36只)、乳果糖组(36只)、安宫牛黄丸组(36只)。雌雄各半。各药物组均取20只用于观察死亡率。解毒化淤颗粒组给予57.55g生药/kg，乳果糖组参照文献4给予3.5g/kg，安宫牛黄丸组参照文献5给予1.5g/kg。使用时,用蒸馏水将解毒化淤颗粒的配方颗粒剂配成0.4177g/l,乳果糖配成0.175g/l，安宫牛黄丸配成

10、0.075g/l，正常组与模型组分别给予蒸馏水代替，每天灌胃量0.2l/10g体重。造模前5d开场灌胃给药，2次/d，间隔12h，共给药5d。实验过程中，动物均饮用生理盐水葡萄糖液。2.3标本保存与处理成模6h后各组随机取存活小鼠16只处死,1in内切取新颖肝左叶,在冰块上以PBS缓冲液清洗干净,切取0.51.03大小的肝组织块,立即放入液氮中冷冻。其余存活小鼠用于成模后48h存活率统计。2.4检测指标及方法2.4.1成模后48h存活率观察观察各组小鼠腹腔注射D-GalN和LPS后外观、皮毛、肤色、呼吸、行为活动、精神状态、食欲、大小便及鼻、眼、口腔有无异常分泌物等变化,并准确记录出现死亡的时

11、间、数量、性别分布等情况。2.4.2SYBR荧光实时定量PR法检测aspase-3RNA肝组织总RNA的提取：取冻存的肝组织约0.1g,采用Trizl提取组织的总RNA,操作按说明进展。提取后的RNA测A260-A280吸光值,要求A260A280比值为1.82.1,并计算出RNA含量?DNA的合成：配制退火混合物:RNA3g;0.5g/llig(dT)18,1l;加无RNA酶的H2至总体积10l。混合液在70水浴3in,降到37放置10in。RT反响液:10RT缓冲液2l;2.5dNTP混合液4l;RNA酶抑制剂1l;LV反转录酶1l;混合后37恒温1in。加10l的RT反响液到10l退火混

12、合物中,37水浴60in,加热到95维持5in。得RT终溶液即为DNA溶液,置冰浴待用。转贴于论文联盟.ll.定量模板的克隆和制备及引物：以DNA为模板,参加相应引物及SYBRPreixExTaqT,分别对aspase-3和内参(-atin)进展扩增，从Genebank中调出aspase-3的DNA和RNA序列,根据引物设计原那么,设计双向引物序列,所需引物序列如下:F:5GTTGATGGAAAGGAAA3;R:5GGGATGGATGAAAGA3;退火温度:59,产物长度:207bp;-atin:F:5TTATGAAAAGTG3,R:5GTATTGTTGTGAT3,退火温度:58,产物长度:2

13、11bp。SYBRGreen实时定量PR：荧光定量PR反响中aspase-3基因反响参数为:95,5in;35个PR循环;beta-atin:95,5in;30个PR循环,将定量模板进展10倍梯度稀释,得到不同浓度的标准模板10-110-9,制作aspase-3和内参标准曲线;再将待测样品与标准品同时在荧光定量PR仪上反响,所得不同t值分别代入不同标准曲线,电脑自动读出各样品起始模板量。将各样品aspase-3基因定量结果与内参基因定量结果相比进展RNA校正,即可得到各组小鼠肝组织中aspase-3RNA的相对表达量。PR产物确实定分析：将所扩增的PR产物同时进展琼脂糖凝胶电泳及熔解曲线分析。

14、程序选择熔解曲线。2.5统计学处理采用SPSSfrinds13.0统计软件,各组之间阳性率的差异采用合适小样本的Fisher确切概率法,计量资料数据以s表示,组间差异采用ANVA分析和LSD-q检验。双侧P0.05认为有统计学意义。3结果3.1解毒化淤颗粒对急性肝衰竭小鼠成模后48h存活率的影响各组小鼠在腹腔结合注射D-GalN+LPS4h内一般无小鼠死亡;6h后肝衰竭组小鼠开场出现神志昏迷病症,局部小鼠出现球结膜水肿、抗捕才能完全消失,四肢细微震颤,甚至局部出现痉挛或抽搐,并开场出现死亡现象,取血部位凝血障碍。比拟48h各组小鼠存活率发现，解毒化淤颗粒、乳果糖、安宫牛黄丸均能进步肝衰竭小鼠的

15、存活率,与模型组比拟P0.05。药物组间比拟，解毒化淤颗粒组乳果糖组安宫牛黄丸组(P0.05,可能与样本量太少有关),雌雄间无明显差异性。结果见表1。表1成模后48h存活率观察结果3.2荧光定量RT-PR检测aspase-3RNA结果3.2.1熔解曲线与假阳性荧光定量PR产物的熔解曲线SYBRGreen荧光染料分子掺入引物二聚体、单链二级构造、非特异性产物也会发出荧光信号,因此在实验中必须防止引物二聚体、单链二级构造、非特异性产物的存在。需要测定产物的熔解曲线来分析产物的均一性,假设产物中只含有特异性产物,那么其熔解曲线表现为单一的峰值,结果说明,aspase-3基因PR产物只有单峰,说明扩增

16、产物单一,防止了定量检测过程中假阳性结果地出现。结果见图1ab。经琼脂糖凝胶电泳证实为目的条带。结果见图2。3.2.2扩增曲线与灵敏性利用梯度稀释的标准品做阳性模板进展实时荧光定量PR反响,可得到模板循环数与荧光强度关系。结果见图3ab,其中横坐标代表PR反响的循环数,纵坐标代表双链与SYBRGreen荧光染料结合后的荧光强度(F1),从图中可以看出不同拷贝数的模板随循环数的增加,其荧光强度逐渐增强,在经过一段指数扩增后曲线趋于平行,即出现“平台效应,指数扩增期模板拷贝数与荧光累积值的一一对应关系形成了aspase-3定量的基矗从扩增曲线图可见实时荧光定量PR检测凋亡蛋白aspase-3具有较

17、好的敏感性。3.2.3标准曲线以不同拷贝数的阳性模板的对数为横坐标,以PR反响过程中到达荧光阈值的初始循环数(t)为纵坐标得到aspase-3的标准曲线,为待测样品的aspase-3定量提供了定量检测的参照标准。结果见图4ab。3.2.4样品aspase-3RNA的定量结果各组aspase-3RNA定量结果见表2。正常组小鼠肝组织aspase-3的表达很少,与正常组比拟,模型组小鼠肝组织aspase-3RNA表达显著增加(P0.01)，与模型组比拟,解毒化瘀颗粒组、安宫牛黄丸组以及乳果糖组aspase-3RNA表达显著降低(P0.01),与解毒化淤颗粒组比拟,安宫牛黄丸组以及乳果糖组表达增加(

18、P0.05)。表2各组小鼠荧光实时定量结果4讨论近来研究已证实,aspase参与Fas系统和肿瘤坏死因子(TNF)等细胞凋亡信号转导网络的传递过程。在凋亡施行期,活化的aspase触发酶级联效应,最终引起染色体DNA的降解和细胞的解体。aspase-3是凋亡级联反响的一个重要执行者,它的过量表达可诱发细胞凋亡,在凋亡的执行阶段,负责对全部或局部关键性蛋白的酶切从而引起凋亡的激活。因此,许多学者将活化aspase-3蛋白酶的出现作为细胞凋亡的标志。aspase-3主要负责切割某些蛋白质。其对底物作用引起的变化包括:引起细胞周期阻滞;破坏细胞平衡状态及修复机制;使细胞从周围的组织构造中脱落;使维持

19、细胞构造的物质解体。大多数触发细胞凋亡的因素,最终均需要通过aspase-3介导的信号传递途径导致细胞凋亡。aspase-3可通过Fas介导的死亡信号途径,降解凋亡抑制蛋白Bl-2,被aspase家族上游成员激活并水解为活性酶形式,形成级联反响,催化参与DNA修复的PARP,即聚腺苷二磷酸核糖聚合酶ply(ADP-ribse)plyerase的裂解,同时DFF、AD等核酸内切酶的活化,使DNA在核小体连接处被切割,产生成倍于180200bp大小的DNA片段6，7。进而裂解细胞的关键构造蛋白和看家蛋白(如细胞外基质蛋白、骨架蛋白、核蛋白及相关蛋白如atin、spetrin、PAK2等),使细胞失

20、去正常形态,位于细胞-细胞、细胞-细胞外基质接触位点上的VEKK-1、FAK等蛋白激酶失活,使细胞失去与环境之间的联络,进一步加速凋亡进程。因此认为aspase-3执行着与线虫中的ed3一样的功能。aspase-3被称为是“死亡酶,而PARP被认为是“死亡底物。激活的aspase-3能使许多与细胞构造。细胞周期及DNA修复等相关蛋白或激酶失活,从而导致细胞凋亡。肝衰竭实际上是多脏器功能衰竭,故临床表现相当复杂,导致中医据“四诊搜集来的资料千变万化,由此归纳演绎病机病理的概括证型也就呈现出诸多差异,其治疗也必然随之千变万化,达不到执简驭繁的目的。更有甚者是肝衰竭晚期诸脏俱损,邪毒鸱张,诸症并存,

21、使辨证论治无从入手。“治病求本“审因施治“辨病论治及辨证论治相结合是中医的根本治疗原那么及精华所在。笔者在文献整理的根底上,大胆创新,提出了肝衰竭“毒邪病因新学说:毒为致病之因,贯穿于疾病的始终,淤、痰为病变之本,“毒“淤“痰胶结为本病根本病机病理，故其治疗原那么对应为清热解毒、活血化淤、豁痰醒神，并根据肝衰竭“毒邪病因新学说总结出来了治疗肝衰竭的有效方药解毒化淤颗粒,其由茵陈30g、赤芍50g、白花蛇舌草30g、大黄15g、郁金15g、石菖蒲15g等组成,具有清热解毒、活血化淤、豁痰醒神等成效。方以茵陈为君,清利郁于中焦、结于肝胆之湿热毒邪,为退黄的要药;配大黄、白花蛇舌草为臣,其中大黄能畅

22、阳明谷道使湿热之毒从后阴而出,白花蛇舌草清热解毒有助于茵陈以退黄;赤芍既清入血之邪毒,又行留滞之淤,与大黄相配消凝淤败血,与茵陈相伍去入血之湿毒效宏;石菖蒲、郁金化痰浊、辟秽毒、醒清窍、理升降而畅三焦,合赤芍共为佐药。诸药配伍,使湿热去,浊毒解,痰化淤消,脾运复健而升降有序,肝胆疏泄渎职而气畅血行,三焦通利,心智复常,共奏清热解毒、活血化淤、豁痰醒神之效，本方的成效可谓与肝衰竭的中医病机病理丝丝相扣。其中赤芍、大黄均具有清热解毒、凉血、化淤、退黄之成效,被视为治疗肝衰竭之良药。本研究证实解毒化淤颗粒还可从基因和蛋白程度明显降低急性肝衰竭小鼠aspase-3的表达,提示解毒化淤颗粒对肝组织的aspase-3表达的抑制,影响了蛋白酶级联切割过程,进而抑制肝细胞凋亡