木质素生物降解的研究进展

1、木质素生物降解的最新研究进展潘明凤 a 姜曼b 周祚万a西南交通大学生命科学与工程学院 成都 610031b材料先进技术教育部重点实验室，西南交通大学材料科学与工程学院成都 610031摘要 木质素广泛存在于几乎所有的植物类生物质材料中，利用微生物降解木质素不仅可以缓解环境污 染，还可以变废为宝，实现资源的循环利用。本文对降解木质素的微生物种类、木质素降解酶的理化性质 和作用机理、营养调控等方面的研究进展进行了综述，以期为木质素生物降解法的深入研究提供参考。 关键词 木质素生物降解 木质素降解酶 营养调控The nearest research advances in Biodegradati

2、on of LigninPan Mingfeng a, Jiang Manb, Zhou Zuowan b(aCollege of Life Scienee and Engineering, Southwest Jiaotong University, Chengdu 610031;bKey Laboratory of Advanced Materials Technology, Ministry of Education, Chengdu 610031;College of Materials Science and Engineering, Southwest Jiaotong Unive

3、rsity, Chengdu 610031)Abstract Lignin, a resistant cell-wall constituent of all vascular plants, is the second most abundant organic substance on earth. Biodegradation of lignin could not only alleviate pollution but also can turn “ waste i”nto wealth as well as realize resource recycling. Research

4、advances in biodegradation of lignin, including: microorganisms, physical and chemical characteristics of the lignin-degrading enzymes ， degradation mechanism and the nutrition regulations have been reviewed in this paper for purpose of development and application of lignin bio- degradationKey words

5、lignin; Biodegradation; Lignin-degrading enzymes; nutrition regulations0 前言木质素广泛存在于几乎所有的植物类生物质材料中，是植物细胞壁的重要组成部分，在自然界中的产 量仅次于纤维素是一种极具潜力的可再生资源 1,2。同时，其分子量大、结构复杂，自然降解速度缓慢，成 为地球生物圈中碳循环的主要障碍之一。木质素是由苯丙烷单元通过醚键和碳碳键连接而成的聚酚类三维 网状高分子化合物，研究证实共有三种基本结构单元 （非缩合型结构 ） ，即愈创木基结构、紫丁香基结构和 对羟苯基结构。从 20世纪开始，国内外学者一直在寻找降解木质纤维

6、素的最佳途径，涉及的研究主要包括：物理法、化学法、物理化学法、生物降解法。而利用微生物降解木质素不仅可以缓解环境污染，还可 以变废为宝，实现资源再利用，已引起了国内外学者的关注 4-7。鉴于可再生资源循环利用的重大现实意义， 我们就微生物降解木质素的最新研究进展进行综述，特别关注了降解木质素的微生物种类、木质素降解酶 系的理化性质和作用机理、木质素降解酶的活性调控等热点学术问题。可降解木质素的微生物种类自然界中，木质素的完全降解是真菌、细菌、放线菌及相应微生物群落共同作用的结果，其中真菌起 着主导作用，放线菌降解能力次之，细菌降解能力最弱。降解木质素的真菌主要分为三类：白腐菌、褐腐菌、软腐菌。

7、其中白腐真菌的降解能力最强 , 并且分 泌胞外酶对木质素降解过程中不会产生色素 , 开发利用前景较好，被认为是目前最为理想的一类降解木质 素的真菌 8,9。其主要分布在革盖菌属 (Coriolus )、烟管菌属 ( Sjekandera) 、平革菌属 (Phanerochaete) 、侧 耳属 (Pleurotus)及卧孔菌属 (Poria ) 等10。目前，用于木质素降解研究的白腐菌主要有黄孢原毛平革菌(Phanerochete chrysosporium)11,12、杂色云芝 (Coridus versicolor )13-15、平菇 ( Pleurotus ostreatus) 13 、

8、变色 栓菌 (Thametes versicolor )、朱红密孔菌 ( Pycnoporus cinnabarinus ) 等，其中黄孢原毛平革菌是研究最透 彻的模式菌 16-18。降解木质素的细菌主要有厌氧梭菌 (Clostridium sp.)、不动杆菌 (Acinetobacter)、黄杆菌属 (Flavobact -erium )、微球菌属 (Micrococcus )、假单胞菌属 (Pseudomonas)、双芽孢杆菌属 ( Amphibacillus )、黄单胞菌 属 (Xanthomonas)、枝动杆菌属 (Mycoplana ), 还有粘膜炎布兰汉氏球菌 ( Branhame

9、llacatarrhalis )、环丝菌 ( Brochothrix )、坚强芽孢杆菌 (Bacillus firmus )，其中假单胞菌属是最有效的降解菌 19,20。细菌在初级代谢 阶段降解木质素，在生长的对数期和稳定期合成木质素降解酶21 。细菌在降解过程中主要是使木质素一定程度上发生变性 , 成为水溶性的聚合物，很少将木质素矿化为CO2。另外，细菌在木质素降解过程中主要起着间接的作用，即细菌与真菌协同作用使木质素易于受到真菌的攻击，且可去除对腐朽真菌有毒性的物质 19。放线菌类是公认降解能力较强的细菌，降解木质素的放线菌主要有链霉菌属(Streptomyces)22,23 、高温放线菌

10、属 (Thermoactinomyces) 、节杆菌属 (Arthrobacter ) 、小单孢菌属 ( Micromonospora ) 、诺卡氏菌属 ( Nocardia ) 和褐色高温单胞菌 (Thermonospora fusca)。Tuomela M 等 20研究表明，链霉菌属的丝状细菌降 解木质素最高可达 20，在木质素降解中起主要作用。近年来的研究也发现了一些非常规降解菌种,如张金萍等 24发现的灵芝属某些菌种对木质素都有较好的降解能力。 RC Bonugli-Santos25研究发现三株海洋真菌在不同碳源及盐浓度下可以产生不同酶活力的木 质素酶，其中 M. racemosu-s

11、 CBMAI 847 产生的 LiP 、MnP、 Lac的酶活力最高值分别达 75376.34、 4484.30、 898.15 UL-1。 关于土壤低等真菌降解木质素的研究报道也时有出现, 主要有产黄青霉 (Penicilliumchrysogenum) 、镰刀霉 (Fusarium proliferatum )、简青霉( Penicillium simplicissimum )等 26。木质素微生物降解酶系的理化性质及作用机理木质素的微生物降解过程中发生的主要化学变化有侧链氧化、去甲基化、去甲氧基化、芳环开环等。 木质素高聚物在微生物 /酶的作用下，结构单元间连接键的断裂并对侧链进行一定的

12、修饰，使原来的高分子化合物分解为低分子物质。 木质素降解酶系主要包括 3种酶：锰过氧化物酶 (Manganese Perxidases MnP) 、 木质素过氧化物酶 (Lignin Peroxidases LiP) 和漆酶 (Laccase)。另外，芳醇氧化酶 (Aryl-alcoholoxidase AAO) 、乙二醛氧化酶 (Gyoxaloxidase GLOX) 、葡萄糖氧化酶 (gucose-l-oxidase GIO) 、酚氧化酶、过氧化氢 酶、新阿魏酰酯酶、对香豆酰酯酶也与木质素的降解密切相关27 。锰过氧化物酶( MnPs)1984年 Masaaki等首次从白腐真菌(Phane

13、roehaete Chrysosporium )木质素裂解培养液中分离检测到MnPs 。 MnPs是一种血红素蛋白，含有多种同工酶，分子量约为3262.5 KDa之间，大多数纯化后的 MnPs分子量都在 45 kD 左右，最适 pH为47，最适温度为 4060 28-30。MnPs由一个铁血红素基和一个 Mn2+构成 了活性中心，另外还有两个起稳定结构作用的Ca2+，其分子中有十条长的蛋白质单链，一条短的单链，在温度大于 40时开始失活，最佳稳定 pH值是 4.8。MnPs的产生菌主要是一些白腐真菌 31，多属担子菌亚门， 无隔担子菌亚纲，无褶菌目的多孔菌科。在 Mn2+和 H202存在时，

14、MnPs能氧化分解芳香环多聚体，被认为是 木质素降解的关键酶之一 32,33。MnPs在过氧化氢存在时可氧化酚型木质素及木质素模型物，即由Mn 2+及一种螯合物催化木质素发生降解， Mn2+被氧化成 Mn 3+，Mn3+反过来又氧化酚型化合物， 并保护 MnPs不受活性 自由基的破坏 34。R-OHFig.1 MnP catalytic reaction mechanism木质素过氧化物酶( LiP )1990年Kent和Ming 等首次从白腐真菌属的黄孢原毛平革菌(Phanerochete chrysosporium) 的限制性培养基中发现了 LiP ，在木质素降解中起关键性作用。 LiP也

15、是一种血红素蛋白，它的活性中心与MnP近似，但却不含 Mn 2+。其分子中也有十条长的蛋白质单链,一条短的单链，其氨基酸顺序有43%与MnP相同。Asgher36和Hirai 37等研究表明 LiP的糖基化亚铁血红素蛋白质通常以多种复合的形式产生，即含有多种同工酶，分子质量一般在 3750 KD 。经过纯化后的 LiP的分子质量在 40 KD 左右，等电点为 3.5左右，最适酶活 温度为 3555，最适 pH为2.05.030,38,39。LiP氧化还原电位为 1.5 V，在 H202存在时， LiP能氧化分解芳香 环多聚体 , 通过催化木质素侧链的 C一 C链使其断裂从而降解木质素，被认为是

16、木质素降解的关键酶之一。LiP 的产生菌在自然界分布相当广泛，许多腐朽木材的白腐菌、褐腐菌都可以产生。LiP 能催化木质素中富含电子的酚型或非酚型芳香化合物发生氧化，产生活性基团， 然后发生一系列的非酶促裂解反应，实现对底物的部分氧化或彻底的氧化 40 ，具体反应机制如下 41:图2 LiP 的催化循环Fig.2 Catalytic cycle of LiPLiP化合物 I携带H 202的两个氧化当量，一个为 Fe4+-O中心，另一个形成卟啉的阳离子自由基。基质R被化合物 I 氧化成芳基阳离子自由基，然后通过一系列的非酶反应生成最终的产物。漆酶( Lac)1883年，日本学者 Yoshi首次从

17、日本紫胶漆树 (Rhus vemieittua) 漆液中发现一种可催化漆固化过程的蛋 白质， 1895年， Bertrand 将这种蛋白质命名为漆酶 (Laccase)，随后人们研究发现它广泛存在于植物、昆虫 和高等真菌中， 甚至一些动物肾脏 (如猪肾) 和血清中也发现了漆酶。 漆酶按其来源主要分为漆树漆酶 (Rhus Laccase)和真菌漆酶( Fungal Laccase)两大类。在真菌中，漆酶广泛存在于担子菌(Baidimycetes)、多孔菌 ( Polyporus )、子囊菌( Asomycetes)、脉孢菌( Neurospora )和柄孢壳菌( Podospora )等中。有文

18、献 42 报道，单独培养黄孢原毛平革菌( P. chrysosporium )很难检测到漆酶活性。 Lac是一种含铜的多酚氧化酶， 属蓝色多铜氧化酶家族， 由肽链、 糖配基和 cu2+三部分组成，肽链一般由 500 550个氨基酸组成， 糖配基主 要包括氨基己糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖和阿拉伯糖，其分子量在5890 KDa 之间43,44。对于不同白腐真菌，漆酶的最适 pH变化范围为 210，最适的温度范围为 4065 43-46 。同一漆酶对不同底物作用 时，最适作用 pH 也有差异 47。迄今已有较耐高温真菌漆酶的报道， Marasmium quercophilus 所产漆酶在 7

19、5 条件下半衰期为 10 min48。漆酶催化反应不需要过氧化氢参与，一般认为漆酶催化反应是木质素降解的启 动步骤 49。漆酶可在仅有碳源存在的条件下由菌体分泌，并且具有780 mV氧化还原电位，在没有 H202和其他次级代谢产物的存在下可催化有机污染物的氧化42。Lac所催化的主要是氧化反应， 表现在底物自由基的生成和4个铜离子的协同作用，主要攻击木质素中的苯酚结构单元，在反应中，苯酚被氧化产生含苯氧基自由基的活性基团，可导致芳香基的裂解。 Lac同时具有催化解聚和聚合木质素的作用，因此单独存在时不能降解木质素，只有同时存在 MnP 等其他酶，避免反应产物重新聚合时，才有较高的木质素降解效率

20、。对其作用机理，目前比较广泛接受的是其催化多酚化物如氢醌，此过程须经过四次单电子传递。首先，底物氢醌向漆 酶转移一个电子生成半醌 -氧自由基中间体，而后两分子半醌生成一分子氢醌和一分子苯醌，氧自由基中间体还能转变成碳自由基中间体，它们可以相互结合或相互偶联。因此，在菌体内，漆酶与其它氧化木质素酶系协同降解木质素。在体外实验中，木质素单体在Laccase/O2条件下会发生聚合反应。 O2存在条件下，还原态漆酶被氧化，O2被还原成水 , 漆酶催化底物氧化和对02的还原实现过程可用下式表示502+（氧 化态）Cu2+Cu Cu42+2e底物分子内+ + 4+ 2+ 2+ 2+Cu+ Cu+ Cu24

21、+Cu2+ Cu2+ Cu22+电 子转 移 22e +Cu+ 底物还C原u2态+2+Cu2+O2,2H-H O2 , 快Cu2+2+Cu（ Cu2 O ）3+ 2H-H O2+,慢Cu2+ Cu2+ Cu24+（ 氧 化 态 ） 图3 Lac 的催化作用过程Fig.3 Catalytic action process of Lac白腐真菌木质素降解酶系的降解机理 白腐真菌以其独特的生理生化机制和强大的降解代谢能力而成为木质素降解研究的模式菌株，是已知 的唯一能在纯系培养中有效地将木质素降解为CO2和H2O的一类微生物 51。近年来， 有研究报道白腐菌对木质素的降解主要依靠特殊的胞外水解酶和氧

22、化酶的作用52-57 。白腐菌对木质素的降解过程复杂，但至少存在三种方式的降解反应 56 ：(1) 丙烷基侧链 C-C链的氧化断裂形成苯甲酸； (2)-芳醚键和侧链结构的改变： (3)芳香环通过氧化开环发生降解。白腐菌对木质素的降解是以自由基为基础的链反应过程58。首先，在有氧条件下， H2O2激活过氧化物酶，过氧化物酶触发生成许多高度反应性的自由基活性中间体，然后以链反 应的方式继续产生多种自由基， 导致各种连接键的断裂， 使木质素解聚成各种低分子量片段， 其中小于 l KD 的占多数，再彻底的氧化成为 CO259 。 这种自由基反应是高度非特异性和无立体选择性的，即白腐真菌与 被降解底物并

23、非酶与底物的一一对应关系，而是与一类乃至多类底物的关系60 。木质素降解酶的活性调控影响木质素降解酶产生的外界因素主要有：碳源、氮源、诱导剂和表面活性剂、微量元素等。C和 N这两种重要的营养调控着真菌木质素降解酶的合成和活性。C源和 N源的种类以及 C N比是影响木质素降解酶含量的主要因素。因此，近年来已成为被广泛研究的热点 61-63。诱导物不仅能诱导木质素降解酶的产生，还起到分散剂和保护剂的作用，研究较多的是藜芦醇（VA ）。表面活性剂主要是提高细胞膜的渗透性，菌种不同，最适的表面活性剂也不同，研究最多的是吐温80。同时，关于其他诱导剂和表面活性剂的研究也有很多 64,65。已有研究表明在

24、培养体系中加入苯甲醇，可以显著提高木质素酶的活性61。一般而言，重金属对酶主要起抑制作用。然而最新研究发现，重金属如Zn和Cu在低浓度下能够提高真菌的 LiP和 MnP活性，而Mn 和Cu更是分别直接参与了 MnP和Lac的催化循环，是木质素降解酶所需的主要微量元素。因此，重金 属对木质素降解酶的诱导作用受到普遍关注66,67。培养温度、氧浓度、通气状况、 pH值、代谢产物乃至环境湿度等，也是影响木质素降解酶产生的因素。培养温度和pH值对 Lac的影响因具体菌种而异，不同的菌种有不同的适宜培养温度和 pH 值。4 结语利用微生物降解木质素是一个复杂的生物化学作用过程，不同酶活性的高低还可能与它

25、们在木质素降 解中的作用大小和不同降解阶段中的作用顺序有关。 其中， 酶系组成和生物化学反应机制尚有许多未知数， 因此仍需对其催化机制和木质素降解酶基因表达调控机制等进行综合研究。目前，生物降解多采用混合发 酵68-74，由于菌种彼此间木质素降解酶系、生活史长短、营养需求及生长因子等不同的生物学特性互补， 在分泌木质素降解酶系上表现了较好的种属互惠性，使混合发酵降解率以及酶活显著高于单一菌种，达到 高降解的目的。因此，采用分子生物学方法构建具有木质素降解基因的工程菌 75-78，以及筛选出更加高效 降解木质素的复合菌系均是未来的发展方向。相信在不久的将来,随着对木质素酶催化机理认识的加深，以及

26、应用分子生物学技术对木质素降解酶相关基因结构、表达调控机理等深入研究 , 木质素的生物降解将取 得重大突破；同时，随着科学技术的发展和研究的不断深入，开发出高效降解木质素的复合菌剂，对于解 决能源紧张、粮食短缺及环境污染等难题也同样具有重要的指导作用。参考文献蒋挺大 . 木质素 （第二版 ） M. 北京: 化学工业出版社 , 2008, 116.Zhang G M（ 张桂梅 ）, Liao S Q（ 廖双泉 ）, Lin H L（ 蔺海兰 ）, et al. Progress in studying the extraction and comprehensive utilization of

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